一株生防木霉的鑒定及對山藥病原菌的拮抗作用

摘要

由膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides引起的炭疽病和交鏈格孢Alternaria alternata引起的黑斑病是山藥生產中的主要病害，嚴重威脅著山藥產業的健康和可持續發展，尋找高效環保的生物防治方法對提高山藥的產量與質量具有重要意義。本研究從山藥塊莖上分離得到一株木霉菌株TKN1，經過形態學觀察和分子生物學鑒定確認為擬康寧木霉Trichoderma koningiopsis。生物學特性研究顯示，25℃和pH為6最適合擬康寧木霉生長。平板對峙培養試驗顯示，該木霉對山藥常見病原菌：膠孢炭疽菌、交鏈格孢、藤倉鐮刀菌Fusarium fujikuroi和腐皮鐮刀菌Fusarium solani均表現出顯著的拮抗作用，平均抑制率超過84%。顯微觀察顯示，擬康寧木霉通過纏繞和消解方式有效破壞了藤倉鐮刀菌的菌絲生長。室內防效評估結果顯示，該木霉對膠孢炭疽菌、交鏈格孢和藤倉鐮刀菌引起的山藥葉部和塊莖病害的防治效果能達到44%以上。以上研究結果表明，擬康寧木霉TKN1抑菌譜廣，具備良好的生防潛力，可為山藥種植中多種真菌病害的綠色防控提供新的生防菌種資源。

關鍵詞

擬康寧木霉; 生物防治; 分離鑒定; 山藥病害

中圖分類號：

S 476

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024381

Identification of a biocontrol Trichoderma strain and its antagonistic activity against yam pathogens

WANG Gang， WAN Zhirui， SHEN Danyu*， DOU Daolong

（College of Plant Protection， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract

Anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides and black spot caused by Alternaria alternata are major diseases affecting yam production， posing significant threats to its sustainability and quality. In this study， a Trichoderma strain designated TKN1 was isolated from yam tubers and identified as Trichoderma koningiopsis based on morphological characteristics and molecular phylogeny. The strain exhibited optimal growth at 25℃ and pH 6. Dualculture assays revealed strong antagonistic activity of TKN1 against C.gloeosporioides， A.alternata， Fusarium fujikuroi， and F.solani， with an average inhibition rate exceeding 84%. Microscopic observation showed that TKN1 parasitized F.fujikuroi hyphae through coiling and lysis. Indoor bioassays further demonstrated that TKN1 effectively reduced both foliar and tuber diseases caused by the three pathogens， achieving more than 44% disease control efficacy. These findings highlight that TKN1 has a broad antifungal spectrum and significant potential as a biocontrol agent for managing fungal diseases in yam cultivation.

Key words

Trichoderma koningiopsis; biological control; isolation and identification; yam diseases

山藥Dioscorea polystachya隸屬于薯蕷科Dioscoreaceae薯蕷屬Dioscorea，廣泛種植于我國長江以北地區，南方地區也有其同屬植物的種植。山藥以其豐富的營養價值和多種藥用功效而聞名，廣泛應用于中醫臨床和食療中［1］。作為營養豐富的藥食同源作物，在中國的農業生產和日常生活中具有重要地位。山藥富含碳水化合物，為人體提供能量，并含有適量的蛋白質，其氨基酸比例對人體有益。在藥用方面，山藥性味甘平，有補脾肺腎之氣、滋陰養生的功效，可用于治療脾胃虛弱、肺腎虧虛、虛熱消渴等病癥［24］。

然而，隨著山藥種植面積的不斷擴大，病害問題日益嚴峻，成為制約山藥產業持續健康發展的重大障礙。近年來，山藥病害種類不斷增多，如膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides引起的炭疽病、交鏈格孢Alternaria alternata引起的黑斑病等頻繁發生且嚴重程度加劇［5］。這些病害導致山藥產量銳減、品質下滑，嚴重影響了山藥的市場價值和經濟效益［6］。當前，病害防控主要依賴化學農藥，但農藥的濫用帶來了殘留問題、環境污染及抗藥性等挑戰。在此背景下，綠色農業理念的推廣使得探索新的綠色防控技術成為迫切需求。

生物防治利用有益生物及其代謝產物控制有害生物，具有生態友好和安全無害等優點，逐漸成為防治作物病害的優選方案。隨著生物防治技術的發展，越來越多的學者關注生防菌在山藥病害防治中的應用。例如，馬來西亞鏈霉菌Streptomyces malaysiensis菌株MJM1968不僅能抑制膠孢炭疽菌的菌絲生長和孢子萌發，還能減輕山藥炭疽病的發生［7］。此外，從蘆薈中分離出的內生細菌地衣芽胞桿菌Bacillus licheniformis也對山藥炭疽病表現出顯著的防治效果［8］。還有研究發現，枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis和細黃鏈霉菌Streptomyces microflavus對山藥腐爛微生物青霉菌具有較強的抑菌活性［9］。

木霉作為一類重要的生防真菌，具有抗逆性強、生長速度快、孢子存活期長等特點［10］，對多種植物病害具有良好的抑制作用，且不易導致病原菌產生抗藥性，有助于促進植物生長和控制病害發生［11］。木霉通過多種途徑防治病害，包括直接作用如釋放細胞壁降解酶、合成抗生素、與病原菌爭奪生態位和營養資源，以及建立寄生關系;還通過間接機制如改善土壤微環境、激發植物自身免疫系統等，實現病害的有效控制［12］。有研發發現哈茨木霉Trichoderma harzianum菌株Th7對山藥炭疽菌有顯著的抑制效果，能有效減輕山藥炭疽病的發生，表明木霉在山藥病害防治中具有良好的應用潛力［13］。

本研究從江西省瑞昌山藥的塊莖上分離獲得一株木霉，通過形態學觀察和分子生物學鑒定相結合的方法對其進行了鑒定，并進一步研究了其生物學特性。利用平板對峙培養試驗測定了這株木霉對山藥4種病原菌的抑制效果，并通過室內防效評估試驗測定了其對山藥病害的防效，旨在挖掘優良的生防菌資源用于山藥病害的防治。

1 材料與方法

1.1 木霉的分離與純化

選取田間采集的瑞昌山藥部分塊莖，在皮層處取0.5 cm2的組織塊，先用2%的次氯酸鈉消毒1 min 45 s，然后用75%的乙醇消毒35 s，無菌水漂洗6 min，隨后在滅菌的濾紙上晾干，置于PDA培養基上，25℃恒溫培養箱中黑暗培養5 d，從長出的菌落邊緣挑取菌絲轉移到新的PDA培養基上［14］。

1.2 木霉的形態觀察

將純化后的木霉菌株接至PDA平板2 d后，用光學顯微鏡觀察木霉的菌絲及孢子的形態特征。

1.3 木霉的分子生物學鑒定

采用CTAB法提取樣品DNA，并于-20℃保存備用。利用ITS通用引物ITS1/ITS4（ITS1：5′TCCGTAGGTGAACCTGCCG3′，ITS4：5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′）和鈣調蛋白基因通用引物CAL228F/CAL737R（CAL228F：5′GAGTTCAAGGAGGCCTTCTCCC3′，CAL737R：5′CATCTTTCTGGCCATCATGG3′）進行PCR擴增。PCR反應程序為：95℃預變性10 min;95℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸1 min，32個循環;72℃延伸5 min，4℃保存。將PCR產物送至生工生物工程（南京）股份有限公司測序，測序結果提交至NCBI網站，使用BLAST進行比對分析［15］，并使用MEGA構建系統發育樹。

1.4 木霉菌株的生物學特性

1.4.1 pH對菌株菌絲生長的影響

使用0.1 mol/L NaOH和HCl調節PDA培養基pH至4、5、6、7、8、9、10后，121℃滅菌20 min［16］。將保存的菌株活化并接種于PDA培養基上，待菌落生長2 d后，用無菌打孔器（直徑 5 mm）在菌落邊緣切取大小一致的菌餅，接種于不同pH的PDA培養基上，于 25℃黑暗條件培養，每個處理設4個重復，2 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.2 溫度對菌株菌絲生長的影響

將直徑為5 mm菌餅接種于pH為6的PDA培養基上，設置4、18、25、30、37℃共5個溫度處理，黑暗條件下培養，每個處理重復4次，2 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.3 光照對菌株菌絲生長的影響

將直徑為5 mm的菌餅接種于pH為6的PDA培養基上，設置光照周期L∥D=12 h∥12 h、L∥D=16 h∥8 h和L∥D=0 h∥24 h培養條件，置于25℃恒溫培養箱中倒置培養，每個處理重復4次，2 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.4 培養基對菌株菌絲生長的影響

配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL）、馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）培養基（馬鈴薯200 g，蔗糖15 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL）、水瓊脂（WA）培養基（瓊脂20 g，蒸餾水 1 000 mL）、察氏（CZA）培養基（硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵 0.01 g，蔗糖 30 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL）和蛋白胨（PWCM）培養基（蛋白胨10 g，葡萄糖 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水 1 000 mL）共5種培養基，將直徑5 mm菌餅接種于培養基上，于25℃培養，每個處理設4個重復，2 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.5 平板對峙試驗

選取膠孢炭疽菌、交鏈格孢、藤倉鐮刀菌Fusarium fujikuroi和腐皮鐮刀菌F.solani作為供試病原菌，這些病原菌由實驗室前期從山藥病害樣品中分離并保存。用打孔器分別打取木霉和病原菌的菌餅（直徑為5 mm）用于平板對峙培養。處理組每個平板上分別接種1個木霉菌餅和1個病原菌菌餅，位置分別設在平板直徑的1/8和7/8處。對照組只接種病原菌而不接種木霉，病原菌接種在平板直徑1/8處。病原菌在25℃下培養，拮抗試驗重復3次。當對照組病原菌生長超過培養基的2/3時，分別測量對照平板和對峙培養平板上病原菌菌落的直徑，計算抑制率，并根據木霉菌絲覆蓋病原菌菌落的情況，評定其覆蓋度級別。

抑制率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100%。覆蓋度的分級標準設定為3級［17］。Ⅰ 級：木霉菌落與病原菌菌落不接觸，木霉菌絲不能覆蓋病原菌菌落;Ⅱ級：木霉菌絲覆蓋病原菌菌落的一半以下，且病原菌菌落顏色無變化;Ⅲ級：木霉菌絲完全覆蓋病原菌菌落，且在病原菌菌落上產生大量孢子，導致病原菌菌落萎縮和顏色變暗。

1.6 木霉發酵液的制備與抑菌率的測定

將木霉接種在直徑為90 mm的PDA平板上，在25℃黑暗條件下恒溫培養至產孢，用5 mm打孔器打取4個木霉菌絲塊，置于含有200 mL PDB培養液的500 mL錐形瓶中，在溫度25℃、轉速180 r/min、黑暗條件下搖床培養7 d。將初步發酵液轉移到預先滅菌的50 mL離心管中，以8 000 r/min離心10 min，取上清，經0.22 μm過濾膜除菌后得到木霉無菌發酵液。

將無菌的木霉發酵液與冷卻至50℃的PDA培養基按1∶9比例混合后倒入平板中固化，設置添加等體積PDB的PDA平板作為對照。培養基凝固后，將直徑為5 mm的病原菌菌絲塊接種于平板中央，在25℃黑暗條件下恒溫培養，期間觀察病原菌菌落生長情況。當對照組病原菌即將長滿整個平板時，使用十字交叉法測量對照組和處理組的病原菌菌落直徑，計算木霉發酵液對病原菌菌落生長的抑制率，每組試驗設置3組重復。發酵液的抑菌率＝（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100%。

1.7 木霉孢子懸浮液的制備

將木霉接種在直徑為90 mm的PDA平板上，在25℃黑暗條件下恒溫培養至產孢，使用無菌水洗脫PDA平板上的孢子，經3層滅菌濾紙過濾，使用血球計數板計算孢子懸浮液的濃度。

1.8 木霉對人工接種病原菌的防治效果測定

將鐵棍山藥塊莖切塊，用去離子水浸泡并沖洗表面黏液，使用2%次氯酸鈉表面消毒3 min，隨后用75%乙醇消毒1 min，用無菌去離子水沖洗3次。將木霉孢子懸浮液浸泡山藥塊莖30 min，之后將塊莖放置在吸水紙上晾干。分別在處理過和未處理的塊莖中央接種直徑為5 mm的病原菌菌餅，同時設立經木霉孢子懸浮液處理后接種無菌瓊脂塊的塊莖作為陰性對照，每組試驗重復3次。將接種塊莖置于恒溫培養箱中，25℃黑暗條件下培養7 d。

防病效果=（對照組病斑直徑-處理組病斑直徑）/對照組病斑直徑×100%。

將鐵棍山藥葉片用75%乙醇噴灑正反面，放入純水中浸泡并漂洗10 s，擦干后豎直放置在接種盤上。設置處理組和對照組，每組處理3片葉片，共6個重復，處理組使用濃度為1.7×106 cfu/mL的木霉孢子懸浮液浸泡處理葉片30 min;對照組使用等體積的無菌水處理。在處理組和對照組的葉片針刺處接種病原菌，同時設立經木霉孢子懸浮液處理后接種無菌瓊脂塊的葉片作為陰性對照。將接種葉片保濕密封后，置于黑暗環境下25℃培養24 h，之后分別接種2種病原菌菌餅，接種7 d后觀察侵染結果，使用十字交叉法測量病斑直徑以計算防病效果。

防病效果=（對照組病斑直徑-處理組病斑直徑）/對照組病斑直徑×100%。

1.9 數據分析

試驗所得數據均采用SPSS軟件進行方差分析和Duncan氏新復極差法多重比較。

2 結果與分析

2.1 菌株TKN1的鑒定

2.1.1 菌株TKN1的形態學觀察

將從山藥塊莖樣品中分離得到的菌株TKN1置于PDA培養基上，發現該菌株在25℃環境下生長迅速且旺盛，培養60 h后，菌落能夠完全覆蓋90 mm直徑的培養皿。初期菌絲呈白色，菌落長滿后均勻產生綠色或黃綠色的產孢簇，有時呈棉絮狀，不產生擴散性色素和氣味（圖1）。隨后有綠色分生孢子產生，分生孢子呈橢球形或球形。分生孢子梗直立，有時會產生瓶梗或二級分枝（圖1）。可育分枝的頂端通常有2～5個渦狀排列的瓶梗，瓶梗直或彎曲，中部明顯膨大。菌株TKN1的整體菌落形態特征與木霉基本一致［18］。

2.1.2 菌株TKN1的分子生物學鑒定

使用ITS和鈣調蛋白基因的通用引物對菌株TKN1進行PCR擴增，并對PCR產物進行測序，獲得了菌株TKN1的ITS序列（GenBank登錄號：PP973872）和鈣調蛋白基因序列（GenBank登錄號：PP977147）。隨后將這些測序序列提交到NCBI數

據庫進行BLAST序列比對，結果顯示菌株TKN1的ITS序列與數據庫中的擬康寧木霉序列的相似度為100%，鈣調蛋白基因序列的相似度為99.7%。

2.2 擬康寧木霉的生物學特性

pH對擬康寧木霉TKN1菌株生長的影響測試結果顯示，在pH為4～10的范圍內，擬康寧木霉TKN1均能正常生長（圖3）。特別是在pH=6條件下，其生長速度相對較快，菌落直徑在第2天時平均可以達到7.43 cm，幾乎覆蓋了培養皿的大部分面積。在不同的溫度條件處理下，擬康寧木霉能夠在18～30℃范圍內生長（圖3），其中25℃是其最適宜的生長溫度，菌落生長速度最快。在較低溫度4℃和較高溫度37℃下，擬康寧木霉的生長受到顯著抑制，菌落基本不生長。在光照條件方面，擬康寧木霉在L∥D=16 h∥8 h、L∥D=12 h∥12 h和L∥D=0 h∥24 h培養條件下均能生長（圖3），其中在光暗交替環境下，菌株的生長速率更快。雖然不同光照條件下，擬康寧木霉的菌絲生長速率有所不同，但總體影響并不顯著。擬康寧木霉在測試的5種培養基上都能生長，但在不同培養基上的菌絲生長速率和菌絲的疏密度有所差異，其中擬康寧木霉在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PSA）和蛋白胨培養基（PWCM）培養基中的生長速率最快，在水瓊脂培養基（WA）和察氏培養基（CZA）上生長較慢（圖3）。

2.3 擬康寧木霉對4種病原菌的拮抗作用

選取了4種山藥常見病原菌：膠孢炭疽菌、交鏈格孢、藤倉鐮刀菌和腐皮鐮刀菌，分別與擬康寧木霉TKN1進行了平板對峙試驗。對峙培養2 d后，觀察到擬康寧木霉菌落開始與病原菌接觸，導致病原菌菌絲邊緣的生長速度明顯減慢，甚至停止生長。對峙培養7 d時，擬康寧木霉的菌絲均已覆蓋了病原菌的一部分菌落（圖4）。測定結果顯示，擬康寧木霉對這4種病原菌的抑制率均超過84%（表1），其中對膠孢炭疽菌的抑制率最高，達到了88.32%。此外，擬康寧木霉的菌絲能夠覆蓋在其他病原菌的菌落上，并產生了一定數量的孢子，說明其對這些病原菌存在一定的寄生能力，但覆蓋面積未超過病原菌菌落的一半，且未導致病原菌顏色變化或明顯的菌落萎縮，因此覆蓋度等級判定為Ⅱ級。

2.4 顯微觀察擬康寧木霉的寄生作用

本研究以藤倉鐮刀菌為代表，收集了擬康寧木霉與其對峙培養5 d的樣品進行顯微觀察。結果顯示，擬康寧木霉的菌絲通過纏繞和消解的方式寄生于藤倉鐮刀菌的菌絲上，導致部分藤倉鐮刀菌的菌絲出現了消解現象（圖5），同時擬康寧木霉的存在能夠抑制藤倉鐮刀菌的菌絲正常生長。

2.5 擬康寧木霉發酵濾液的抑菌作用

使用擬康寧木霉TKN1的無菌發酵濾液對腐皮鐮刀菌、藤倉鐮刀菌、膠孢炭疽菌和交鏈格孢抑菌作用試驗結果顯示，混合培養基上病原菌的菌落大小明顯小于對照培養基，生長也不如對照組旺盛，菌落周圍的菌絲較為短小，菌落邊緣生長更加規則。進一步的測定結果顯示（表2），擬康寧木霉發酵濾液對藤倉鐮刀菌和交鏈格孢菌的抑菌率最高，分別達到了36.45%和22.17%。相比之下，對腐皮鐮刀菌的抑制效果最差，僅為13.37%。擬康寧木霉發酵濾液的抑菌活性不如對峙培養，可能是因為木霉對病原菌的直接抑制作用要大于其代謝產物對這些病原菌的影響。

2.6 擬康寧木霉的活體防病效果

為了進一步評估擬康寧木霉對山藥病害的防治效果，本試驗中測定了其孢子懸浮液處理山藥葉片和塊莖后的防病效果。

接種病原菌7 d后，對照組的山藥塊莖表面出現不規則近圓形的病斑，藤倉鐮刀菌侵染形成的病斑直徑為2.4 cm，顏色為深褐色，而膠孢炭疽菌形成的病斑直徑較小，為1.7 cm（圖6a）。相較于對照組，經擬康寧木霉處理的病斑直徑僅為 1.2 cm 和1.0 cm（圖6b），對藤倉鐮刀菌和交鏈格孢的防病效果分別達到49.0%和44.2%，顯示擬康寧木霉能有效抑制這些病原菌對山藥塊莖的侵染。

未經擬康寧木霉處理的山藥葉片在接種病原菌后7 d形成了不規則的深褐色病斑（圖7a），而經擬康寧木霉孢子懸浮液處理的葉片發病面積明顯較小，對膠孢炭疽菌和交鏈格孢的防病效果分別為58.7%和50.3%（圖7b），表明擬康寧木霉同樣能有效控制山藥葉部的病害。

3 結論與討論

山藥是一種傳統的藥食同源作物，在其生長的各個階段常面臨多種病原菌的侵染，進而引發長勢衰弱、產量銳減和品質下降等問題，嚴重制約了我國山藥種植業的健康發展［19］。在生產上，山藥病害防控高度依賴化學農藥，但長期使用容易導致農藥殘留、病原菌抗藥性增強及生態環境污染等嚴峻問題［20］。近年來，作為可持續農業的重要組成部分，生物防治技術受到日益關注。與傳統化學農藥相比，生物防治具有環保、高安全性和對非靶標生物影響小的特性，被視為推動農業綠色轉型的重要途徑之

一［21］。目前，已有一些生防菌應用于山藥病害的防治中，例如鏈霉菌、地衣芽胞桿菌和哈茨木霉對山藥炭疽病表現出良好的防治效果［22］。然而，面對山藥病害防控的復雜需求，高效生防資源的儲備仍顯不足，需要進一步擴展與深化。

本研究從山藥塊莖上分離獲得一株木霉菌株TKN1，通過形態學和分子生物學鑒定，確認為擬康寧木霉。擬康寧木霉TKN1對多種山藥病原菌表現出廣譜的抑菌作用，能有效抑制常見的幾種山藥病原菌，包括膠孢炭疽菌、交鏈格孢、腐皮鐮刀菌和藤倉鐮刀菌等，對峙培養試驗中，其抑制率超過了84%，顯示出較強的生物防治潛力。擬康寧木霉TKN1在不同的環境條件下（如pH、溫度、培養基等）展現出良好的適應性和快速的生長能力，尤其在適宜的溫度和pH條件下能迅速形成密集的菌絲網，有效競爭并抑制病原菌的生長，與文獻報道的特性相似［23］。此外，木霉難以引起病原菌的抗藥性，其復雜的作用機制包括競爭性抑制、生物殺菌物質的產生、寄生作用等，使其在病害防治中長期有效［24］。

木霉的抑菌機制是其用于生物防治的核心優勢之一。根據已有文獻報道，木霉能夠通過競爭性占據生存空間和營養資源、分泌抑制性代謝產物和寄生等多種機制抑制病原菌［25］。本研究中通過顯微觀察發現，擬康寧木霉TKN1的菌絲能有效纏繞并消解病原菌菌絲，進而破壞其結構并導致其死亡。這種寄生作用顯著降低了病原菌的侵染能力，同時減少了病害的發生和傳播［26］。此外，培養皿對峙試驗中觀察到，擬康寧木霉TKN1菌絲能快速生長并覆蓋病原菌菌絲，有效抑制病原菌的進一步生長和繁殖。這些發現表明，擬康寧木霉TKN1通過競爭性占據關鍵生存空間和營養資源，有效限制了病原菌的生長，展現了其在生物防治中的重要作用［27］。

木霉作為一種生防菌，在山藥病害防治中展示了一定的應用潛力，但其在實際應用中仍面臨一些挑戰和限制。為了擴大木霉的應用范圍并提升其效果，需要從以下幾個方面進行深入研究和探索：首先，優化木霉菌株的篩選和鑒定流程。目前，盡管已有多個木霉菌株被鑒定具有生物防治潛力［28］，但針對特定地域和作物病害的木霉菌株的篩選和鑒定仍需進一步深入，獲得更具針對性的高效菌株。其次，優化木霉的發酵工藝。木霉的生產效率和生物活性物質的效能直接影響到其實際應用的效果［29］，研究和優化適宜的發酵條件和培養基配方，是提高產量和活性的關鍵。第三，開發多功能的復合生物農藥。將木霉與其他抑菌機制互補的微生物相結合，形成協同增效的防控體系，以更加全面、持久地應對山藥病害的挑戰［30］。

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（責任編輯：田 喆）