鴨精液冷凍程序優(yōu)化及抗氧化效果研究

水禽養(yǎng)殖作為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要支柱，在滿足市場(chǎng)需求、促進(jìn)品種改良及生物多樣性保護(hù)中扮演關(guān)鍵角色。隨著育種技術(shù)的發(fā)展，提高水禽繁殖效率已成為研究焦點(diǎn)。精液冷凍保存技術(shù)是遺傳資源保護(hù)與人工授精的核心手段，在哺乳動(dòng)物中已得到廣泛應(yīng)用[1-3]，但在家禽領(lǐng)域仍面臨挑戰(zhàn)。禽類精子因其獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生化特性，對(duì)溫度變化極為敏感，冷凍過程中易發(fā)生質(zhì)膜破裂、頂體損傷及氧化應(yīng)激，導(dǎo)致活率與受精能力大幅下降[4]。因此，優(yōu)化禽類精液冷凍程序?qū)ν黄萍夹g(shù)瓶頸至關(guān)重要。

與哺乳動(dòng)物相比，鴨精子呈細(xì)長(zhǎng)形態(tài)，頭部約5μm ，尾部長(zhǎng)達(dá) 50μm ，細(xì)胞質(zhì)含量極少，質(zhì)膜富含多不飽和脂肪酸[5-6]。這種結(jié)構(gòu)雖有利于精子在雌性生殖道內(nèi)的運(yùn)動(dòng)，卻使其在冷凍過程中極易受到物理和生化損傷。物理?yè)p傷主要源于細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，尤其是在 -15°C 至 -60^°C 的“冰晶危險(xiǎn)區(qū)”，冰晶的機(jī)械應(yīng)力可直接導(dǎo)致質(zhì)膜破裂和頂體結(jié)構(gòu)損傷[7]。生化損傷則與冷凍誘發(fā)的氧化應(yīng)激密切相關(guān)。在低溫環(huán)境中，線粒體呼吸鏈功能失調(diào)會(huì)導(dǎo)致超氧自由基（ ）和過氧化氫中 .H₂O₂ ）等活性氧類物質(zhì)過量生成。當(dāng)這些氧化產(chǎn)物的濃度超過細(xì)胞自身抗氧化能力的調(diào)節(jié)范圍時(shí)，會(huì)誘發(fā)一系列氧化損傷，包括生物膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、遺傳物質(zhì)氧化性斷裂以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變等病理變化[8-9]。此外，這個(gè)過程還會(huì)導(dǎo)致精子能量代謝障礙、ATP合成減少和精子運(yùn)動(dòng)能力喪失[10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，與新鮮精子相比，精子在經(jīng)過冷凍處理后，其脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物丙二醛（MDA）的含量顯著升高，超氧化物歧化酶（SOD）的活性顯著下降，表明氧化應(yīng)激是精子在冷凍過程中導(dǎo)致其受損的關(guān)鍵因素[11-12]

盡管有研究通過添加外源抗氧化劑，如白藜蘆醇、硒納米顆粒等緩解了氧化損傷，但冷凍程序本身的優(yōu)化仍被忽視。冷凍速率作為關(guān)鍵參數(shù)，需在冰晶形成與滲透壓損傷之間取得平衡。快速降溫 （gt;50^°C/min） 雖然可以抑制細(xì)胞內(nèi)冰晶，但可能導(dǎo)致膜脂相變，而緩降溫 ：lt;10°C/min? 則延長(zhǎng)細(xì)胞暴露于高滲環(huán)境的時(shí)間，加劇ROS積累[9，13-14]。目前，針對(duì)雞精液的程序化冷凍研究已證實(shí)，多階段變溫策略例如初始緩降避免冷休克，后期速降減少冰晶可提升精子活率至 50% 以上[15]。然而，鴨精液的相關(guān)研究匱乏，現(xiàn)有文獻(xiàn)也多是沿用雞的精液冷凍方案。

基于此，本研究以金定鴨為模型，設(shè)計(jì)4種差異化冷凍程序（ [P1～P4） ，系統(tǒng)比較其對(duì)精子活力、活率、死亡率、抗氧化酶活性、脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物含量及總抗氧化能力的影響，旨在評(píng)估不同冷凍程序?qū)淤|(zhì)量及其抗氧化效果的影響，以期為鴨精液冷凍保存技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與分組

本研究選取由國(guó)家家養(yǎng)動(dòng)物種質(zhì)資源庫(kù)（2025年）提供的體質(zhì)量體況一致的43周齡健康金定公鴨25只，所有個(gè)體均通過人工按摩法進(jìn)行為期2周的訓(xùn)練，確?？煞€(wěn)定采集合格精液。訓(xùn)練期間，公鴨采用階梯式單籠飼養(yǎng)，按照蛋鴨營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼喂全價(jià)飼料，自由飲水。試驗(yàn)前將25只公鴨隨機(jī)分為新鮮精液對(duì)照組（C組）以及4種冷凍程序處理組（ P1～P4 組），每組各5只。

1. 2 精液稀釋液的配制

采用 BPSE（Beltsville Poultry Semen Ex^- tender）稀釋液，具體配制方法如下：精確稱量D果糖 _0.5g 、谷氨酸鈉 0.867g 、六水氯化鎂0.034g 、醋酸鈉 0.43g 、檸檬酸鈉 0.064g 、磷酸二氫鉀0.065g 、磷酸氫二鈉 0.4732g，N- 三甲基-2-氨基乙磺酸 0.195g ，使用 進(jìn)行梯度溶解。待溶質(zhì)完全解離后，將混合液定容至最終 100mL .調(diào)節(jié)溶液 pH 至 保存，備用。

1.3 精液采集與預(yù)處理

精液采集間隔為 ^48h ，共進(jìn)行3次重復(fù)操作。采精時(shí)間固定為每日上午9：00，采用背腹按摩與泄殖腔刺激相結(jié)合的方法獲取精液樣本。合格樣本需符合以下條件：呈乳白色且質(zhì)地均勻，無(wú)糞便或尿液污染。采集完成后，精液迅速轉(zhuǎn)移至15mL 無(wú)菌離心管中，輕柔混勻后與 4^°C 預(yù)冷的等體積BPSE稀釋液混合， 4^°C 平衡 ^1h 。

1.4冷凍保護(hù)劑平衡

參照陶志云等[16]的研究，選用 8% 二甲基乙酰胺（DMA）作為冷凍保護(hù)劑。將稀釋后的精液與等體積 8% DMA（ 92% 稀釋液 +8% DMA）混合， 4^°C 平衡 30min 。

1.5 精液冷凍與解凍

平衡后的精液分裝至 0.25mL 麥管，使用程序降溫儀（ThermoFisher，貨號(hào)TSCM17PV）執(zhí)行4種冷凍程序（表1）。程序完成后，麥管迅速轉(zhuǎn)移至液氮中，靜置保存 ¹h 。麥管解凍采用 水浴 30s ，隨后立即進(jìn)行精子活力檢測(cè)。對(duì)照組和4種冷凍程序處理組各隨機(jī)抽檢30個(gè)麥管，共檢測(cè)150個(gè)樣品。

表1冷凍程序參數(shù)

Table1 Parametersof freezing procedures

1. 6 精液品質(zhì)檢測(cè)

精子活力、活率和死亡率使用全自動(dòng)精子分析儀（南京松景天倫生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)MDO300A）檢測(cè)。

1.7 氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

取冷凍精液及新鮮精液樣本，測(cè)定以下指標(biāo)：總超氧化物歧化酶T-SOD活性、過氧化氫酶CAT活性、谷胱甘肽過氧化物酶GSH- ?Px 活性、

丙二醛MDA含量和總抗氧化能力T-AOC含量，以上指標(biāo)均使用南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒檢測(cè)，結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為蛋白濃度。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

以“平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差”表示數(shù)據(jù)，使用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），并通過TukeyHSD法檢驗(yàn)組間差異，顯著性水平設(shè)為Plt;0.05 。圖表繪制使用GraphPad Prism9.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 精液品質(zhì)分析

2.1.1精子活率與死亡率對(duì)比如圖1所示，對(duì)照組精子的平均活率為 97.4% ，與4種冷凍程序處理組相比均存在顯著差異；P4組的平均精子活率在4種冷凍程序處理組中最高，為 71.41% ;P2組的平均精子活率在4種冷凍程序處理組中最低，為 34.28% ;P1組和P3組的平均精子活率分別為 65.56% 和 53.41% 。P4組的平均精子死亡率最低，為 28.59% ;P2組的平均精子死亡率最高，為 65.72% 。

圖1不同冷凍程序下的精子活率與死亡率

2.1.2精子活力分析如圖2所示，對(duì)照組精子的平均活力為 95.2% ，與4種冷凍程序處理組相比均存在顯著差異；P4組的精子平均活力在4種冷凍程序處理組中最高，為 46.99% ;P2組的精子平均活力在4種冷凍程序處理組中最低，為22.69% ；P1組和P3組的精子平均活率分別為31.76% 和 51.73% 。

圖2 不同冷凍程序下的精子活力Fig. 2 Sperm motilityunder differentfreezing protocols

2.2 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

2.2.1超氧化物歧化酶（SOD）由圖3可知，與對(duì)照組相比，P2組的SOD活性顯著下降，P4組的SOD活性沒有顯著差異。

2.2.2過氧化氫酶（CAT）與對(duì)照組相比，P2組的CAT活性顯著下降，P4組的CAT活性沒有顯著改變；與P2組相比，P4組的CAT活性顯著上升（圖3）。

2.2.3谷胱甘肽過氧化物酶（ GSH-Px ）與對(duì)照組相比，P2組和P4組的GSH- ?Px 活性均顯著下降，但P4組的 GSH-Px 活性顯著高于P2組（圖3）。

2.2.4MDA和T-AOC含量MDA是脂質(zhì)過氧化的重要標(biāo)志物，其含量變化可反映細(xì)胞氧化損傷程度。本研究結(jié)果顯示（圖4），相較于對(duì)照組，P2組的MDA含量顯著上升，而P4組則無(wú)顯著變化；P2組和P4組的T-AOC含量均顯著下降，但P4組的下降趨勢(shì)低于P2組。

3討論

本研究系統(tǒng)比較了4種差異化冷凍程序?qū)鸲喚踊盥省⑺劳雎省⒒盍把趸瘧?yīng)激指標(biāo)的影響，結(jié)果證實(shí)，程序P4在維持精子活率與活力方面表現(xiàn)最優(yōu)，而程序P2則導(dǎo)致精子活率與活力顯著下降。結(jié)合抗氧化酶活性與脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物的變化，進(jìn)一步闡明了不同冷凍程序?qū)淤|(zhì)量和抗氧化效果的差異性調(diào)控，為鴨精液冷凍保存技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化提供了理論依據(jù)。

冷凍過程中，精子受到的物理與生化損傷是導(dǎo)致其活率下降的核心因素[17]。程序P4采用兩階段降溫策略，初始以 7^°C/min 緩降至 -35^°C .隨后以 60^°C/min 快速降溫至 -140°C 。該方案通過平衡冰晶生成與滲透壓損傷，實(shí)現(xiàn)了優(yōu)化效果。在初始緩降階段，細(xì)胞逐步脫水，減少內(nèi)部自由水含量，進(jìn)而有效地抑制冰晶產(chǎn)生；隨后速降階段則縮短了精子暴露于高滲環(huán)境的時(shí)間，降低ROS累積的風(fēng)險(xiǎn)，這與雞精液冷凍研究中多階段變溫策略的優(yōu)化思路一致[18]。程序P2采用多階段緩降，盡管旨在避免冷休克，但因低溫暴露時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致線粒體功能障礙加劇。線粒體作為ROS的主要來源，其膜電位缺失會(huì)發(fā)生電子傳遞鏈泄漏，引起 的積累[19]。本研究結(jié)果表明，P2組MDA含量顯著升高，抗氧化酶SOD、CAT及GSH- .Px 活性顯著下降，表明氧化應(yīng)激是其精子損傷的主要驅(qū)動(dòng)因素。相比之下，P4組MDA含量未顯著變化，且CAT活性顯著高于P2組，提示其降溫策略有效緩解了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。冷凍保護(hù)劑DMA的協(xié)同作用亦不可忽視。DMA作為滲透性保護(hù)劑，通過降低冰點(diǎn)與穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)減少冷凍損傷[20]。然而，其保護(hù)效果高度依賴降溫速率的匹配。本研究中程序P4的快速終末降溫可能通過縮短DMA與精子的接觸時(shí)間，減少其潛在毒性對(duì)膜脂的干擾，而程序P2的緩降過程可能導(dǎo)致DMA在細(xì)胞內(nèi)過度滲透，引發(fā)滲透壓失衡[21]。此外，盡管采用了相似的緩降方案，但P2組精子活率顯著低于雞類研究中的結(jié)果，這可能是因?yàn)轼喚淤|(zhì)膜富含多不飽和脂肪酸，對(duì)ROS攻擊更為敏感。

圖3不同冷凍程序下的精子抗氧化酶活性

Fig.3Effects of different freezing protocols on sperm antioxidant enzyme activity

圖4不同冷凍程序下的精子脂質(zhì)過氧化物含量和總抗氧化能力

Fig.4Lipid peroxide content and total antioxidant capacity of sperm under different freezing protoc（

抗氧化系統(tǒng)在冷凍過程中的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)精子存活至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，P4組SOD活性與新鮮精液無(wú)顯著差異，表明該冷凍程序有效抑制了 O₂^- 的生成；而CAT活性顯著高于P2組，則說明 H₂O₂ 的清除能力得以保留。這一結(jié)果與SOD-CAT級(jí)聯(lián)反應(yīng)的生理功能吻合，SOD將 轉(zhuǎn)化為 H₂O₂ ，CAT進(jìn)一步將其分解為無(wú)害的水和氧氣。然而，GSH .Px 活性在P4組仍顯著低于對(duì)照組，提示谷胱甘肽系統(tǒng)在冷凍過程中可能難以完全恢復(fù)。谷胱甘肽作為重要的非酶抗氧化劑，其再生依賴NADPH的供應(yīng)，而冷凍導(dǎo)致的線粒體功能障礙可能限制了這一途徑的效能[25]，未來可考慮在冷凍稀釋液中添加外源谷胱甘肽，以彌補(bǔ)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的不足。

綜上所述，本研究證實(shí)冷凍程序通過調(diào)控氧化應(yīng)激途徑顯著影響金定鴨精子質(zhì)量，其中程序P4因其優(yōu)化的降溫速率與階段性策略，在抑制ROS生成與維持抗氧化酶活性方面表現(xiàn)突出。這一發(fā)現(xiàn)為鴨精液冷凍保存技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化提供了參考，助力推動(dòng)水禽遺傳資源保護(hù)與人工授精技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

4結(jié)論

本研究評(píng)估了4種冷凍程序（ P1～P4 對(duì)金定鴨精子質(zhì)量及其抗氧化效果的影響。程序 P4 （7^°C/min 緩降至一 ，隨后 60^°C/min 速降至 -140^°C ）效果最佳，顯著提升精子質(zhì)量，其兩階段降溫策略有效減少ROS積累，維持線粒體膜電位及抗氧化酶活性，緩解脂質(zhì)過氧化損傷。研究證實(shí)，P4通過調(diào)控氧化應(yīng)激途徑優(yōu)化精液冷凍效果，為鴨精液冷凍保存標(biāo)準(zhǔn)化提供了理論依據(jù)。

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Optimization of Cryopreservation Protocols and Antioxidant Efficacy in Duck Semen

GU Haotian1 ，WANG Zhicheng1 ，LIU Hongxiang1 ，SONG Weitao1，TAO Zhiyun1 ， ZENG Tao2 ，GENG Mingyang2，ZHANG Shuangjie1 ，XU Wenjuan1 ， WANG Yifei1 ，LI Huifang1 and ZHU Chunhong1 （1.Jiangsu Institute of Poultry Science，Yangzhou Jiangsu 225125，China；2.Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 31ooo9，China；3.Yili Kazakh Autonomous Prefecture Livestock Station/Yili Kazakh Autonomous Prefecture Institute of Animal Science），Yili Xinjiang 835ooo，China）

AbstractAs a pivotal technique for genetic resource preservation and artificial breeding in waterfowl， sperm cryopreservation faces challenges due to the unique morphological and biochemical characteristics of avian spermatozoa，which render them highly susceptible to oxidative stress-induced motility decline during freezing.Using the Jinding duck as a model，this study systematically evaluated theeffects of four distinct cryopreservation protocols （ （Pl-P4） on sperm quality and oxidative stress responses. A programmable freezer was used to execute multi-stage temperature modulation strategies， with sperm parameters quantified via automated sperm analysis and oxidative stress biomarkers assessed. The results demonstrated that Protocol P4—featuring an initial slow cooling phase （7°C/min to -35°C ）followedby rapid freezing （60°/min to -140° ）—achieved superior post-thaw outcomes：sperm viability reached 71. 41% ，mortality decreased to 28.59% ， and progressive motility maintained at 46.99% ，all significantly better than those in other protocols.In contrast，Protocol P2 exhibited the poorest performance （viability： 34. 28% ;mortality： 65.72% ; motility ： 22.69% ）. Antioxidant profiling revealed that P4-maintained superoxide dismutase （SOD） activity at levels comparable to fresh semen，while catalase （CAT） activity was significantly higher than that in P2.Notably， malondialdehyde（MDA） levels in P4 showed no significant elevation，whereas P2 demonstrated marked reductions in SOD，CAT，and total antioxidant capacity （T-AOC），along with significant MDA accumulation.Mechanistically，the biphasic cooling strategy of P4 optimized the balance between cellular dehydration and ice crystal inhibition while minimizing the duration of hyperosmotic exposure， thereby effectively reducing reactive oxygen species（ROS） generation and oxidative damage. Conversely，P2's multi-stage gradual cooling prolonged hypothermic stress，exacerbating mitochondrial dysfunction and oxidative stress amplification. This study demonstrates that cryopreservation protocols directly affect duck sperm quality by modulating oxidative stress，providing theoretical support for the standardization of avian semen cryopreservation technologies in genetic conservation programs.

Key WordsJinding duck; Semen cryopreservation protocol; Sperm quality; Oxidative stress； Lipid peroxidation

Received 2025-02-14 Returned 2025-03-18

Foundation item National Key Ramp;D Program of China （No.2022YFD130010O）; Project for the Revitalization of the Seed Industry in Jiangsu Province （No. JBGS（2O21）[O3O]）； Yangzhou Natural Science Foundation （No. YZ2023167）； Yangzhou Modern Agriculture Development Program （No. YZ2022o5O）；“Tianchi Elite Talent”Recruitment Fund.

First authorGU Haotian，male，master，research intern. Research area：protection and innovative utilization of poultry genetic resources.E-mail：guhaotianl998@163.com

Corresponding authorZHU Chunhong，female，Ph.D，research felow.Research area： evaluation and protection of poultry genetic resources. E-mail： zhuch_1304428@126.com

（責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）