AMPK在糙皮側(cè)耳生長(zhǎng)發(fā)育不同階段及非生物脅迫下的差異表達(dá)

中圖分類號(hào)： S646.1⁺41 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2025）08-045-07

Differential expression of AMPK in different stages of growth and developmentof Pleurotusostreatus and under abiotic stress

LI Huihui， CHEN Zhaoyang， ZHENG Xiukun， WEN Qing， LIU Qing， QI Yuancheng， WANG Fengqin，

HUYanru， SHENJinwen

（Collegeofifeiences，HenanAgriculturalUniversityengzhouo，Henana）

Abstract：To explore the expression characteristics of the three subunits α， β ，and γ ofAMPK（AMP-activated protein kinase）uring diferent stagesof the growthand developmentof Pleurotus ostreatus andunder various abiotic stresses，this study first obtained the sequencesof the three subunits ofAMPK in P. ostreatus through homology alignment.Then，qPCR was used to investigate the relative expression levels of the three subunits ofAMPK during diferent stages of growth anddevelopment，aswellasuderutritional stress，temperaturestress，heavymetal stress，oxidativestressandalt stres.The results showed that theAMPKa subunit was highly expressed during the initialstage offruiting body development， the primordium stage，the fruiting body stage of P. ostreatus，as well as under temperature stress， heavy metal stress， and oxidative stress.TheAMPKβ subunit was highly expresed during the initial stageoffruiting bodydevelopment，under nutritionaltress，eavymetalstres，andsalt stress.Theexpressionlevelof theAMPKysubunitonlyicreaseduring the initial stage offruitingbody developmentandunder heatstress within temperature stress.Theabove results indicate thathethree subunitsofAMPKrespond todiferent environmental stressesandmayhave differentregulatory functions. Among them，theAMPKasubunit playsakeyrole in theregulatory functionofAMPK.This studylaysafoundation for furtherin-depth explorationof thefunctions ofthe threesubunitsofAMPKduring the growthanddevelopmentof P. OStreatus and under diferent stresses，and also provides innovative ideas forthe studyof the stress resistance of P. ostreatus.

Keywords：AMPK;qPCR;Pleurotusostreatus;Abiotic stress

糙皮側(cè)耳（Pleurotusostreatus）俗稱平菇，是我國(guó)乃至世界主栽食用菌種類之一，栽培原料來(lái)源廣泛。糙皮側(cè)耳不僅具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特風(fēng)味，還能在抗氧化、抗炎、抗病毒和免疫刺激等方面發(fā)揮作用[2。我國(guó)糙皮側(cè)耳的種植以傳統(tǒng)大棚為主，該種植方式具有節(jié)省資源以及方便快捷等優(yōu)勢(shì)，但是大棚環(huán)控能力差，糙皮側(cè)耳生長(zhǎng)極易受到環(huán)境條件的影響。2021年河南遭受暴雨洪澇災(zāi)害，全省香菇、平菇、木耳、草菇等食用菌產(chǎn)量受損，造成直接經(jīng)濟(jì)損失近1億元。近年來(lái)，全球氣候變暖與極端天氣造成了我國(guó)各地食用菌一定程度的減產(chǎn)甚至絕收，由于食用菌生產(chǎn)對(duì)氣候變化的適應(yīng)性不足，無(wú)法應(yīng)對(duì)天氣變化帶來(lái)的挑戰(zhàn)，外界環(huán)境脅迫嚴(yán)重威脅糙皮側(cè)耳子實(shí)體的生長(zhǎng)與品質(zhì)[5]。

AMP 激活的蛋白激酶（AMPK）是由 a，β 和y亞基構(gòu)成的異源三聚體，在真核生物中高度保守，作為一種感知和調(diào)節(jié)生物體胞內(nèi)能量水平的關(guān)鍵因子，在維持生物體代謝平衡和調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。AMPK在微生物中又稱Sucrose-nonfermenting1（SNF1），可以被氧化應(yīng)激、葡萄糖剝奪、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等應(yīng)激途徑激活，參與胞內(nèi)的葡萄糖代謝、脂質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)代謝等，此外，還可以調(diào)節(jié)線粒體的生物合成和自噬[7-8]。

AMPKα亞基是催化亞基，N端包含了絲/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域和保守的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，該位點(diǎn)磷酸化可以直接激活該激酶的催化活性，在C端含有一個(gè)與調(diào)節(jié)亞基形成復(fù)合物的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，存在2個(gè)AMPKα亞基，即AMPKa1和AMPKα2；真菌中存在一個(gè)AMPKα亞基的同源蛋白SNF1；植物中存在3個(gè)AMPKα亞基的同源蛋白，分別為蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶1α1（SNRK1α1）、蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶1α2（SNRK1α2）和蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶1α3（SNRK1α3），不過(guò)SNRK1a3較為罕見(jiàn)[]。在植物遭遇鹽脅迫、高滲脅迫等非生物脅迫時(shí)，SNRK1α被誘導(dǎo)激活，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)可溶性糖、淀粉含量以及ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）活性，增強(qiáng)植株的抗逆能力[\"。在靈芝中，SNF1受熱脅迫誘導(dǎo)激活后，通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)無(wú)氧糖酵解速率來(lái)減少活性氧積累，從而對(duì)靈芝的次生代謝產(chǎn)生影響[2]。

AMPKβ和y亞基作為調(diào)節(jié)亞基，可以和 α 亞基的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域直接互作，協(xié)同發(fā)揮作用。 β 亞基通常作為連接 a 和γ亞基的橋梁，其N端是一段可變基序，含有一個(gè)糖類結(jié)合元件CBM，C端用來(lái)結(jié)合 a 和 γ 亞基；y亞基含有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，包含4個(gè)串聯(lián)的胱硫氨酸 β 合酶（CBS）基序，用來(lái)響應(yīng)AMP、ADP和ATP水平的變化[13]。在釀酒酵母中，含有3個(gè) β 亞基（SIP1、SIP2、GAL83）， β 亞基的亞細(xì)胞定位會(huì)影響SNF1在酵母中的調(diào)控功能，進(jìn)而影響菌體對(duì)非生物脅迫的抗逆能力：在缺少葡萄糖時(shí)，SIP1、SIP2、GAL83分別定位于液泡、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核，葡萄糖回補(bǔ)后則定位于細(xì)胞質(zhì)中；SIP1過(guò)表達(dá)菌株在高乙醇條件下成活率較高；GAL83在堿性脅迫下定位于細(xì)胞核，負(fù)責(zé)調(diào)控碳源[14-15]。哺乳動(dòng)物中有3個(gè)γ亞基AMPKy1、AMPKy2、AMPKy3;酵母和白色念珠菌中只有1個(gè)由SNF4編碼的γ亞基；白色念珠菌中的SNF4介導(dǎo)葡萄糖等碳源代謝、參與細(xì)胞壁合成、影響菌株對(duì)化學(xué)藥物的抵抗能力[16.17]。細(xì)胞受到外界環(huán)境的壓力，胞內(nèi)代謝失衡，AMPK3個(gè)亞基通過(guò)形成復(fù)合物來(lái)調(diào)控代謝穩(wěn)態(tài)；此外，AMPK的3個(gè)亞基也可以獨(dú)立于三聚體復(fù)合物響應(yīng)多種非生物脅迫的誘導(dǎo)[18]。

AMPK蛋白激酶廣泛存在于各種真核生物中，參與生物體的生長(zhǎng)代謝調(diào)控及多種非生物脅迫響應(yīng)，但目前在食用菌中研究較少，并且AMPK3個(gè)亞基在糙皮側(cè)耳生長(zhǎng)代謝及非生物脅迫下的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。筆者旨在通過(guò)對(duì)AMPK3個(gè)亞基在糙皮側(cè)耳不同生長(zhǎng)發(fā)育階段，以及各種非生物脅迫下的表達(dá)特性分析，初步解析3個(gè)亞基可能調(diào)控的抗逆途徑，為后續(xù)深入研究AMPK3個(gè)亞基在糙皮側(cè)耳不同脅迫下的調(diào)控功能提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)于2023年12月至2024年5月在實(shí)驗(yàn)樓進(jìn)行。1.1.1菌株糙皮側(cè)耳（ P. ostreatus）菌株X831由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌研究室保藏并提供。1.1.2培養(yǎng)基GYE（glucose yeast extract）培養(yǎng)基：酵母提取物 s_g. 葡萄糖 20g 、維生素B1 0.01g 、KH₂PO₄1g.MgSO₄?7H₂O0.5g，ddH₂O 溶解并定容至 下高壓蒸汽滅菌 30min 。MCM培養(yǎng)基：微晶纖維素 10g?MgSO₄? 7H₂O0.5g. （NH₄）₂HPO₄5g.KH₂PO₄4.6g. 微量元素 2mL （配方見(jiàn)表1）， 溶解并定容至 下滅菌30min 。SA培養(yǎng)基：蔗糖 20g，NH₄H₂PO₄2g. 天冬酰胺（Asn） 0.88g. 氨酸 （L-Val）1g?K₂HPO₄?3H₂O 0.224g?KH₂PO₄ 0.803g?MgSO₄?7H₂O 0.99g?CaCl₂

0.02g，ddH₂O 溶解并定容至 下高壓蒸汽滅菌 30min 。滅菌后加入 5mL 微量元素溶液I和微量元素溶液II。微量溶液 I：ZnSO₄?7H₂O 0.89g. MnSO₄?H₂O 0.765g.CuSO₄ 5H₂O 0.20g 溶解并定容至1L，使用 0.22μm 細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌。微量元素II：腺苷 1.65g 、硫胺素鹽酸鹽 0.02g 溶解并定容至1L，使用 0.22μm 細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌。

表1微量元素配方Table1Traceelementformulation

1.2 方法

1.2.1菌種活化在超凈工作臺(tái)中，將冰箱保藏的X831菌種用無(wú)菌接種針取適量置于新鮮的GYE平板上， 25^°C 恒溫避光培養(yǎng)箱培養(yǎng) 8～10d. 0

1.2.2平板菌絲培養(yǎng)平板培養(yǎng)模擬糙皮側(cè)耳出菇過(guò)程，將X831菌種轉(zhuǎn)接于SA固體培養(yǎng)基中，置于 25^°C 黑暗環(huán)境中培養(yǎng)7d至菌絲滿板（CK），收集部分樣品備用；隨后將剩余平板轉(zhuǎn)移至 16^°C 恒溫培養(yǎng)箱（ ^12h 光照、 .12h 黑暗）進(jìn)行出菇管理，培養(yǎng)5d和10d后分別收集樣品備用；培養(yǎng)約15d左右時(shí)，收集原基期樣品；待長(zhǎng)出平菇子實(shí)體（培養(yǎng)約22d）后，收集子實(shí)體樣品，置于 -80^°C 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3液體菌絲培養(yǎng)將8～10塊活化的平菇X831菌種塊轉(zhuǎn)接至新鮮的GYE液體培養(yǎng)基中（其中放入8～10顆玻璃珠用來(lái)打碎菌絲），在 25^°C 、180r?min^-1 下培養(yǎng)6～7d，菌液呈現(xiàn)均勻的小米粥狀，用磁力攪拌器攪拌 30min 左右，進(jìn)一步使菌絲均勻化，確保每瓶的接種量相同，然后以 5% 的接種量接到新鮮的GYE培養(yǎng)基中，在 25^°C?180r?min^-1 下培養(yǎng)5d，以葡萄糖為唯一碳源的處理組繼續(xù)用GYE液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2d（CK），以纖維素為碳源的處理組需要把菌絲過(guò)濾出來(lái)，在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌水把菌絲表面的培養(yǎng)基沖洗干凈后轉(zhuǎn)接入新的以纖維素為唯一碳源的MCM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d。結(jié)束后用漏勺過(guò)濾掉培養(yǎng)基，把過(guò)濾得到的菌絲表面的培養(yǎng)基用去離子水沖洗干凈，然后用無(wú)紡布吸走菌絲表面的水分，錫紙包裹后液氮冷凍處理，然后將收集到的不同處理的菌絲放置- 80^° C冰箱保存。

1.2.4非生物脅迫處理溫度脅迫：將活化好的X831菌種轉(zhuǎn)接GYE平板，待長(zhǎng)至平板的2/3時(shí)，分別在 42^°C，4^°C 培養(yǎng)箱脅迫培養(yǎng) 24h ，以 25^°C 為對(duì)照（CK），刮取菌絲后，液氮速凍，樣品置于 -80^°C 保存?zhèn)溆谩Ｑ趸{迫：將X831菌種轉(zhuǎn)接在 2mmol?L^-1 過(guò)氧化氫的GYE平板上，添加等體積去離子水作為空白對(duì)照， 25^°C 恒溫避光培養(yǎng)箱培養(yǎng) 8～10d. 。刮取菌絲后，液氮速凍，樣品置于 -80^°C 冰箱保存?zhèn)溆谩Ｖ亟饘倜{迫：將X831菌種接種至0、5、10、15mg?L^-1 的硝酸鉛、氯化鎘和氯化汞的GYE培養(yǎng)基，添加等體積去離子水作為對(duì)照組， 25^°C 恒溫黑暗培養(yǎng)至對(duì)照菌絲滿板， -80^°C 冰箱保存?zhèn)溆谩｛}脅迫處理：將X831菌種接種至含有 1%.2% NaCI的GYE培養(yǎng)基，以 0%NaCl 的GYE培養(yǎng)基為對(duì)照組，放入 25^°C 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～10d，刮取菌絲后，液氮速凍，樣品置于 -80^°C 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5RNA提取及熒光定量PCR分析將 -80^°C 冰箱保存的樣品置于研缽中，液氮研磨至粉末狀，然后使用南京諾維贊FreeZolReagent試劑盒進(jìn)行RNA提取。用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄使用南京諾唯贊HiScriptIIIRTSuperMixforqPCR（+gDNAwiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為 20μL ，qPCR程序設(shè)定為 95^°C，30 s（保持階段）； 95^°C，10s;60^°C，30s （循環(huán)階段，40個(gè)循環(huán)）。熒光定量所用PCR引物如表2。

表2熒光定量PCR引物

Table2 Primersused forfluorescence quantitative PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPadPrism9.0對(duì)熒光定量數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。試驗(yàn)組與對(duì)照組間差異顯著性通過(guò)單因素方差分析（One-wayANOVA）判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMPK3個(gè)亞基的鑒定

經(jīng)過(guò)同源序列（BLASTP）比對(duì)，在糙皮側(cè)耳數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//mycocosm.jgi.doe.gov/pages/blast-query.jsfdb ? PleosPC15_1）中獲得1個(gè)靈芝SNF1同源蛋白 AMPKα ，獲得釀酒酵母 β 亞基和 γ 亞基同源蛋白AMPK β 和AMPKy各1個(gè)，結(jié)果如圖1所示。

圖1AMPKa、AMPKβAMPKy基因結(jié)構(gòu)Fig.1Gene structure of AMPKa，AMPKβ，andAMPKy

2.2AMPK3個(gè)亞基在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期相對(duì)表達(dá)量的變化

為了探究AMPK3個(gè)亞基在糙皮側(cè)耳不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，筆者用平板培養(yǎng)模擬糙皮側(cè)耳出菇培養(yǎng)條件，qPCR檢測(cè)在不同發(fā)育時(shí)期內(nèi)（菌絲期、 .16^°C 誘導(dǎo)出菇 5d，16^°C 誘導(dǎo)出菇10d、原基期、子實(shí)體期）3個(gè)亞基表達(dá)量，結(jié)果如圖2所示，AMPKa亞基的相對(duì)表達(dá)量在低溫誘導(dǎo)前期、原基期和子實(shí)體期都較對(duì)照組菌絲期升高了2倍以上，AMPKa亞基在子實(shí)體形成期大量合成，參與了糙皮側(cè)耳子實(shí)體形成的整個(gè)階段。AMPKβ亞基和AMPKy亞基在模擬子實(shí)體形成的低溫誘導(dǎo)前期表達(dá)量顯著上升，但是幅度不大，除AMPKβ亞基在原基期的相對(duì)表達(dá)量顯著降低外，AMPKβ亞基和AMPKy亞基其他時(shí)期的表達(dá)量與菌絲期相比均無(wú)明顯變化，說(shuō)明AMPKβ和y亞基可能參與糙皮側(cè)耳子實(shí)體的形成。

2.3AMPK3個(gè)亞基在營(yíng)養(yǎng)脅迫下相對(duì)表達(dá)量的變化

作為碳代謝調(diào)控關(guān)鍵元件，AMPK的基本功能就是在營(yíng)養(yǎng)脅迫條件下調(diào)控能量代謝。為了探究AMPK3個(gè)亞基在糙皮側(cè)耳不同營(yíng)養(yǎng)條件下的響應(yīng)情況，筆者以非優(yōu)勢(shì)碳源微晶纖維素替代優(yōu)勢(shì)碳源葡萄糖，檢測(cè)在營(yíng)養(yǎng)脅迫下3個(gè)亞基的表達(dá)量，結(jié)果如圖3所示。與以葡萄糖為唯一碳源相比，除 β 亞基顯著上調(diào)表達(dá)外， α 亞基和y亞基表達(dá)水平并無(wú)明顯變化，文獻(xiàn)報(bào)道，碳饑餓會(huì)導(dǎo)致AMPKα催化亞基磷酸化水平顯著增加，進(jìn)而激活蛋白激酶酶活性來(lái)響應(yīng)碳饑餓造成的代謝失衡[12]。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道可推測(cè)：在當(dāng)前的營(yíng)養(yǎng)脅迫（微晶纖維素替代葡萄糖）條件下， α 亞基和y亞基的轉(zhuǎn)錄水平未發(fā)生顯著變化，但 a 亞基可能通過(guò)文獻(xiàn)報(bào)道的磷酸化修飾途徑被激活；而 β 亞基則主要在轉(zhuǎn)錄水平上受到調(diào)控。這表明AMPK不同亞基響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)脅迫可能存在差異化的調(diào)控機(jī)制。

注：不同小寫(xiě)字母表示處理間在0.05水平差異顯著。下同。 Note：Differentsmallettrs indicatesignificant differenceamongdifferent treatmentsatO.O5level.Thesame below.

圖2 AMPKαMNPKβAMPKγ 在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期相對(duì)表達(dá)量變化 Fig.2Relativeexpressionlevel ofAMPKa，AMPKβ，and AMPKγ atdifferent growth and development stage

圖3 AMPKαAMPKβ，AMPKγ 在營(yíng)養(yǎng)脅迫下相對(duì)表達(dá)量的變化

2.4AMPK3個(gè)亞基在溫度脅迫下相對(duì)表達(dá)量的變化

探究AMPK蛋白激酶3個(gè)亞基在冷熱脅迫下的表達(dá)特性，結(jié)果如圖4所示，AMPKα基因在冷熱脅迫下表達(dá)水平均顯著升高，AMPKβ亞基在溫度脅迫下表達(dá)量均無(wú)明顯變化，AMPKy亞基在冷脅迫下表達(dá)水平無(wú)明顯變化，在熱脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)。上述結(jié)果表明，AMPKα亞基和AMPKy亞基響應(yīng)熱脅迫的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平升高，可能參與調(diào)控?zé)崦{迫途徑緩解糙皮側(cè)耳熱損傷，AMPKα亞基還受冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)量升高，響應(yīng)低溫脅迫。AMPKβ亞基不受溫度脅迫響應(yīng)，不參與調(diào)控溫度脅迫。

圖4AMPKa、AMPKβ、AMPKy在溫度脅迫下相對(duì)表達(dá)量的變化

Fig.4ChangesinrelativeexpressionlevelsofAMPKa， AMPKβ，and AMPKγ under temperature stress

圖5 AMPKα、AMPKβ、AMPKγ 在重金屬脅迫下相對(duì)表達(dá)量的變化

2.5AMPK3個(gè)亞基在重金屬脅迫下相對(duì)表達(dá)量的變化

為了明確AMPK3個(gè)亞基是否響應(yīng)重金屬脅迫，通過(guò)平板外源添加不同質(zhì)量濃度的鎘（Cd）、汞（Hg） 、鉛（Pb），探究 α、β、γ3 個(gè)亞基的表達(dá)特性，結(jié)果如圖5所示。AMPKa和AMPKβ亞基表達(dá)量在10mg?L^-1Cd²⁺，10mg?L^-1Hg²⁺ 和 10mg?L^-1Pb²⁺ 處理下均顯著升高，約為對(duì)照組的2倍， AMPKγ 亞基表達(dá)量在3種重金屬脅迫處理下均無(wú)顯著變化。以上結(jié)果表明，AMPKα和 AMPKβ 亞基響應(yīng)10mg?L^-1 處理的 Cd²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺ 脅迫，AMPKy亞基不響應(yīng)重金屬脅迫。

2.6AMPK3個(gè)亞基在氧化脅迫下相對(duì)表達(dá)量的變化

通過(guò)外源添加過(guò)氧化氫，模擬氧化脅迫條件，探究AMPK3個(gè)亞基對(duì)氧化脅迫的響應(yīng)情況，結(jié)果如圖6所示。AMPKα亞基的表達(dá)量在 2mmol?L^-1 H₂O₂ 處理下顯著提高，AMPKβ和 AMPKγ 的表達(dá)量相較于對(duì)照組無(wú)顯著變化，由此可知，僅AMPKα亞基在轉(zhuǎn)錄水平響應(yīng)氧化脅迫。

圖6 在氧化脅迫下相對(duì)表達(dá)量的變化

2.7AMPK3個(gè)亞基在鹽脅迫下相對(duì)表達(dá)量的變化

通過(guò)外源添加不同濃度NaC1，模擬鹽脅迫條件，探究3個(gè)亞基對(duì)鹽脅迫響應(yīng)情況，結(jié)果如圖7

圖7AMPKa、AMPKβ、 AMPKγ 在鹽脅迫下相對(duì)表達(dá)量的變化

Fig.7Changes in relative expression levels of AMPKa， AMPKβ，andAMPKy under saltstress

所示，AMPKβ亞基在 2%NaCl 處理下表達(dá)量顯著上調(diào)，AMPKα和AMPKy亞基的表達(dá)水平無(wú)顯著變化，僅AMPKβ亞基響應(yīng) 2%NaCl 處理的鹽脅迫誘導(dǎo)。

3 討論與結(jié)論

生物體在生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中會(huì)遭遇外界環(huán)境的多種刺激，在多種應(yīng)激條件下胞內(nèi)代謝失衡，維持能量穩(wěn)態(tài)是生物體生存的一個(gè)重要策略，AMPK蛋白激酶可以在多種信號(hào)通路中調(diào)控能量代謝，從而響應(yīng)逆境脅迫[19]。糙皮側(cè)耳是我國(guó)主栽食用菌種類之一，生長(zhǎng)發(fā)育受外界環(huán)境影響較大。外界脅迫不僅會(huì)阻礙菌絲生長(zhǎng)，還會(huì)促使大量活性氧（ROS）積累，破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量代謝失衡[20]。

筆者在本研究發(fā)現(xiàn)，AMPK復(fù)合體的 α，β，γ 亞基在糙皮側(cè)耳應(yīng)對(duì)非生物脅迫時(shí)呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)的特征。 α 亞基作為催化核心，在溫度脅迫、重金屬脅迫及氧化脅迫中均表現(xiàn)顯著上調(diào)，且貫穿子實(shí)體發(fā)育全程，提示其可能通過(guò)維持基礎(chǔ)能量代謝參與發(fā)育調(diào)控。而 β_?γ 亞基則表現(xiàn)出脅迫特異性： β 亞基在重金屬暴露及營(yíng)養(yǎng)脅迫時(shí)激活， γ 亞基則特異性響應(yīng)熱激。值得注意的是，三者在相同脅迫下缺乏表達(dá)同步性，暗示亞基可能存在獨(dú)立于經(jīng)典三聚體復(fù)合物的調(diào)控路徑。這一現(xiàn)象在進(jìn)化保守性研究中獲得佐證，番茄中編碼 α 亞基的基因PpSnRKlα可以提高抗氧化酶基因的表達(dá)水平和酶活性，調(diào)節(jié)活性氧代謝進(jìn)而增強(qiáng)耐鹽性，也可以和ShCIGT蛋白質(zhì)互作來(lái)改善番茄的耐寒和耐旱性[21-22]。黃曲霉菌AMPKβ亞基GAL83可以和Fus3相互作用調(diào)節(jié)黃曲霉菌的次生代謝產(chǎn)物[23]。AMPK的3個(gè)亞基可以和多種與其激酶活性無(wú)關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用響應(yīng)逆境脅迫，具有獨(dú)立于三聚體復(fù)合物之外的激酶活性，由此通過(guò)3個(gè)亞基在相同的非生物脅迫下的不同表達(dá)模式，也可猜測(cè)3個(gè)亞基在不同的非生物脅迫下可能獨(dú)立于三聚體復(fù)合物發(fā)揮調(diào)控功能。

敲除小鼠中的AMPKα亞基會(huì)加劇鎘脅迫造成的氧化損傷，AMPK通路還可以減輕兔子大腦中鎘誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和自噬[21-22]。在本研究中，AMPKα和AMPKβ在重金屬鎘、汞和鉛誘導(dǎo)下，轉(zhuǎn)錄水平均升高，暗示AMPKα和AMPKβ可能在糙皮側(cè)耳抵抗重金屬脅迫中發(fā)揮一定作用。在糙皮側(cè)耳遭遇由微晶纖維素替代葡萄糖引發(fā)的營(yíng)養(yǎng)脅迫時(shí)，AMPKβ亞基的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，而 a 和 γ 亞基的轉(zhuǎn)錄水平則未發(fā)生顯著變化。筆者推測(cè)糙皮側(cè)耳在應(yīng)對(duì)此類急性能量危機(jī)時(shí)， β 亞基在轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)可能反映了其調(diào)控的重要性或長(zhǎng)期適應(yīng)需求，糙皮側(cè)耳可能通過(guò) α 亞基的變構(gòu)調(diào)節(jié)（而非轉(zhuǎn)錄激活）響應(yīng)能量危機(jī)[。這種多層次（轉(zhuǎn)錄與翻譯后）、多亞基 （β 與 a 的協(xié)同調(diào)控策略，使AMPK能夠靈活高效地應(yīng)對(duì)急性營(yíng)養(yǎng)脅迫。

綜上所述，AMPKα在子實(shí)體發(fā)育全過(guò)程及溫度脅迫、重金屬脅迫和氧化脅迫中均呈顯著上調(diào)表達(dá)，表明其可能通過(guò)基礎(chǔ)能量代謝調(diào)控參與生長(zhǎng)發(fā)育與脅迫應(yīng)答。 β 和y亞基表現(xiàn)出明顯的脅迫特異性： β 亞基特異性響應(yīng)重金屬及營(yíng)養(yǎng)脅迫，而y亞基僅在熱激條件下顯著激活。3個(gè)亞基在相同脅迫處理下呈現(xiàn)異步表達(dá)特征，且 β/γ 亞基在模擬子實(shí)體發(fā)育階段未檢測(cè)到顯著轉(zhuǎn)錄波動(dòng)，提示各亞基可能通過(guò)獨(dú)立于經(jīng)典三聚體復(fù)合物的非典型通路發(fā)揮調(diào)控功能。

參考文獻(xiàn)

[1] 董浩然，于海龍，姜寧，等.中國(guó)食用菌工廠化生產(chǎn)發(fā)展現(xiàn)狀及 趨勢(shì)[J].食藥用菌，2024，32（1）：1-9.

[2] 曹月剛，趙健，韓吉輝.食用菌營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀分 析[J].中國(guó)食品工業(yè)，2024（1）：165-167.

[3] 唐廷廷，聶青玉，陳吉裕，等.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展背景下中國(guó)平菇產(chǎn) 業(yè)現(xiàn)狀及對(duì)策研究[J].中國(guó)瓜菜，2025，38（2）：184-194.

[4] 李虎，顏廷武，吳志旻.大食物觀下食用菌產(chǎn)業(yè)鏈韌性面臨的 現(xiàn)實(shí)挑戰(zhàn)與提升對(duì)策[J].食藥用菌，2024，32（5）：281-288.

[5] 常婷婷，趙妍，楊煥玲，等.食藥用菌高溫脅迫應(yīng)答研究進(jìn)展[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，2021，28（1）：124-134.

[6] BHUTTAMS，GALLOES，BORENSTEINR.Multifaceted role of ampk in viral infections[J].Cells，2021，10（5）：1118.

[7] STEINBERGGR，HARDIEDG.Newinsightsintoactivation andfunction of the AMPK[J].Nature ReviewsMolecularCell Biology，2023，24：255-272.

[8] MENGL，LIUHL，LINX，etal.Enhancedmulti-stresstoleranceand glucose utilization of Saccharomyces cerevisiaeby overexpression of the SNF1 gene and varied beta isoform of Snfl dominates in stresses[J].Microbial CellFactories，2020，19 （1）：134.

[9] YANY，ZHOUXE，XU HE，et al.Structure and physiological regulation of AMPK[J].International Journal ofMolecular Sciences，2018，19（11）：3534.

[10]EMANUELLE S，HOSSAIN MI，MOLLERIE，et al. SnK1 fromArabidopsisthalianaisanatypical AMPK[J].Plant Journal，2015，82（2）：183-92.

[11]KUMARP，MADHAWANA，SHARMAA，etal.A sucrose non-fermenting-1-related proteinkinase1 gene fromwheat， TaSnRKlα regulates starch biosynthesis by modulating AGPase activity[J].Plant Physiology and Biochemistry，2024，207： 108407.

[12]HU YR，XU W Z，HU S，et al.Glsnfl-mediated metabolic rearrangement participatesin copingwith heat stressand influencingsecondary metabolism in Ganoderma lucidum[J].Free Radical Biologyand Medicine，2020，147：220-230.

[13]WILLOWSR，NAVARATNAMN，LIMAA，etal.Effect of different γ- subunit isoforms onthe regulation ofAMPK[J].Biochemical Journal，2017，474（10）：1741-1754.

[14]CHANDRASHEKARAPPAD G，MCCARTNEYRR，ODONNELL AF， et al. The β subunit of yeast AMP-activated protein kinase directs substrate specificity in response to alkaline stress[J].Cellular Signalling，2016，28（12）：1881-1893.

[15]SHYMANSKY C M， WANG G，BAIDOO E E K，et al.Flux-enabled exploration of the role of Sipl in galactose yeast metabolism[J].Frontiers in Bioengineering and Biotechnology，2017， 5：31.

[16] ZHOU Q，HAO B，CAO X，et al.Energy sensor AMPK gamma regulates translation via phosphatase PPP6C independent of AMPK alpha[J].Molecular Cell，2024，84（9）：1816-1816.

[17]KE CL，LEW S Q，HSIEH Y，et al.Convergent and divergent roles of the glucose-responsive kinase SNF4 in Candida tropicalis[J].Virulence，2023，14（1） ：2175914.

[18]MARTiNEZ- BARAJAS E，COELLO P. Review： How do SnRK1protein kinases trulywork？[J].Plant Science，2020， 291：110330.

[19]LINGNXY，KACZMAREK A，HOQUE A，et al.mTORC1 directly inhibits AMPK to promote cell proliferation under nutrient stress[J].Nature Metabolism，2020，2（1）：41-49.

[20]QIU ZH，WU XL，GAO W，et al.High temperature induced disruption of thecell wall integrity and structure in Pleurotus ostreatusmycelia[J].AppliedMicrobiology and Biotechnology， 2018，102（15）：6627-6636.

[21]WANG WR，LING JH，WANG G F，et al. Overexpression of PpSnRKlα intomato enhanced salt tolerancebyregulatingABA signaling pathway and reactive oxygen metabolism[J].BMC Plant Biology，2020，20（1）：128.

[22]YU CY，SONG L L，SONG JW，et al.ShCIGT，a trihelix family gene，mediates cold and drought tolerance by interacting with SnRKl in tomato[J].Plant Science，2018，270：140-149.

[23]MA L X，MA JN，TIANY Y，et al.Fus3 interacts with Gal83， revealing the MAPK crosstalk to Snf1/AMPK to regulate secondarymetabolic substrates inAspergillus flavus[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2024，72（17），10065-10075

[24]LIRY，LUO X，ZHUY J，et al.ATM signals to AMPK to promote autophagy and positively regulate DNA damage in response to cadmium-induced ROS in mouse spermatocytes[J].Environmental Pollution，2017，231（2）：1560-1568.

[25] XUE H T，CAO H B，XING C H，et al. Selenium triggers Nrf2-AMPK crostalk toaleviate cadmium-induced autophagy in rabbit cerebrum[J].Toxicology，2021，459：152855.