C5-12啟動子降低rAAV1介導的基因遞送后轉基因的免疫反應

中圖分類號：Q78 文獻標志碼：A 文章編號：1000-5013（2025）04-0435-07

C5-12 Promoter Reduces Transgene Immune Response Following rAAV1-Mediated Gene Delivery

WANG Xiao1，HUANG Xiaoping2，LI Ling1 ，ZHANG Hong1， DIAO Yong1

（1.School of Medicine，Huaqiao University，Quanzhou 362o21，China; 2.College of Chemical Engineering and Materials Sciences，Quanzhou Normal University，Quanzhou 362ooo，China）

Abstract：The eficacy of the C5-12 promoter in reducing or abolishing the immune response against ovalbumin （OVA） was explored through experiments such as determination of transgene expression，in vitro antigen presentation，and the clearance of transduced positive cells.The experimental results showed that in mouse myoblasts C2Cl2，the C5-12 promoter had no impact on the expresson of OVA，while in mouse bone marrow dendritic cells JAWS I ，the C5-12 promoter significantly inhibited both the expression of OVA and the presentation of OVA antigenic peptides. After muscle administration，the C5-12 promoter could maintain the continuous high expression of OVA in muscle tissues，the humoral immunity remained at a relatively low level， the immune response in muscle tissues was relatively mild，and the clearance of transduced positive cells was significantly reduced.

Keywords：C5-12 promoter；recombinant adeno-associated virus （rAAV）；immune response； transgene;ovalbumin （OVA）

在傳染性疾病的防治領域，骨骼肌已成為外源性生產、分泌相關治療藥物極具吸引力的靶向組織之二[1]。重組腺相關病毒（rAAV）具備無致病性、低免疫原性、介導外源基因長期表達等多重優(yōu)勢特性，且宿主范圍廣泛。因此，rAAV成為當下基因治療領域最具發(fā)展?jié)摿εc前景的載體[2-7]。大量研究表明，rAAV具備在多種組織（肌肉組織尤為典型）中進行轉基因傳遞和表達的能力[8」。最近，rAAV的應用范疇得到進一步拓展，rAAV被用于表達外源廣譜中和抗體，或者修飾CD4-Igs，旨在預防艾滋病[9-11]、丙型肝炎[12]、瘧疾[13]和流感[14]等感染性疾病。然而，這些方法存在的主要局限是rAAV介導的基因遞送可導致轉基因特異性免疫反應[15]，甚至進一步引發(fā)針對內源性蛋白的自身免疫現(xiàn)象[16-17]。

抗原呈遞細胞（APC）的不良轉導是轉基因誘導的免疫反應的一個眾所周知的原因，它會觸發(fā)宿主對 rAAV 表達的轉基因產物的免疫[18-19]。在專職 APC（如樹突狀細胞（DC）、巨噬細胞和 B淋巴細胞）中，DC 是宿主中最重要的細胞類型，有著最廣泛的抗原呈遞范圍。因此，rAAV轉導DC可促使轉基因肽表位展示于MHCI類分子上，進而激活細胞毒性 CD8+T 淋巴細胞（CTL）來清除表達外源蛋白的細胞。C5-12啟動子最初是在篩選C2C12肌管中的轉基因表達時發(fā)現(xiàn)的，它能啟動基因在肌肉細胞中實現(xiàn)高表達，并在質粒載體轉導肌肉組織的實驗中得到證實[20-21]。此外，C5-12 啟動子已被證明在轉基因動物中具有肌細胞特異性，使用它不僅可以達到與傳統(tǒng)巨細胞病毒（CMV）啟動子驅動的表達系統(tǒng)相當的F.IX表達水平[22]，還能限定轉基因在肌肉組織中表達，消除轉基因誘導的免疫反應。基于此，本文構建新型重組rAAV載體rAAV-C5-12-OVA，并對其在小鼠體內的作用效果進行分析。

材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、小鼠成肌細胞C2C12、胎牛血清（武漢市普諾賽生命科技有限公司）；小鼠骨髓樹突狀細胞JAWS ⅡI（深圳市賽奧斯科技有限公司）;聚乙烯亞胺（PEI，美國 Polysciences 公司）；卵清蛋白（OVA）、人抗卵清蛋白 IgG 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（上海市瑞番科技有限公司）。

1.2rAAV載體的構建與制備

依據實驗室建立的三質粒包裝系統(tǒng)進行rAAV的包裝。首先，將 293T 接種于 15cm 培養(yǎng)皿中，進行為期3d的培養(yǎng)，待細胞密度達 85% ，將轉基因質粒、衣殼質粒和輔助質粒按照 1：1：3 的摩爾比與PEI充分混合，靜置 10min 后，添加至培養(yǎng)皿中，轉染持續(xù) ⁶h 后，更換為完全DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至 ^72h 后，收獲細胞。然后，超聲破碎細胞、全能核酸酶（Benzonase）消化，采用氯化銫梯度離心法對rAAV進行分離，通過透析密度梯度離心進一步純化rAAV，從而獲得符合實驗要求的rAAV載體。最后，對rAAV進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）分析。

1.3 OVA和抗OVA抗體質量濃度的測定

采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法對細胞培養(yǎng)上清、血清中OVA 和血清中OVA抗體進行檢測，具體操作嚴格遵守說明書的流程。首先，酶標板中加入 100μL 的OVA抗體或OVA，室溫孵育 ^10h 后，吸出液體，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次。然后，將 100μL 細胞培養(yǎng)上清或血清，與標準品分別加入酶標板中，室溫孵育 ，吸出液體，含Tween2O的磷酸鹽緩沖液（PBST）漂洗3次。接著，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的OVA抗體或抗OVA抗體的抗體，室溫孵育 ¹h ，吸出液體，PBS漂洗3次。最后，加人 100μL 的 3，3^′，5，5^′ -四甲基聯(lián)苯二胺（TMB）于室溫顯色 30min ，待顯色反應充分后，加入50μL 1mol?L^-1 的 H₂SO₄ 終止反應，隨即使用酶標儀讀取吸光值 （D（450）） 。依據預先繪制的標準曲線，精確計算得出OVA及其抗體的質量濃度。

1.4 體外轉染

C2C12在含有胎牛血清（FBS，體積分數為 10% ）和青霉素/鏈霉素（體積分數為 1% ）的DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。后續(xù)使用PolyJet轉染試劑將質粒pAAV-CMV-OVA、pAAV-C5-12-OVA 轉染至C2C12;JAWSI培養(yǎng)在含有FBS（體積分數為 10% ）、鼠 ）、谷氨酰胺（ （4mmol ·L^-1 ）的 αααααα_{ΓαΓαΓαΓαΛΛΩ} 中，培養(yǎng)至合適階段后，收獲 2.0×10⁶ 個細胞，在室溫下重懸于 100μL 電轉緩沖液里，再加入pAAV-CMV-OVA、pAAV-C5-12-OVA，將混合樣品加人電擊轉化杯中，并選擇相應的程序進行電轉，電轉操作完成后繼續(xù)培養(yǎng) 3d 。最后，收集細胞培養(yǎng)上清液，測定OVA質量濃度。

1.5 DC體外對OVA抗原遞呈分析

首先，用pAAV-CMV-OVA和pAAV-C5-12-OVA質粒分別電轉JAWSII，將電轉質粒 ^12h 后的JAWS I 和B3Z雜交瘤細胞按 1：1 個數比進行混合。然后，每孔接種 1×10⁵ 個細胞到12孔板中，在37C，CO₂ 體積分數為 5% 的條件下繼續(xù)培養(yǎng) 24h 。接著，收集細胞，棄培養(yǎng)上清，PBS漂洗2次，加入0.5mL 氯酚紅 ?βd -吡喃半乳糖苷（CPRG）底物緩沖液，待溶液變黃后，酶標儀讀取吸光值（ （D（570）） ，或在細胞中加入X-Gal染色液進行染色，待細胞形成藍色產物，進行拍照，并統(tǒng)計陽性細胞數目。

1.6 動物實驗

雄性 C57BL/6 小鼠 （8～10 周齡）購自中國科學院上海實驗動物中心，為了保障實驗動物的健康狀況，將其飼養(yǎng)于獨立通風籠具（IVC）系統(tǒng)之中。設置對照組與實驗組，每組包含了3只小鼠。其中，對照組的小鼠在脛骨前肌部位注射rAAV1-CMV-OVA，注射劑量為每只小鼠 1×10¹¹ 病毒基因組；實驗組的小鼠在脛骨前肌部位注射rAAV1-C5-12-OVA，注射劑量為每只小鼠 1×10¹¹ 病毒基因組。

在完成注射操作1周后，通過眼球靜脈叢進行采血，采集的血液收集至BD微量血清分離管內，之后每隔1周進行一次采血操作，如此持續(xù)至完成注射后的第12周。收集的血液樣本將用于后續(xù)分析OVA質量濃度。

1. 7 數據統(tǒng)計

數據用平均值士標準偏差（ （x±s） 表示；結果采用SPSS統(tǒng)計學分析， ? 表示差異具有統(tǒng)計學意義（ Plt;0.05） ；**表示差異具有高度統(tǒng)計學意義（ Plt;0.01 ）；ns表示差異不具有統(tǒng)計學意義 ?Pgt;0.05） 。

2 實驗結果與分析

2.1C5-12啟動子對轉基因在不同細胞中表達的影響

為了驗證構建的載體在細胞中表達情況，將質粒pAAV-C5-12-OVA、pAAV-CMV-OVA分別轉染至C2C12和JAWSⅡ細胞，并用ELISA 法測定OVA表達量（OVA質量濃度， ρ^（OVA） ），結果如圖1所示。由圖1可知：經 pAAV-CMV-OVA轉染，JAWSI、C2C12中OVA質量濃度分別為213.3、453.5ng?mL^-1 ;經pAAV-C5-12-OVA 轉染，JAWS I 中OVA質量濃度僅為 18.6ng?mL^-1 ，而在C2C12中OVA質量濃度為 405.2ng?mL^-1 。

因此，C5-12啟動子不影響OVA在C2C12細胞中的表達，卻使轉基因在JAWS I 細胞的表達效率大幅降低，凸顯了C5-12啟動子的組織特異性。

2.2 C5-12啟動子對OVA抗原遞呈的抑制

B3Z 細胞作為一種 CD8+T 細胞的雜合瘤細胞，具備特異性識別小鼠KbMHC-I類分子上遞呈的OVA抗原肽殘基257-264（SIINFEKL）的能力。與此同時，B3Z 細胞含有受IL2增強子的活化T 細胞核因子（NFAT）元件轉錄控制驅動的LacZ報告基因，一旦APC細胞遞呈的抗原被 B3Z 細胞識別，便會觸發(fā)LacZ基因的表達，因此，B3Z細胞成為檢測APC 細胞通過MHC-I類途徑遞呈OVA抗原的關鍵細胞。用 pAAV-C5-12-OVA、pAAV-CMV-OVA轉染JAWSⅡ細胞后，將其與 B3Z 細胞共培養(yǎng)。

活化的B3Z細胞原位染色，如圖2所示。對活化的B3Z細胞進行 β 半乳糖苷酶定量分析，結果如圖3所示。由圖2、3可知：經LacZ原位染色后，轉染pAAV-CMV-OVA組中表達 β^- 半乳糖苷酶的 B3Z細胞明顯增多，轉染pAAV-C5-12-OVA組中活化的B3Z細胞則明顯減少;CPRG底物顯色結果與原位染色結果基本一致，轉染pAAV-C5-12-OVA 組的吸光度明顯小于轉染 pAAV-CMV-OVA組。

因此，pAAV-C5-12-OVA在JAWSⅡ細胞中的OVA表達量大幅降低，進而使遞呈到細胞膜表面的SIINFEKL抗原肽顯著減少，進一步說明了C5-12啟動子的特異性。

2.3C5-12啟動子對OVA表達和抗體形成的影響

小鼠血清中的OVA和OVA抗體形成的經時曲線，如圖4、5所示。圖4、5中： Ψ_t 為時間； ρ（OVA 抗體）為OVA抗體的質量濃度。

由圖4、5可知：注射rAAV1-C5-12-OVA的小鼠，其循環(huán)系統(tǒng)中產生高水平且持續(xù)穩(wěn)定的OVA表達，與此同時，OVA抗體（IgG）水平非常低;注射rAAV1-CMV-OVA的小鼠在治療后2周，循環(huán)系統(tǒng)中OVA質量濃度出現(xiàn)急劇下降的態(tài)勢，并且隨著時間的推移，這一現(xiàn)象還伴隨著OVA抗體水平的持續(xù)攀升。

因此，通用的CMV啟動子使OVA轉基因引發(fā)機體免疫反應，而將C5-12啟動子整合到OVA表達盒中，能夠有效規(guī)避這種因轉基因誘發(fā)的免疫。

2.4C5-12啟動子減少轉導細胞清除

為進一步對肌肉注射rAAV后轉導陽性細胞的狀況予以驗證，對小鼠脛骨前肌經過固定、 Hamp;E 染色，分析肌肉組織中rAAV基因組的情況。

rAAV1-OVA肌肉注射后組織 H^amp;.E 分析，如圖6所示。由圖6可知：注射rAAV1-CMV-OVA的小鼠肌肉中出現(xiàn)了大量炎癥細胞浸潤的現(xiàn)象，直接導致rAAV轉導細胞被清除。

經過qPCR分析，可得肌肉組織每微克DNA中OVA基因拷貝數 （n） ，結果如圖7所示。由圖7可知：rAAV1-CMV-OVA組每微克DNA中OVA基因拷貝數為 58±2 ，而rAAV1-C5-12-OVA組每微克DNA中OVA基因拷貝數為 1358±25 。這一基因拷貝數的分析結果與 Hamp;E 染色結果一致，即炎癥細胞的浸潤及體內循環(huán)的OVA抗體共同作用促使轉導陽性細胞被清除，而C5-12啟動子則展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢，它能夠有效減弱免疫反應，抑制轉導陽性細胞的清除和OVA抗體的產生。由此證明特異性啟動子是降低轉基因誘導的免疫反應的一種有效方式。

3討論

rAAV是一種非常有前途的載體，能將治療性基因遞送至多種組織，為單基因疾病治療開辟新路[23-25]，其安全性和有效性均已在臨床前和臨床研究中得到證實[26-29]。肌肉是rAAV載體介導的基因治療非常有吸引力的靶組織，是神經肌肉疾病、代謝紊亂和血友病基因治療的靶組織[27，30-32]，因為它易于接近且富含血管血液供應，為分泌的蛋白質提供了有效的運輸系統(tǒng)。然而，rAAV肌內遞送后，常引發(fā)機體針對轉基因產物的免疫反應，致使轉導細胞被清除，基因表達的喪失[33]，因此，開發(fā)防止轉基因產物誘導免疫反應策略成為研究熱點。目前，臨床多靠免疫抑制藥物規(guī)避，可這些藥物副作用多、易引發(fā)并發(fā)癥[31-34]，難以保證預期效果，如杜氏肌營養(yǎng)不良癥臨床試驗盡管使用了免疫抑制，但在rAAV載體肌內遞送后仍有一定程度的免疫反應發(fā)生[35-36]。探究根源，轉基因誘導的免疫毒性主要由于抗原呈遞細胞的不良轉導，隨后觸發(fā)宿主對 rAAV表達的轉基因產物的免疫反應[37-39]，故避免APC 中表達轉基因產物已成為研究者的共識。

C5-12啟動子在削減針對rAAV肌肉內遞送所產生的轉基因產物免疫反應層面潛藏的巨大潛力，C5-12 啟動子展現(xiàn)出高度的肌肉特異性，在肌肉細胞中可大量表達轉基因，而在APC中表達量大幅降低。因此，肌肉中轉基因表達得以維持，保障治療效果。同時，OVA抗體水平明顯下降，免疫反應得到有效遏制，肌肉組織中細胞浸潤明顯減少。綜上所述，文中的基因治療方法像“安全鎖”一樣適配肌內rAAV載體基因傳遞，可防控免疫風險，為開發(fā)更安全、有效的rAAV基因藥物提供了新思路。

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（責任編輯：錢筠 英文審校：劉源崗）