基于eDNA宏條形碼技術的巢湖夏季魚類群落結構及多樣性

中圖分類號：S932.4 文獻標志碼：A 文章編號：1674-3075（2025）04-0229-09

淡水生態系統在小范圍內提供了高度的棲息地多樣性（Higginsetal，2021），它雖然占地球表面積不到 1% ，但卻承載著地球上約 12% 已知物種的繁衍生息（Dudgeon，2019）。魚類是水生生態系統中最多樣化的脊椎動物群，支持著關鍵的生態系統服務。然而，它們的種群越來越容易受到由人類直接或間接造成的影響，如棲息地破壞、過度捕撈、富營養化和污染等（Worm etal，2006;EmmettDuffy et al，2016）。魚類多樣性是生物多樣性的重要組成部分，研究魚類多樣性可以有效監測水生生態系統的健康狀況，對漁業資源保護、恢復和可持續發展具有重要意義（Phangetal，2019；Zou etal，2020）。

巢湖是中國5大淡水湖之一，位于長江中下游，地處安徽省中部，承擔著供水、防洪、航運、灌溉等多種功能，是長江經濟帶和長三角經濟圈的重要板塊。（Yuetal，2011；張方方，2014；Fangetal，2017）。近年來，巢湖周邊經濟的迅猛發展，導致巢湖流域生態、湖區水域環境日益惡化以及水生生物種群結構發生重大改變，包括魚類種類急劇減少、水土流失日益加劇、湖泊調蓄功能削弱等，這些問題的發展和蔓延導致巢湖生物群落結構趨向單一化，生態系統穩定性降低，嚴重影響了全流域經濟發展和環境保護（Kong etal，2013;Yang etal，2013;Yaoamp;He，2020）。

環境DNA（environmentDNA，簡稱eDNA）是指從環境（土壤、水、空氣等）而非單個有機體中收集的DNA片段的總和（Reesetal，2014）。而eDNA宏條形碼技術則是富集空氣、水體、土壤中等各種生物在活動場所中殘留于環境中的DNA，通過PCR擴增、高通量測序等一系列操作，實現對物種的識別鑒定（Ruppertetal，2019）。近年來，eDNA宏條形碼技術在水生生態系統中的應用涉及多種水體環境，包括池塘（Harperetal，2018）、湖泊（Tkachukamp;Dunn，2020；高婉茹，2022）、河流（Pontetal，2018）、海洋（王雪華，2021）。與傳統漁業資源調查（比如電魚、拖網、圍網）相比，eDNA宏條形碼技術整個過程不需要采集目標生物，以采樣方法簡單、檢測靈敏度高和對生物不具破壞性的優勢彌補了傳統物種監測的不足，在評估生物多樣性、確定物種分布、種群動態、生態系統健康等方面具有較強的應用潛能（Thomsenamp;Willerslev，2015）。本研究嘗試引入新興的eDNA宏條形碼技術來探究巢湖夏季魚類群落結構、多樣性及其與環境因子的關系，以期為巢湖水生生物監測以及生態保護提供新的技術手段，為今后長江流域開展漁業資源調查提供新思路。

1材料與方法

1.1樣點設置及eDNA樣品采集

2022年8月在巢湖設置15個采樣點進行水樣采集，從左至右分為3個湖區，分別為西湖區（CH1＼～CH5）、中湖區（CH6＼～CH10）、東湖區（CH11＼～CH15），具體采樣點信息見圖1。水樣采集使用采水器采集表層水和底層水各 10L ，混勻后取1L水樣保存至已消毒的1L廣口瓶中。采集后在 24h 內，使用 0.7μm 玻璃纖維濾膜（Whatman公司）進行過濾，1個采樣點共過濾3張濾膜，每張濾膜過濾水樣300mL ，同時過濾同等體積的純凈水作為陰性對照，將過濾的濾膜放入 2mL 滅菌離心管中，置于 _-40°C 冰箱，運回實驗室后立即放入， -80^°C 的超低溫冰箱。為盡可能減少DNA污染，采樣及過濾器具均使用 10% 的次氯酸消毒，操作人員在采樣及過濾過程中全程佩戴一次性手套，并在不同采樣點之間更換手套。每個濾膜DNA的提取采用OMEGA組織提取試劑盒按照說明方法進行，并將提取到的eDNA樣品迅速置于 -80^°C 保存備用。

1.2PCR擴增與高通量測序

本研究使用魚類通用引物Tele02F/R進行PCR擴增，擴增引物Tele02F： 5^′ -AAACTC-

GTGCCAGCCACC- ?3^′ ；Tele02_R： 5^′ -GGGTATCTA-ATCCCAGTTTG- ?3^′ 。擴增片段長度為 151～200bp 。PCR擴增體系 20μL：4μL 5× FastPfuBuffer， 2μL dNTPs（2.5mmol/L） ， 0.8μL 上下游引物 （5μmol/L） ，0.4μL FastPfu Polymerase，模 板DNA ，用 補至 20μL 。擴增條件： 95^°C 預變性 5min ：95^°C 變性 30s.55°C 退火 30s，72‰ 延伸 45s（35 個循環）；最后 72% 延伸 10min 。每個樣本進行3次重復PCR擴增，將同一樣本的PCR產物混合后用 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠提取試劑盒（AXYGEN公司）進行純化。陰性對照未擴增出目的條帶，將檢測合格的環境DNA樣本送至上海凌恩生物科技有限公司進行文庫構建，用IlluminaNova-SeqPE250平臺進行配對端測序 （2×250bp 。

原始測序數據以FASTQ格式保存，根據barcode得到所有樣品的有效序列，然后對reads的質量進行質控過濾（過濾reads尾部質量值20以下的堿基，丟棄質控后 50bp 以下的reads，去除含有模糊字符的、不能被組裝的reads）。使用UPARSE軟件，對優化序列提取非重復序列，去除沒有重復的單序列；按照97% 相似性對非重復序列（不含單序列）進行OTU聚類，在聚類過程中采用denovo和reference結合的方式去除嵌合體，得到OTU的代表序列；將所有優化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在 97% 以上的序列，生成OTU表格。采用Uclust算法對 97% 相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并分別在各個分類水平：域、界、門、綱、目、科、屬、種統計各樣本的群落組成。代表性OTU序列經魚類線粒體數據庫和凌恩生物構建的淡水魚類數據庫進行物種注釋分析，再結合巢湖魚類生物自建庫對所注釋物種進行人工校對并手動去除非魚類信息。

1.3環境因子的測定

在采樣過程中使用便攜式水深儀現場測定水深（Depth）、多參數水質測定儀YSI6600測定pH、水溫（WT）、鹽度（Sal）、溶解氧（DO）和濁度（Turb）等。其余理化指標回到實驗室后測定，其中測定溶解性總氮（DTN）使用堿性過硫酸鉀消解分光光度法；氨氮（NH₄⁺–N） 使用納氏試劑分光光度法測定；化學需氧量（COD）使用高錳酸鉀滴定法；總有機碳（TOC）使用總有機碳分析儀（王晨等，2022）。

1.4數據分析

本研究基于各采樣點的魚類物種序列豐度進行數據分析，所有數據預處理在Excel2019中完成，統計分析及作圖在R（version4.2.2）中完成，除熱圖需使用pheatmap包外，其余所有圖片均使用R的gg-plot2包制作。使用R中的vegan包計算Alpha多樣性指數（Shannon-Wiener指數、Simpson指數、Pielou均勻度指數），使用vegan包中的vegdist函數計算物種的Bray-Curtis距離；采用t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗進行Alpha多樣性組間差異分析，并用ggsigif包進行顯著性標記;使用R中的vegan包基于Bray-Curtis距離進行主坐標分析（PCoA），并結合置換多元方差分析（PERMANOVA）來檢驗不同湖區魚類群落結構差異是否顯著；使用vegan包進行RDA分析，解析魚類群落結構與環境因子的關系，并運用蒙特卡洛置換檢驗（MonteCarlo）分析環境因子對魚類群落影響的顯著程度。采用Origin2023繪制巢湖優勢魚類物種組成圖。Alpha多樣性指數（Shan-non-Wiener指數、Simpson指數、Pielou均勻度指數）計算公式如下：

式中： H 為Shannon-Wiener指數； P_i 為物種 i 的個體數占總個體數的比例； D 為Simpson指數； J 為Pielou均勻度指數；S為物種總數。

2結果與分析

2.1魚類物種組成

巢湖eDNA樣品高通量測序后獲得高質量序列9504070條，按照 97% 相似性聚類后得到7040個OTUs，平均序列長度為 170.89bp ，在數據庫中匹配到魚類48種，隸屬于7目13科39屬（表1），包含5種在巢湖從未報道過的魚類物種，其中15個樣本中共有3609886reads序列數無法注釋到種的分類學水平，占比 37% 。在目分類水平中，鯉形目種類最多，共計35種，約占檢測總數的 72.92% ；其次是鱸形目6種，占 12.5% ；鲇形目和頜針魚目各2種，約占 4.17% ；而鮭形目、鯡形目和鰻目均僅有1種，約占 2.08% 。

2.2巢湖魚類多樣性

巢湖不同湖區魚類 a 多樣性指數如表2所示。Shannon-Wiener指數為 0.743～2.281 ，平均值為1.710±0.375 ;Simpson指數為 0.348～0.860 ，平均值為0.696±0.140 ;Pielou均勻度指數為 0.221～0.677 ，平均值為 0.504±0.112 。Shannon-Wiener、Simpson 和Pielou均勻度指數最高值均出現在CH15采樣點，表明該采樣點的魚類物種多樣性較高。巢湖不同湖區魚類的3種多樣性指數分布趨勢基本相同，且差異均不顯著（圖2）。

基于各采樣點魚類種水平的分布熱圖（圖3）可知不同采樣點間魚類物種組成存在差異，鳙（Aris-tichthysnobilis）和刀（Coilianasus）的相對序列豐度和分布頻率最高。由圖4可知相對豐度前10位的優勢魚類物種分別為、刀、翹嘴（Culteralbur-nus）、鯉（Cyprinuscarpio）、鯽（Carassiusauratus）、鰱（Hypophthalmichthysmolitrix）、達氏（Chanodich-thysdabryi）、張氏（Hemicultertchangi）、團頭魴（Megalobramaamblycephala）、似（Toxabramisswinhonis）。

對巢湖不同湖區魚類群落組成進行PCoA分析（圖5），結果顯示，2個主坐標對魚類群落組成差異的解釋度為 62.35% 。東湖區樣本點之間距離相對較遠，表明東湖區各樣本的魚類群落組成差異較大；西湖區樣本點之間距離較近，且有聚集趨勢，表明西湖區各樣本的魚類群落組成相似。PERMANOVA檢驗表明，巢湖不同湖區魚類群落結構差異不顯著 （R²=0.13 ，P=0.53gt;0.05 。

2.3巢湖魚類群落與環境因子關系

對魚類物種數據“Hellinger\"轉換后進行去趨勢對應分析（DCA），根據分析結果第一排序軸 lt;3 ，故選用RDA模型。在冗余分析（RDA）前對18個環境因子進行預選，刪除共線性強的環境因子，最后保留的10個環境因子（Depth、WT、Turb、COD、 NH₄⁺ -N、DO、pH、DTN、TOC、Sal）VIF值均小于10。如圖6所示，前2軸累計解釋變化率為 51.97% 。在RDA1軸上，NH₄⁺ -N和DTN呈負相關，其余因子呈正相關。在RDA2軸上，Sal、Depth、DTN呈正相關，而其余因子呈負相關。蒙特卡洛置換檢驗分析結果表明 NH₄⁺ -N（F=4.2436，P=0.001） 對魚類群落結構具有極顯著影響（Plt;0.01） ，WT（F=2.0486，P=0.039） 和D ）（F=1.9169 .P=0.041） 對魚類群落結構具有顯著影響 （Plt;0.05） ，其余環境因子對其影響不顯著 （Pgt;0.05 ）。

3討論

3.1基于eDNA宏條形碼技術的巢湖魚類物種組成及多樣性

對巢湖漁業資源的調查最早始于20世紀50年代末60年代初，此后陸續有學者對其進行研究。1987年調查記錄了巢湖湖區魚類85種（王岐山，1987），2005年巢湖湖區魚類54種（過龍根，2005），2016年采集到巢湖流域河流魚類47種（錢紅等，2016）。以上研究都是通過傳統漁業資源調查方法完成的，不僅耗時費力，還會影響漁業資源發展，破壞水生生態系統的穩定性（李曉玲等，2022）。本研究利用eDNA宏條形碼技術調查分析了巢湖夏季魚類物種組成和多樣性，共檢測到48種魚類，以鯉形目魚類為主，這與梁陽陽等（2022）通過傳統漁業資源調查方法監測到的結果較為吻合。研究結果表明，通過eDNA宏條形碼技術檢出的魚類物種與傳統調查方法監測到的物種在很大程度上吻合，并檢測到2種在巢湖歷史記錄中存在，但是近年文獻報道中傳統調查方法均未捕獲到的物種，分別為赤眼（Squalio-barbuscurriculus）和唇（Hemibarbuslabeo）。說明eDNA宏條形碼技術可以有效實現魚類監測，作為未來探究巢湖魚類組成的輔助手段。此外，eDNA宏條形碼技術還檢測出了5種未報道過的魚類，分別為張氏、汪氏近紅（Ancherythroculterwangi）、斜方（Acheilognathusrhombeus）、斑鱖（Siniperca scher-zeri）、大口黑鱸（Micropterussalmoides）。這5種魚在長江水系均有分布，在巢湖檢出可能是由于含有其DNA的長江水體通過裕溪河流至巢湖，因為環境DNA可以在水體中存在幾天到幾周的時間；或者是采樣點附近存在住宅，居民們將含有魚類DNA的廢水直接排放到湖內；也有可能是部分采樣地點位于航道附近，往返漁船排出的水中存在上述魚類DNA，在采樣過程中被采集檢出；又或者是由于物種注釋有誤。這些因素都會造成對巢湖真實魚類多樣性的誤判，但其是否在巢湖真實存在，有待進一步的調查研究。歷史記錄存在的黃鱔（Monopterusalbus）、中華螃（Rhodeussinensis）、圓尾斗魚（Macropodusocellatus）、烏（Ophiocephalusargus）等未檢測到，這可能與魚類生活習性不同有關，如黃鱔（Monopterusalbus）等穴居種類不易被檢測到，也有可能是環境DNA在水體中的降解；比對數據庫不完善；采樣、提取和儲存過程中受到污染及通用引物存在局限性造成的。由此可見eDNA宏條形碼技術自身也存在缺點，不能完全代替傳統調查方法，但可以作為一種補充手段，減少傳統監測對巢湖生態系統造成的不良影響，將二者結合可更完整地反映巢湖魚類多樣性及其空間分布（王汝賢等，2023）。

魚類群落結構組成差異性正在成為生態系統功能的關鍵驅動因素，為生物保護提供信息（Lamyetal，2021）。本研究中， a 多樣性分析結果顯示巢湖不同湖區魚類群落結構不存在顯著差異。 a 多樣性指數（Shannon-Wiener指數、Simpson指數、Pielou均勻度指數）最高值均出現在CH15采樣點，這個采樣點位于巢湖與柘皋河交匯處，且與裕溪河距離較近，河湖水系連通有利于河流與湖泊之間生物的交換，提高水資源優化配置、改善河湖健康狀態，這可能是該點位魚類多樣性較高的原因（毛志剛等，2019）。PCoA分析表明不同采樣點魚類群落結構呈現一定的差異性，巢湖東湖區的魚類群落物種組成差異較大；西湖區群落物種組成相似；中湖區與東湖區之間存在明顯交叉，說明群落物種組成與東湖區相似性更高。PERMANOVA檢驗結果顯示巢湖不同湖區魚類群落結構差異不顯著 （Pgt;0.05） ，這與 a 多樣性分析結果一致。

3.2環境因子對巢湖魚類群落結構的影響

魚類群落結構受生物因素和非生物因素的雙重影響，與環境因子之間的關系在不同規模和生態系統類型之間差異顯著（Rotherhametal，2011；Larsonetal，2013）。相關研究表明，水溫、水深、總磷、總氮、pH、溶解氧等環境因子對湖泊魚類群落分布均存在一定影響（程琳，2011；劉燕山等，2021）。劉鵬飛等（2022）在固城湖魚類群落結構的研究中表明總氮、高錳酸鹽指數和濁度對魚類群落結構的時空差異有顯著性影響。Zhang等（2019）利用eDNA技術調查研究長江口及其鄰近水域的魚類多樣性，結果顯示水溫、鹽度和溶氧是影響季節間魚類組成差異的主要環境因子。王銀肖等（2022）在研究中表明影響白洋淀魚類群落的主要環境因子是水溫、DO和Chl-a。本研究通過RDA分析得出，氨氮 （NH₄⁺–N） 對巢湖魚類群落結構具有極顯著影響 （Plt;0.01） ，水溫（WT）和溶解氧（DO）對巢湖魚類群落結構具有顯著影響 （Plt;0.05） ，其余環境因子（DTN、TOC、pH、Depth、Sal、Turb、COD）影響不顯著 （Pgt;0.05） 。氨氮是水環境中一個重要的污染指標，是藻類必需的一種營養元素（李月萍，1998）。水體中氮含量發生變化，會導致水質發生改變，能直接或間接影響魚類生長、繁殖。水溫會直接影響魚類的新陳代謝強度，從而影響到魚類生活的各個方面；對魚類性腺發育也存在一定影響，夏季水溫升高，性成熟年齡提前，會減少懷卵和排卵量。溶解氧可以促進水體中物質的良性循環，反映棲息地的適宜性（宋超等，2022）。巢湖是典型的富營養化湖泊，夏季氣溫升高，水體中藍藻數量也會增多，會導致溶解氧含量減少，水環境中溶解的差異會影響浮游動物群落的大小和分類，對以浮游動物為主要食物來源的魚類，如鰱、鳙、幼齡刀等影響較大。本研究中，巢湖以鳙、刀的OTUs序列豐度相較于其他魚類更高，這可能也是溶解氧成為影響魚類群落結構主要環境因子的原因。

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（責任編輯 熊美華 崔莎莎）

Summer Fish Community Structure and Diversity in Chaohu Lake Based on eDNA Metabarcoding Technology

LIU Chengfeng1.2， YAN Yunzhi1， HAN Shengpan2， ZHANG Jiahe23， XIE Ping2， CHEN Jun2， XIA Wulai2

（1. Collaborative Innovation Center of Recovery and Reconstruction of Degraded Ecosystem in Wanjiang Basin Co-founded by Anhui Province and Ministry of Education， School of Ecology and Environment， Anhui Normal University， Wuhu 2410oo， P.R. China ; 2. Donghu Experimental Station of Lake Ecosystems， Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430072， P.R. China; 3. College of Ocean Science，Agricultural University of Hebei， Qinhuangdao O66000，P.R. China）

Abstract： In this study， we explored fish community structure， diversity and its relationship with environmental factors during summer in Chaohu Lake （Hefei， Anhui Province） using eDNA metabarcoding and redundancy analysis （RDA）.We aimed to provide a new technical means of monitoring and protecting fish resources in Chaohu Lake，and provide new insights for fish resource investigation in the Yangtze River basin. In August 2O22，water samples at 15 sampling points of three different areas in Chaohu Lake were collected for eDNA high-throughput sequencing，as wellas for the determination of water environment parameters.A total of 7 040 OTUs were obtained， with an average sequence length of 170.89 bp， whichidentified48 fish species inthedatabase，belongingto39 genera，13families，7ordersandalso including two species （Squaliobarbus curriculus and Hemibarbus labeo）， which were not collected by traditional survey methods reported in the literature over the past 10 years.Cypriniformes （35 species） were the dominant group， accounting for 72.92% of the total number of detected fishes.Aristichys nobilis and Coilia nasus were the dominant species. The average values of the Shannon-Wiener， Simpson and Pielou evenness indices of the 15 sampling points were， respectively， 1.710±0.375 ， 0.696±0.140 and 0.504±0.112 The spatial differences in fish community diversity was not significant in Chaohu Lake， with similar distributions in all three lake areas. Principal coordinate analysis （PCoA）and permutation multivariate analysis of variance （PERMANOVA） showed no significant diferences in fish community structure among the three areas of Chaohu Lake （ R²=0.13 ， P=0.53 ）. Redundancy analysis shows that ammonia nitrogen， water temperature and dissolved oxygen significantly affected fish community structure in Chaohu Lake （Plt;0.050） ）. Our research demonstrates that eDNA metabarcoding technology is feasible and very useful for monitoring fish resources in Chaohu Lake.

Key words： eDNA metabarcoding technology; fish diversity; community structure; environmental factors; ChaohuLake