木堿蓬磷酸乙醇胺甲基轉移酶基因SdNMT的原核表達及分離純化

磷酸乙醇胺甲基轉移酶（phosphoethanolamineN-methyltransferase，PEAMT，EC2.1.1.103）是細胞質中的親水性單體酶[1-2]。植物PEAMT基因普遍包含2個不同的S-腺苷甲硫氨酸依賴的甲基轉移酶催化活性結構域，即N-端結構域（MT1）和C-端結構域（MT2）[1-3]。每個結構域包含4個保守基序（分別為基序I、基序p-I、基序Ⅱ、基序Ⅲ），這4個基序起主要的催化作用[4-6]。PEAMT的主要作用是將磷酸乙醇胺（phos-phoethanolamine，P-EA）通過三次甲基化生成磷酸膽堿（phosphocholine，P-Cho）[3，7-9]，P-Cho是植物生長發育的重要代謝產物，是植物細胞膜的主要脂質組分磷脂酰膽堿（Phosphati-dylcholine，PC）的合成前體[10]。模式植物擬南芥中3個拷貝的PEAMT，即PEAMT1（NMT1/PMT1，At3g18000），PEAMT2（NMT2/PMT2，At1g48600 ）和PEAMT3（NMT3/PMT3，At1g73600）敲除研究結果顯示，3個基因的敲除阻止了磷脂酰膽堿PC的生物合成并導致幼苗出現死亡表型，表明這3個基因的催化反應是P-Cho生物合成的必要條件，對植物的胚后生長至關重要[11]。He等[12]利用T-DNA插人突變體、基因編輯等位基因和互補系驗證擬南芥PMT1在鹽脅迫耐受性中的作用，結果發現PMT1通過ABA信號平衡ROS的產生和分布，參與鹽脅迫條件下初生根伸長和根發育。不同PEAMT雙突變體研究發現，nmtlnmt3雙突變體植株矮化發育緩慢且大部分不育、根發育異常，P-Cho含量急劇下降，NMT1和NMT3在催化和調節PC穩態以及植物生長和繁殖中起著重要作用[13-15]

此外，PC在磷酸酶D的水解作用下生成膽堿（choline，Cho）和磷脂酸（phosphatidicacid，PA）[1]。在一些植物葉綠體基質中，Cho 經膽堿單加氧酶（choline monooxy genase，CMO）和甜菜醛堿脫氫酶（bataine-aldehydedehydrogenase，BADH）催化合成甘氨酸甜菜堿（Glycinebetain，GB）。GB是鹽脅迫下禾本科和藜科植物中的主要相容化合物之一，有助于植物在高鹽條件下保持細胞的滲透平衡、保護膜結構和完整性，有效穩定酶結構，抵抗滲透脅迫[16]。PA不僅是植物細胞膜的組成部分，而且還是參與許多生理過程的脂質第二信使。PA在植物生長發育期間及逆境脅迫條件下快速積累，通過與靶蛋白結合并調節其活性和亞細胞定位，在各種信號傳導途徑中發揮重要作用[17-21]。因此，PEAMT基因的克隆及催化途徑的深人研究對于調控植物體內源Cho含量非常重要。

堿蓬屬植物生長在沙漠堿土等環境，適應惡劣環境能力強，在生長過程中能有效吸收并積累土壤中的鹽分，有助于土壤鹽堿度的改善[22-24]。 L木堿蓬（Suaedadendroides）是中國新疆特有分布的鹽生植物，是一種超旱生、多汁鹽柴類半灌木，具有較強的耐鹽、耐旱和耐瘠薄能力，在土表鹽分積聚的鹽堿地中能正常生長。在前期研究中，利用illumina測序技術，對鹽脅迫不同時間的木堿蓬幼苗進行了轉錄組測序，篩選獲得了在鹽脅迫下顯著上調表達的差異表達基因磷酸乙醇胺甲基轉移酶[25]。因此，本研究對木堿蓬中高鹽脅迫響應的磷酸乙醇胺甲基轉移酶基因SdNMT進行克隆，對其序列及結構進行分析。并在原核細胞中進行誘導表達和分離純化，最終獲得了高效表達的SdNMT蛋白，為SdNMT蛋白酶的催化活性研究奠定基礎。

1材料與方法

1. 1 菌株和質粒

基因克隆T載體pMDT19購于寶日醫生物技術有限公司，原核表達載體pET-28a，大腸桿菌（Escherichiacoli）TOP1O和BL21（DE3）購于生工生物工程（上海）。

1.2 主要試劑

植物組織RNA快速提取試劑盒（DP452）、質粒小提試劑盒（DP103）和瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒（DP209）、 2×Taq PCR預混試劑Ⅱ（KT211）及DNAmarker購于天根生化科技有限公司。反轉錄試劑盒（RR047A）、限制性內切酶NdeI和XhoI購于寶日醫生物技術有限公司；高保真DNA聚合酶 2× Phanta Max MasterMix購于南京諾唯贊生物科技有限公司（P515-01）;SYBR 熒光染料 TransStart ？ Green qPCRSuperMix（AQ601）購于北京全氏金生物技術有限公司；SDS-PAGE電泳試劑購于Sigmaaldrich公司；NiNTAbeads6FF重力層析柱購自常州天地人和生物科技有限公司。異丙基 ?β -D硫代半乳糖苷（Iospropyl- ?β -D-thiogalactoside，IPTG），磷酸鹽緩沖液（PBS， pH 7. 4） 和咪唑（imidazole）購于北京索萊寶有限公司。其余試劑均為國產分析純。引物合成及測序分別由上海生工和睿博興科（青島）生物公司完成。

1.3 試驗方法

1.3.1基因SdNMT擴增與序列分析木堿蓬葉片總RNA的提取參照植物組織RNA快速提取試劑盒（DP452）說明書進行，cDNA合成參照反轉錄試劑盒（RRO47A）說明書進行。根據木堿蓬mRNA測序注釋信息進行基因克隆，磷酸乙醇胺甲基轉移酶基因編碼序列的PCR擴增，上游引物 NF： 5^′ -ATGGCTGCCTCAGGAATGG- 3^′ .下游引物NR： 5^′ -TCACTTCTTCTTGGCAAC-GAAC- 3^′ 。擴增產物經 1% 的瓊脂糖凝膠檢測并切膠回收。利用在線工具expasy（http：//web.expasy.org/protparam/）預測編碼蛋白的分子質量、等電點（pI）、親水性平均系數（GRAV-TY）等；利用DNAMAN進行多重序列比對分析，利用MEGA11軟件繪制進化樹。

1.3.2基因SdNMT在鹽脅迫下的表達特征通過SYBRGreen Master Mix 在 ABI Prism7500系統檢測基因SdNMT在鹽脅迫下的表達特征，采用 2^-ΔΔCT 法進行數據分析。以低鹽（200mmol/LNaCl）和高鹽 （800mmol/LN JaCl）處理0.1，5，10，15d 的cDNA為模板，上游引物 Φ_qNF 5^′ -TTCCCACCACATTCATTGG ?3^′ ，下游引物qNR： 5^′ -CCCTGGCTTCAACCATTTC- 3^′ 。反應體系 20μL ，包含 10μL SYBR Green MasterMix，0.4μL 引物和 2μL cDNA。反應程序：95°C 預變性 30s ： 95^°C 變性 5s，60^°C 退火和延伸 34s，40 次循環。每個樣本進行3次重復。

1.3.3密碼子優化與原核表達載體構建為了提高目的蛋白在原核細胞中的表達效率，首先對基因SdNMT進行密碼子優化，然后通過基因合成的方式連接至原核表達載體 pET-28a ，添加NdeI和XhoI酶切位點，通過酶切和測序方法進行驗證，驗證正確的重組質粒導人大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，用于誘導表達試驗。

1.3.4蛋白誘導表達與可溶性分析將重組質粒pET28a-SdNMT菌液接種于LB液體培養基， 37°C.220r/min 培養至菌體 OD₆₀₀ 達到0.6時，設置4組誘導培養條件進行誘導，組合1：IPTG濃度 0.2mmol/L，15°C，220r/min 培養^16h ；組合2：IPTG濃度 r/min 培養 ^16h ；組合3：IPTG濃度 0.2mmol/L 37°C.220r/min 培養 ⁴h ；組合4：IPTG濃度1.0mmol/L，37‰ 培養 ⁴h 。 4^°C 710 000r/min 離心收集各誘導培養條件下的菌體，用Tris-NaCl緩沖液 （pH8.0） 重懸菌體，菌懸液超聲破碎，破碎菌體 4^°C，10000r/min 離心10min ，分離上清液和沉淀，分別制備樣品，利用12% SDS-PAGE電泳檢測上清和沉淀中目的蛋白的表達。

1.3.5蛋白分離純化將表達最優克隆菌株37^°C 擴大培養 ¹L 至 OD₆₀₀ 達到0.6時，加IPTG至終濃度為 1.0mmol/L，15^°C 誘導 ^16h 4°C，10000r/min 離心收集菌體，用Tris-NaCl緩沖液（ pH8.0） 重懸菌體。超聲破碎至菌液基本保持澄清后轉入離心管， 4^°C.12000r/min 離心 20min 。取上清，用 0.45μm 孔徑的水性濾膜過濾除雜，置于冰上備用或者 -20^°C 保存。按照NiNTAbeads6FF蛋白純化-瓊脂糖凝膠蛋白分離層析過濾說明書進行蛋白純化操作。收集流出組分、洗雜組分和洗脫組分以及原始樣品，利用12% SDS-PAGE電泳檢測純化效果。將含目的蛋白的洗脫組分加入超濾管中進行離心濃縮獲得目的蛋白。

2 結果與分析

2.1基因SdNMT克隆與序列分析

根據木堿蓬高鹽脅迫轉錄組數據中功能注釋為磷酸乙醇胺-N-甲基轉移酶（Cluster-688.49985）的顯著表達差異基因序列設計引物，克隆獲得其編碼序列（圖1）。通過對擴增序列測序分析，發現該基因的編碼序列長 1485bp ，編碼494個氨基酸。在線工具ExPASy預測結果顯示克隆基因編碼蛋白的分子質量為 56.56ku ，等電點為5.52，含有較多的賴氨酸（Lys） 8.9% 、亮氨酸（Leu） 8.7% 、谷氨酸 （Glu）8.3% 、甘氨酸（Gly）7.5% 和天冬氨酸 （Asp）7.3% 。親水性平均系數（GRAVTY）為一0.416，屬于親水性蛋白，且該蛋白不具有跨膜結構域。

如圖2-A所示，克隆基因的編碼蛋白含有雙甲基轉移酶結構域，即N-端（ 60～159 aa）和C-端（ 289～386 aa）均有1個S-腺苷-L-甲硫氨酸結合域依賴的甲基轉移酶催化活性結構域（Ado-Metbindingdomain）。如圖2-B所示，N-端的甲基轉移酶結構域包含4個保守的SAM結合基序，即motif I（ 60～68 aa）、post-I（ 81～85 aa）、motifⅡ （121～127 aa）和motifI（ 150～159 aa）；C-端的甲基轉移酶結構域同樣包含4個保守的SAM結合基序，即motif I（289～297 aa） Φ-post-I（311～ 315aa）-motifl I（350～356 aa）和motif III（377～386 aa）。說明克隆得到的目的基因為磷酸乙醇胺-N-甲基轉移酶基因，命名為SdNMT。

圖1木堿蓬SdNMT基因的編碼序列擴增 Fig.1Amplification of coding sequence of gene SdNMTinS.dendroides

氨基酸序列比對分析發現，不同植物中PEAMT的氨基酸序列高度同源，SdNMT與同屬遼寧堿蓬SIPEAMT（ABK42071.1）、日本堿蓬SjPEAMT（BAC57432.1）和海濱堿蓬SmPEAMT（AFW04224.1）的氨基酸序列一致性分別為 99.60%，99.19% 和 98.79% ；與藜科肉質化鹽生植物鹽角草SePEAMT（AEY75253.1）的氨基酸序列一致性為 90.89% ；與藜科藜麥CqPEAMT（XP_021715259.1）、濱藜AcPEAMT（AEY75253.1）、菠菜 SoPEAMT （AAF61950.1）、甜菜BvPEAMT（BAE07178.1）等的氨基酸序列一致性分別為86. 23% ，85． 83% ，85. 22% ，84.62% ；與甜土植物擬南芥AtNMT1（AAG41121.1）、AtNMT2（AAL36222.1）、煙草NtPEAMT（XP_016465720.1）、番茄LePEAMT（AAG59894.1）、水稻OsPEAMT（AAS57723.1）、小麥TaPEAMT（AAL40895.1）、玉米ZmPEAMT（AAV67950.1）、陸地棉GhPEAMT（KAG4207810.1）和馬鈴薯StPEAMT（KAH0705735.1）的氨基酸序列一致性分別為76. 11% ， 76.52% . 79.16% ， 78.95% . 73.00% ，70.94%，70.36%，79.44% 和 78.44% 。系統發育分析表明，植物 PEAMT 分為單子葉植物和雙子葉植物兩個進化分支，SdNMT與藜科堿蓬屬的遼寧堿蓬SIPEAMT（ABK42071.1）基因聚在同一進化分支，親緣關系最近（圖3）。

2.2基因SdNMT的表達特征

如圖4所示， 200mmol/L NaCl脅迫下，基因SdNMT的相對表達量隨處理時間延長逐漸升高； 800mmol/LNaCl 脅迫處理下，基因SdNMT的相對表達量隨處理時間延長逐漸下降。

圖5重組質粒pET28a-SdNMT的酶切鑒定 Fig.5Enzyme digestion identification of recombinant plasmid pET28a-SdNMT

2.3原核表達載體構建

為了提高蛋白的表達效率，首先對基因SdN-MT編碼的氨基酸序列進行密碼子優化，使基因在宿主細胞中的表達更加高效，從而提高蛋白的產量和質量。優化后密碼子適應指數（codonad-aptationindex，CAI）為0.95，GC含量 45% 。將優化后的序列通過基因合成方式連接至原核表達載體pET28a并添加酶切位點NdeI和XhoI，重組質粒pET28a-SdNMT經XbaI和XhoI雙酶切得到5172bp和1583bp的條帶（圖.5），與理論值大小相符。測序結果顯示，與優化后的基因序列一致，表明構建序列無突變和移碼，目的基因已正確插入到質粒pET-28a。

2.4蛋白表達鑒定和表達條件優化及可溶性分析

2.4.1重組蛋白的表達條件優化和可溶性分析

將重組質粒導人大腸桿菌BL21（DE3），經菌液PCR驗證正確后進行誘導表達。使用2個IPTG濃度、2個誘導溫度和2個誘導時間，設定4個組合進行誘導表達，SDS-PAGE電泳檢測結果如圖6所示。泳道 1～4 分別為組合1、組合2、組合3、組合4誘導樣，泳道5為未誘導樣，4個誘導組合均能誘導獲得與預期大小一致的蛋白條帶，且大量表達，說明目的蛋白在原核細胞中可以表達。進一步對不同誘導條件下的菌體進行超聲破碎，分別檢測沉淀和上清液中蛋白的表達。結果顯示，4組誘導條件下，沉淀和上清中均有目的蛋白表達；組合3和4條件下，沉淀中包含大量蛋白；而組合1和2誘導下，沉淀和上清液中均包含大量蛋白，說明目的蛋白可溶。組合 2（1.0mmol/L IPTG，15°C，220r/min 培養 ^16h 條件下，沉淀和上清中目的蛋白的表達量最高（泳道10），是目的蛋白的高效表達條件。

2.4.2蛋白分離純化將篩選出的表達最優克隆菌株 擴大培養 至 OD₆₀₀ 達到0.6，加1.0mmol/L 的IPTG， 15^°C 誘導 ^16h 。將誘導后的菌體超聲破碎，裂解獲得的上清經NiNTAbeads6FF重力柱進行純化；填充好的重力柱經PBS緩沖液（ Φ_pH/.4） 平衡后，用添加 30mmol/L 咪唑的PBS緩沖液 （pH7.4） 洗雜，去除非特異性吸附的雜蛋白；再用添加 300mmol/L 咪唑的PBS緩沖液 （pH7.4） 洗脫目的蛋白，收集洗脫液。分別取超聲破碎后的沉淀、上清和純化洗脫液進行SDS-PAGE檢測。結果如圖7-A所示，沉淀和上清液中均出現分子質量 左右的條帶，洗脫液中獲得大量表達的目的蛋白。將洗脫液加入超濾管中，離心濃縮，目的蛋白純化的最終樣如圖7-B所示，純化的蛋白在SDS-PAGE凝膠上為單一條帶，條帶大小與預測值相近，經IM-AGE丁軟件進行灰度分析，所得目標蛋白的純度可達 85% 。

3討論

圖6SdNMT蛋白誘導表達及可溶性分析

圖7SdNMT蛋白純化SDS-PAGE分析

本研究基于木堿蓬的轉錄組測序分析結果，篩選克隆獲得了鹽脅迫下顯著差異表達的PEAMT基因的編碼序列。該基因編碼的氨基酸數目與菠菜[26]和遼寧堿蓬 ^[27]PEAMT 基因相同、分子質量均在 左右，屬于可溶性蛋白。蛋白結構域分析表明，該酶含有兩個獨立的Ado-Met結合結構域，一個位于N-端（MT1），一個位于C-端（MT2），每個結構域包含4個保守基序（分別為基序I、基序 p-I 、基序Ⅱ、基序Ⅲ），在植物中高度保守。研究表明，植物PEAMT的MT1結構域的活性位點僅負責將p-EA轉化為磷酸單甲基乙醇胺（phosphomonomethyl-etha-nolamine，pMME），而MT2結構域的活性位點催化PMME到磷酸二甲基乙醇胺（phosphodimeth-yl-ethanolamine，pDME）和從pDME到P-Cho的后兩步甲基化反應[2，26]。底物特異性和酶動力學研究表明，PEAMT催化P-EA的3次連續甲基化形成P-Cho的是植物中合成PC和GB的關鍵前體，這兩種代謝產物在植物抵抗環境脅迫中發揮重要作用。研究發現， PEAMT 催化P-EA甲基化是植物中從頭合成PC的必要途徑，N-端的5個氨基酸對PC合成步驟的催化至關重要[15]。這些研究發現為探索更好地調整P-Cho和PC的合成以提高植物耐逆能力和適應環境條件的方法開辟了新途徑。因此，對來自不同植物的PEAMT催化途徑的深人研究，有助于識別底物特異性的決定因素，了解該酶在調節膽堿和磷脂酰膽堿途徑中的作用。

為進一步研究基因SdNMT的催化活性，本研究探索該基因在大腸桿菌細胞中的高效表達，構建了原核表達載體pET28a-SdNMT，實現了其在大腸桿菌BL21（DE3）中的可溶性表達。原核表達融合蛋白的結果受多種條件影響，不同蛋白的最佳誘導劑濃度、時間及溫度不同。重組蛋白 pET28a–SdNMT 在不同溫度、誘導時間及IPTG誘導濃度對目的蛋白誘導結果顯示，誘導時間和IPTG濃度對蛋白的表達影響較大，1.0mmol/LIPTG，15^°C.16h 誘導下蛋白的表達量最大。根據本試驗所優化的培養條件，利用NiNTAbeads6FF純化獲得純度 85% 以上的SdN-MT蛋白，可用于進一步研究該酶的活性，為深入研究蛋白酶的催化能力和基因生物學功能奠定基礎。

4結論

本研究從鹽生植物木堿蓬中克得到SdNMT基因的編碼區序列長 1 485bp ，編碼494個氨基酸，預測蛋白分子質量為 56.56ku ，理論等電點為5.52。構建原核表達載體pET28a-SdNMT并導人大腸桿菌BL2（DE3）進行表達，目的蛋白可溶，且IPTG 濃度1.0mmol/L，誘導溫度15°C ，誘導時間 ^16h 是蛋白的高效表達條件。利用NiNTAbeads6FF進行純化，最終獲得純度可達 85% 的目的蛋白。

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Prokaryotic Expression and Purification of SdNMT Gene Encoding Phosphoethanolamine Methyltransferase in Suaeda dendroides

MA Panpan1'2 ，ZHU Jianbo2 and SUN Guoqing？

（1.BiotechnologyResearch Institute，Xinjiang AcademyofAgriculturalandReclamationSciences，Shihezi Xinjiang32000， China；2.CollegeofLife Sciences，Shihezi University，Shihezi Xinjiang832oo3，China；3.Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing1ooo18，China）

AbstractPhosphoethanolamine methyltransferase is an S-adenosylmethionine dependent methyltransferase that catalyzes the three-step methylation of phosphoethanolamine to synthesize phosphatidylcholine，an essential membrane component and a precursor for glycine betaine biosynthesis.Transcriptome sequencing analysis of S. dendroides showed that the phosphoethanolamine methyltransferase gene was significantly up-regulated under salt stress. In this study，the coding sequence of the phosphoethanolamine methyltransferase gene， SdNMT ，from S.dendroides was amplified using the cDNA treated with 800mmol/L NaCl for 1 day. The prokaryotic expression vector pET28a-SdNMT was constructed and transformed into E .coli BL21 cells. The recombinant protein was induced using IPTG.The expression conditions were screened and optimized，and the solubility was analyzed. The target protein was purified through a nickel afinity chromatography column.The results showed that the coding region sequence length of SdNMT was 1 485 bp，encoding 494 amino acids.The predicted protein molecular mass was 56.56ku ，and the theoretical isoelectric point was 5.52.The recombinant protein was successfully expressed in a soluble form in E . coli . The optimal induction of protein SdNMTin E . coli was 1.0mmol/L IPTG for 16 hours at 15°C . The target protein，with a purity of 85% ， was successfully obtained in the miligram range using the Ni-NTA 6FF beads purification method， providing sufficient materials for enzyme activity assays. The findings of this study will serve as a foundation for further exploration of the role of SdNMT in plant growth，development，and response to environmental stresses.

Key words Suaeda dendroides ; SdNMT; Prokaryotic expression; Protein purification

Received 2024-11-27 Returned 2025-01-25

Foundation itemThe Young and Middle-aged Leaders in Scientific and Technological Innovation Foundation of Shihezi（No.2O22RCo3）；the Project of Innovation Team Building in Key Areas of XPCC（No. 2019CB008）.

First authorMA Panpan，female，associate research fellw. Research area：innovation and application of crop stress resistant germplasm resources. E-mail：mp20044681@163.com

Corresponding authorSUN Guoqing，male，research fellow. Research area：crop genetics and breeding. E-mail： sunguoqingO2@caas. cn

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）