利用SSR標(biāo)記鑒定不結(jié)球白菜春福種子純度

中圖分類(lèi)號(hào)：S634.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2025）08-161-05

Hybrid purity identification of Brassica campestris ssp. chiensis variety Chunfu by SsR marker

SUN Zhongwei'，LU Chenchen2，XUYoulian，LI Manman3，GUO Tao2，GAO Qihui2 （1.HenandtroleloentCoon;awrot Co.LD.，niicuralli Abstract：Currently，theassessmentofseedpurityinBrassicacampestrisprimarilyreliesonfieldidentificationetods. Thesemethods are notonly time-consuming and labor-intensive，butalso susceptible toenvironmental factors.To ensure thequalityofseedsentering themarketandto expeditethemarketpenetrationofChunfuseeds，thisstudydevelopedan eficientidentificationmethodfor Chunfuseeds bymolecular marker technology.TodevelopaneficientmethodforidentificationtheseedpurityofBrasicacampestris（syn.Brasicarapa）sp.chiensisvarietyChunfu，threeSSRprimers were selected from96SSRprimer pairs that exhibitedpolymorphism between the parental linesofChunfu.Among these，Rapa57demonstratedsuperior performance and deemedsuitable for purityidentification.TheRapa57 was selected to identify the seeds purity of Chunfu. Molecular detection matched field phenotypic identification with 1.9% deviation， the consistency was 98.1% .These results indicated that SSR marker can be applied to identify the purity of Brassica campestris. This methodapproach enhances identificationeficiency，exhibits excelentstabilityandaccuracy，alsoprovidesarobust scientific basis for seed production and quality control.

Keywords：Brassica campestris ssp.; Chunfu; Hybrid; Purity identification

不結(jié)球白菜[Brassicacampestris（syn.Brassicarapa）ssp.chiensis]，又稱(chēng)小白菜、膠菜、瓢兒菜、飄兒白、油菜，屬于十字花科蕓驀屬蕓驀種不結(jié)球白菜亞種。不結(jié)球白菜起源于中國(guó)，原產(chǎn)中國(guó)南方，在中國(guó)有悠久的栽培歷史，栽培十分普遍，主要產(chǎn)區(qū)為中國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)[1-2]。不結(jié)球白菜2022年種植面積約30萬(wàn) hm² ，年總產(chǎn)量約1800萬(wàn)t，在蔬菜周年供應(yīng)上具有重要地位[3。隨著雜種優(yōu)勢(shì)在育種中的應(yīng)用，不結(jié)球白菜的優(yōu)秀雜交種在市場(chǎng)中逐漸占據(jù)重要地位，其較強(qiáng)的抗病性和適應(yīng)性，使產(chǎn)量和品質(zhì)顯著提升[4。然而在制種過(guò)程中可能存在親本物理隔離不嚴(yán)格、自交不親和性較低、田間除雜不徹底、收獲過(guò)程中機(jī)械混雜等一系列問(wèn)題，導(dǎo)致種子純度下降，影響后續(xù)種植效果，甚至影響到企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。因此種子純度鑒定對(duì)優(yōu)異不結(jié)球白菜雜交種的生產(chǎn)和銷(xiāo)售具有重要意義。

目前種子純度的鑒定方法有田間鑒定、蛋白質(zhì)電泳和DNA分子標(biāo)記鑒定，由于受外界環(huán)境、鑒定周期、可重復(fù)性、準(zhǔn)確性等因素的影響，田間鑒定和蛋白質(zhì)電泳逐漸被淘汰，DNA分子標(biāo)記鑒定方法已成為檢測(cè)雜交種純度的主流方法。

鐘開(kāi)琴等利用SRAP標(biāo)記可快速準(zhǔn)確地鑒定出福春1號(hào)大白菜純度，馮健起等利用InDe1分子標(biāo)記可準(zhǔn)確鑒定出汴早九號(hào)大白菜種子純度，唐昊等利用KASP分子標(biāo)記完成了吉美8號(hào)大白菜雜交種的純度鑒定，魏小春等利用S單元開(kāi)發(fā)相關(guān)分子標(biāo)記也可對(duì)大白菜雜交種進(jìn)行純度鑒定。

1991年由Moore等率先創(chuàng)立了SSR分子標(biāo)記，一般有1～6個(gè)堿基的重復(fù)序列[]，堿基、堿基數(shù)目、堿基的重復(fù)次數(shù)在不同品種或基因型中發(fā)生不同的變異，進(jìn)而造成重復(fù)序列的多態(tài)性。SSR標(biāo)記具有極為豐富的多態(tài)性，且能夠提供遠(yuǎn)高于其他分子標(biāo)記的多態(tài)性]，具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性高、結(jié)果穩(wěn)定、呈共顯性等優(yōu)點(diǎn)[1]。利用SSR標(biāo)記可以完成大白菜遺傳多樣性分析[13-14]、大白菜抗根腫病基因標(biāo)記開(kāi)發(fā)[15-1、大白菜新型育種材料的創(chuàng)制[1]、大白菜相關(guān)基因的精細(xì)定位[18-19]等多方面研究。SSR分子標(biāo)記在大白菜雜交種子純度鑒定中也得到了廣泛應(yīng)用，和禹廷等[2利用SSR分子標(biāo)記可快速鑒定大白菜陜秋白3號(hào)種子純度，劉小愿等2利用SSR分子標(biāo)記完成了對(duì)陜秋白2號(hào)的純度鑒定，孟艷[2]利用3對(duì)SSR標(biāo)記快速準(zhǔn)確地鑒定了15雜85的種子純度。

雖然SSR分子標(biāo)記已在大白菜的各項(xiàng)研究中得到廣泛應(yīng)用，然而在不結(jié)球白菜的研究中鮮有報(bào)道。筆者利用SSR分子標(biāo)記對(duì)春福種子純度進(jìn)行分子水平的快速鑒定，以期在種子銷(xiāo)售前為客戶(hù)提供準(zhǔn)確的純度信息，確保種子質(zhì)量，提升市場(chǎng)信任度，保障種植效益，維護(hù)品牌聲譽(yù)。同時(shí)填補(bǔ)SSR分子標(biāo)記在不結(jié)球白菜種子純度鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用空白，推動(dòng)種業(yè)科技進(jìn)步。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為來(lái)源于無(wú)錫普威農(nóng)業(yè)科技有限公司（簡(jiǎn)稱(chēng)普威科技）的春福板葉小白菜，春福雜交種口感柔嫩，葉片寬，葉柄中長(zhǎng)，黃綠色，生長(zhǎng)快速，定植后20d左右即可采收。其母本葉色深，葉片寬，葉柄寬且短；父本葉色淺，葉片細(xì)長(zhǎng)，葉柄長(zhǎng)且窄，如圖1所示。春福雜交種及其父母本于2024年秋季定植于江蘇省無(wú)錫市的普威農(nóng)業(yè)科技有限公司的試驗(yàn)田中。

圖1春福及其父、母本Fig.1 Chunfu and parents

1.2 方法

1.2.1育苗及定植2024年9月1日穴盤(pán)育苗于育苗棚內(nèi)，待其出苗后編號(hào)，9月25日按編號(hào)順序定植于試驗(yàn)田中，試驗(yàn)田預(yù)先做好 1.5m 寬的高壟，為了能夠清晰觀察雜交種中的雜株，定植株行距均為 20cm ，生長(zhǎng)期秉持見(jiàn)干見(jiàn)濕、每10d薄施氮肥的管理方式進(jìn)行管理。

1.2.2DNA提取穴盤(pán)育苗10d后隨機(jī)采取春福及其父本、母本各10株，在每株幼嫩葉片上采取9mm² 大小葉片組織，獲得春福及其父本、母本的混合樣品，置于預(yù)先放置直徑 2mm 鋼珠的 2mL 離心管中，加入30s提取液[23]，放入研磨機(jī) 50Hz 研磨15s ，取上清液到新的 1.5mL 離心管中， 4^°C 冷藏備用。

穴盤(pán)育苗10d后按順序采取210株春福待測(cè)雜交種葉片，提取DNA備用。

1.2.3PCR體系及反應(yīng)程序筆者采取 10μL 反應(yīng)體系：模版 1μL ，引物 1μL ，magic mix 5μL 0.2mol?L^?1 Tris- HC1 3μL ；反應(yīng)程序采用Touch-down 程序： （1）95^°C 預(yù)變性 5min ： （2）94^°C 變性 45s，68～58^°C 退火，6個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降低2^°C ，每次 1min，72^°C 延伸 變性 30s 58～50^°C 退火，8個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降低 1^°C ，每次1min，72^°C 延伸 變性 30s，50^°C 退火30s 72^°C 延伸2s，該環(huán)節(jié)進(jìn)行20個(gè)循環(huán)；（5）72^°C 延伸 5min （6）10^°C 保溫。

1.2.4電泳及銀染利用 30% 聚丙烯酰胺凝膠對(duì)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，每孔上樣量 0.8μL ，180V，120mA，22W 電泳 2h ，待電泳結(jié)束后，取出凝膠于染色液 （1.2g?L^-1AgNO₃ 溶液）中搖晃染色2.5min ，倒出染色液，蒸餾水清洗凝膠，然后加入顯色液 （15g?L^-1NaOH+1.5%CH₂O） 搖晃至顯現(xiàn)微弱條帶，迅速倒出顯色液后用蒸餾水清洗，小心撈出置于燈箱上，記錄并拍照留存。

1.2.5引物篩選及驗(yàn)證利用普威農(nóng)業(yè)科技有限公司的96對(duì)小白菜SSR引物對(duì)春福及其父本、母本3個(gè)混池進(jìn)行篩選，以篩選出能夠特異性擴(kuò)增春福父本、母本的SSR引物，且要求雜交種同時(shí)具有其父本、母本的特異性條帶。然后選取春福父本、母本各2株，春福雜交種32株，利用篩選到的多態(tài)性SSR引物對(duì)該36份樣品進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)觀測(cè)其清晰度、可判讀性、特異性等方面來(lái)驗(yàn)證所獲得的多態(tài)性SSR引物的適用性，為批量對(duì)春福進(jìn)行純度鑒定做準(zhǔn)備。

1.2.6SSR分子標(biāo)記純度鑒定經(jīng)引物篩選驗(yàn)證后，利用篩選到的合適引物對(duì)春福雜交種群體進(jìn)行純度鑒定。分子純度 /%= 真實(shí)雜交種條帶數(shù)/總擴(kuò)增條帶數(shù) ×100 。

1.2.7田間純度鑒定田間純度鑒定于定植后的20d開(kāi)始觀察田間表現(xiàn)，5d觀察1次，共計(jì)觀察3次。田間純度 1%=1 （供檢單株數(shù)-雜株數(shù)）/供檢單株數(shù) ×100 。

2 結(jié)果與分析

2.1春福多態(tài)性引物篩選

利用96對(duì)引物對(duì)春福及其父本、母本混池進(jìn)行篩選，最終獲得3對(duì)在春福父本、母本間具有多態(tài)性、條帶清晰的SSR引物（表1）。

表13對(duì)多態(tài)性SSR引物信息

Table1 Threepolymorphic SSRprimer information

2.2 多態(tài)性引物驗(yàn)證

分別利用3對(duì)多態(tài)性引物對(duì)春福父本、母本各2個(gè)樣本及春福32個(gè)樣本進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rapa12擴(kuò)增條帶在目的條帶附近非特異擴(kuò)增較多，不易判讀；Rapa18的父本、母本位置較近，影響判讀結(jié)果；Rapa57條帶清晰，無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶，擴(kuò)增穩(wěn)定，父本、母本相對(duì)位置合適，易于判讀（圖2）。其中Rapa18和Rapa57兩對(duì)引物在雜交種的擴(kuò)增條帶中均檢測(cè)到1個(gè)母本條帶類(lèi)型的雜株，且為同一株，表明在鑒定雜株方面這兩對(duì)引物可以互相驗(yàn)證，但鑒于Rapa18條帶不易判讀，為此筆者采用Rapa57對(duì)春福種子進(jìn)行純度鑒定。

2.3 SSR分子標(biāo)記純度鑒定

利用Rapa57對(duì)春福210株 F₁ 單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，在F群體中發(fā)現(xiàn)共計(jì)有4個(gè)雜株，分別為P1的30號(hào)、P2的61號(hào)以及P3的28號(hào)和66號(hào)，4株雜株均表現(xiàn)為母本條帶類(lèi)型，其余206株為真正的雜交種。分子標(biāo)記鑒定春福雜交種純度為 98.1% 。

2.4 田間純度鑒定

經(jīng)過(guò)3次田間多人共同鑒定后未發(fā)現(xiàn)差異株，田間鑒定純度為 100% 。田間鑒定結(jié)果與SSR分子標(biāo)記Rapa57的鑒定結(jié)果相比，偏差為 1.9% ，吻合度為 98.1% 。

圖23對(duì)多態(tài)性SSR引物驗(yàn)證結(jié)果

Fig.2The verificationresult of threepairspolymorphic SSRprimers

圖3春福SSR標(biāo)記純度鑒定

Fig.3Purity identificationof Chunfu using the SSR marker

3 討論與結(jié)論

伴隨著時(shí)代的發(fā)展，育種方法越來(lái)越豐富，育種技術(shù)越來(lái)越成熟，雜交種新品種數(shù)量以爆發(fā)式增長(zhǎng)并逐漸占領(lǐng)市場(chǎng)，雜交種能夠有效提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要推動(dòng)力。然而，在生產(chǎn)過(guò)程中雜交種可能出現(xiàn)機(jī)械混雜、自交不親和系母本自交現(xiàn)象，進(jìn)而影響雜交種的純度。在生產(chǎn)實(shí)踐中，種子純度與種子質(zhì)量息息相關(guān)，不合格的種子純度直接影響種植表現(xiàn)和經(jīng)濟(jì)效益，甚至給農(nóng)戶(hù)造成不可挽回的損失[5]。

傳統(tǒng)的田間純度鑒定法方法簡(jiǎn)單、直觀、操作便捷，通常在當(dāng)年收到種子后適期播種，有時(shí)可能需要異地種植，一般通過(guò)子葉形態(tài)、苗期性狀等大田表現(xiàn)進(jìn)行觀察和判定，耗時(shí)較長(zhǎng)，且結(jié)果易受主觀判斷的影響，而且在結(jié)果未出來(lái)前存在不確定性，沒(méi)有辦法對(duì)種子進(jìn)行銷(xiāo)售，因而引入分子標(biāo)記技術(shù)成為提高種子純度鑒定效率和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵手段。

隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，尤其在2012年之后，SRAP、InDel、KASP、SSR、SCAR等分子標(biāo)記均在實(shí)踐中表明，分子標(biāo)記鑒定種子純度可以替代田間純度鑒定[5-7，20-21，24]。分子標(biāo)記純度鑒定在很大程度上提高了鑒定的效率和準(zhǔn)確性。共顯性標(biāo)記在純度鑒定中具有多態(tài)性好、易于判別、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定可靠、可重復(fù)性高等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此，目前已經(jīng)成為雜交種子純度鑒定的主流方法。相較于其他標(biāo)記，SSR標(biāo)記多態(tài)性更高，不需要通過(guò)重測(cè)序和大數(shù)據(jù)比對(duì)就可以利用，在大田作物及蔬菜作物中均有較為廣泛的應(yīng)用[25-26]。然而在十字花科作物中應(yīng)用較少，筆者利用SSR標(biāo)記填補(bǔ)了十字花科作物相關(guān)研究的空白。利用SSR分子標(biāo)記能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模、高效率的雜交種純度鑒定。不結(jié)球白菜春福早熟、葉片口感鮮嫩、產(chǎn)量高，但沒(méi)有高效的純度鑒定方法，將直接影響其市場(chǎng)推廣工作，因此，筆者針對(duì)不結(jié)球白菜春福的特定SSR標(biāo)記進(jìn)行優(yōu)化，確保其快速準(zhǔn)確地識(shí)別真?zhèn)坞s交種，為該品種的推廣提供了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)支撐。

在十字花科的相關(guān)分子純度鑒定中，馮健起等對(duì)大白菜汴早九號(hào)的分子鑒定結(jié)果和田間鑒定純度分別為 97.57% 和 98.26% ，其田間結(jié)果略高于分子鑒定結(jié)果，與本研究結(jié)果相似，這可能是由于田間雜株表現(xiàn)不明顯，難以判別，進(jìn)而影響了種子純度；和禹廷等[2在大白菜陜秋白3號(hào)的純度鑒定中，分子正交和反交雜交率分別為 96.7% 和 88.3% .田間鑒定正交和反交率分別為 96% 和 89% ，除了反交結(jié)果與本研究相似外，正交分子鑒定純度略高于田間鑒定純度，與本研究相反，有可能是受環(huán)境影響，將長(zhǎng)勢(shì)不好或過(guò)好的單株也判定為了雜株；方小雪等2在蘿卜雜交種圓都1號(hào)的純度鑒定中，分子鑒定和田間鑒定純度分別為 98.6% 和 97.77% ，結(jié)果也存在分子鑒定純度高于田間鑒定純度，其田間鑒定雜株的主要依據(jù)為長(zhǎng)勢(shì)、葉色和株幅，這3個(gè)農(nóng)藝性狀均易受到水分、溫度、肥料等外界環(huán)境的影響，進(jìn)而造成了偏差。因此，無(wú)論是受親本和雜交種遺傳性狀接近的影響不易判別差異株，還是由于外界環(huán)境影響多選差異株，均表明了田間鑒定的不可控性，不如分子鑒定結(jié)果簡(jiǎn)單明了。

本研究的春福不結(jié)球白菜的分子鑒定純度和田間鑒定純度分別為 98.1% 和 100% ，表明普威農(nóng)業(yè)科技有限公司的小白菜品種春福有較高的純度，而分子鑒定和田間鑒定純度偏差僅有 1.9% ，小于 2% 符合誤差允許范圍[28-29]，分子鑒定完全能夠代替田間鑒定，同時(shí)節(jié)約了田間鑒定的時(shí)間和勞動(dòng)成本。

綜上所述，筆者從96對(duì)不結(jié)球白菜SSR引物中篩選出3對(duì)在春福父本、母本中表現(xiàn)出多態(tài)性的引物，其中Rapa18和Rapa57可以用于春福的雜交種純度鑒定，但鑒于Rapa57更易于判讀結(jié)果的特性，選用Rapa57對(duì)春福的雜交種進(jìn)行純度鑒定。結(jié)果顯示，分子鑒定純度為 98.1% ，田間鑒定純度為100% ，偏差小于 2% ，分子鑒定能夠有效代替田間鑒定。該方法能夠快速、有效、準(zhǔn)確地鑒定出雜交種純度，在生產(chǎn)和種子推廣上相較于田間鑒定節(jié)約了近 75% 的時(shí)間，為不結(jié)球白菜雜交種的大規(guī)模純度鑒定提供了新方向和技術(shù)支撐，也為其他作物建立高通量純度鑒定提供了參考。

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