浙江柑橘碎葉病的發生、分布及其病原物的遺傳多樣性分析

中圖分類號：S666；S436.66 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2025）06-1269-12

Abstract： 【Objective】 Citrus tatter leaf disease is a viral disease that harms citrus trees.Currently，it is showing an increasing trend of spreading and causing plant weakness，death，and even large-scale destruction of orchards. It has become an important obstacle to the sustainable development of the citrus industry.The aim of this study was to clarify the occurrence and distribution of citrus tatter leaf disease in Zhejiang Province，as wellas the diversity and genetic differentiation of its pathogen，and to explore the origin and evolution of citrus tatter leaf virus （CTLV）.【Methods】From 2019 to 2022，we continued to investigate the occurrence of citrus tatter leaf disease through observing and recording the symptoms of the disease in various citrus production areas in Zhejiang Province.The 46 citrus varieties included Ehime Kashi No.28，Haruka，Mantouhong，Himekoharu etc. For the detectionof citrus tatter leaf virus， total RNA of the samples was extracted， and RT-PCR amplification was performed with specific primers. The amplification results were detected by agarose gel followed by observation and photography. The target band on the agarose gel was cut off and then the PCR products were recovered using a DNA gel recovery kit folowed by a bidirectional sequencing. After aligning the obtained sequences， the similarity of the nucleotide and amino acid sequences of the coat protein genes from diferent samples

WeIt aHaIyzcu. AII uIu sequUHUC IUIauUII WeIt suUueu ItU UUHDaIK WeUsIt aIu WeIc aIsU uscu to construct a phylogenetic tree using the neighbor-joining method of MEGA 5.05 software.【Results】 The results of field investigations showed that the symptoms of citrus tatter leaf disease were generally similar among different citrus varieties.The infected trees usually grew slower and the tree vigor was weaker than the healthy trees. The leaves of the diseased tree showed a systematic slight yellowing at the initial stage and gradually worsened. In the later stages，the leaves became severely yelowed and gradually fell offrom the tree，resulting in few or even no fruits.Finally，the entire tree died. When the diseased trees were subjected to strong winds or external forces，the graft union of diseased trees was prone to break，and the cracking surface was smooth. Out of the 951 collected citrus samples，311 samples were infected with the disease， with a positive detection rate of 32.70% . Apart from Huzhou city， the disease was found to be widely distributed in various citrus production areas in Zhejiang Province. There were also significant differences in the positive detection rates among different counties or districts within the same region.Froma variety perspective，out of the tested 43 citrus varieties，27 showed positive results. The positivity rate of Tangor type was 48.54% ， significantly higher than the Tangelo type （12.33% ），Pummelo type（ （16.54% ），Tangerine type （16.22% ），andMandatory type （13.85% ）， while the positivity rate of Grapefruit type was relatively low. Within the same type，there were also significant diffrences in the positivity rates of different cultivars.The constructed phylogenetic tree based on the coat protein gene sequence of CTLV showed that allthe 144 isolates were clearly divided into two major branches.The first major branch contained 98 isolated samples，and the second contained 46 isolated samples.From the perspective of townships，the isolates from 31 townships distributed in the first branches，while 21 townships samples distributed in the second branches，and the isolates from 16 townships distributed in both branches.From the perspective of counties，15 and 10 counties-isolates distributed in the first and second branches，respectively，and the isolates from 8counties distributed in both branches.From the perspective of cities，the first major branch included the isolates from all of the 8 cities in Zhejiang Province，while the second included the isolates from 6 cities.The two major branches were further divided into 12 secondary branches，and the collected samples from Zhejiang Province were distributed in every branch.The samples collected from Taizhou City were also widely distributed in multiple secondary branches.From the perspective of citrus cultivars，among the isolates from 46 citrus cultivars，the isolates from 36and 22 cultivars had clustered in the first and second major branch，respectively. The isolates from 12 cultivars had distributed in both branches.Among them，36 and 21 isolates of the most abundant variety，Ehime Kashi No.28，had clustered in the two major branches，respectively. From the perspective of the citrus types，10 citrus types were distributed in the first major branch，while the second included 9 types.Among them，the distribution number of the isolates of Tangor type which had the highest quantity were 55 and 26 in the two major branches，respectively. 【Conclusion】 The occurrence of citrus tatter leaf disease was common in citrus production areas in Zhejiang Province，and it widely harms different citrus types and cultivars.The pathogen population showed rich genetic diversity， but there was no obvious correlation between its differentiation and geographical isolation or host varieties.The results of this study would provide areference for further exploration of the origin，systematic evolution and pathogenic differentiation of the CTLV.At the same time，it sems to be possble that the proper procedure of variety introduction and nursery tree transportation would be the key to prevent the occurrence of the disease.

Key Words： Citrus tatter leaf disease; Occurrence; Distribution; Detection; Coat protein gene; Genetic diversity

柑橘病毒類病害是指由病毒和類病毒等病原物侵染柑橘引起的一類病害，世界上已報道的此類病害有80余種，具有易傳播擴散、常潛伏侵染、復合侵染率高、樹體終生帶毒、危害周期長和難以防治等特點[-2]，而柑橘衰退病、柑橘碎葉病、柑橘裂皮病、溫州蜜柑萎縮病、柑橘黃脈病等在中國發生較為普遍，其中尤以柑橘碎葉病危害嚴重。自1962年首次在從中國引進到美國加州的北京檸檬上發現該病害以來，目前已廣泛分布在中國、美國、日本、澳大利亞和南非等多個柑橘主產國[4。

浙江柑橘碎葉病最早于20世紀70年代由日本防疫所在從黃巖引進的本地早、乳橘、碰柑等品種上發現，80年代中期，張天淼等通過指示植物鑒定出在黃巖栽培的本地早、幔橘、乳橘、早橘等10個品種感染柑橘碎葉病。90年代初，謝佩華等又在溫州地區的柳橙、柱柑、四季柚等8個品種上檢測到柑橘碎葉病。此后，陸續有關于浙江省柑橘碎葉病的研究報道。盡管如此，或是因為多數柑橘品種存在隱癥現象、葉片黃化易與生理性病害相混淆、嫁接口處“腫大\"癥狀常被視為砧穗不親和等，柑橘碎葉病在生產中未引起人們足夠的重視。近年來，隨著紅美人等優新雜柑品種的興起，苗木的不規范化繁育和無序調運問題愈發突出，致使柑橘碎葉病呈加重蔓延的趨勢，植株衰弱、枯死乃至大面積毀園的現象時有發生，已成為柑橘產業可持續發展的重要障礙。

柑橘碎葉病的病原物為柑橘碎葉病毒（citrustatterleafvirus，CTLV），是線性病毒科（Closteroviri-dae）發狀病毒屬（Capillovirus）的正義單鏈RNA病毒。鑒于形態學、血清學和分子生物學特性上的密切相關性，CTLV被認為是蘋果莖溝病毒（applestemgroovingvirus，ASGV）的一個株系，其基因組大小約 6.5kb ，包含ORF1（ 和ORF2（1.0kb）兩個重疊的開放閱讀框，其中ORF1編碼一個分子質量為 241ku 的多聚蛋白，外殼蛋白位于其C端，大小約為 。已有研究表明CTLV不同分離物存在較豐富的遺傳多樣性[4，9-12]，其外殼蛋白基因序列在強、弱毒分離物之間存在差異[3]，但其與地理來源和寄主品種的相關性方面不同的研究結果不盡相同，對于浙江省不同產區和柑橘品種特別是紅美人等雜柑品種上CTLV的遺傳變異尚未見有系統的研究報道。

筆者在本研究中通過持續多年的跟蹤調查，明確柑橘碎葉病在浙江省的發生分布情況，并通過序列分析探究CTLV的遺傳多樣性及其與地理來源和寄主的相關性，以期為進一步研究CTLV的系統演化、致病性分化及開展對柑橘碎葉病的有效防控提供參考依據。

1 材料和方法

1.1試驗材料

植物材料：柑橘葉片樣品多數采集于、麗水、寧波、金華、溫州、衢州、嘉興、舟山、杭州和紹興等地，少量采集于廣東陽江、廣西桂林、云南大理、云南紅河、四川成都和上海崇明等地。柑橘品種包括紅美人、媛小春、滿頭紅、晴姬、091無核沃柑、碰柑、甘平、由良溫州蜜柑、宮川溫州蜜柑、尾張溫州蜜柑、佛手、春香、興津60、黃美人、砂糖橘、四季柚、明日見、貢柑、茂谷柑、香水檸檬、甜橘柚和沃柑等。

主要試劑：總RNA小量制備試劑盒AP-MN-MS-RNA-250和DNA凝膠回收試劑盒AP-GX-250購自愛思進生物技術（杭州）有限公司，一步法RT-PCR試劑盒PrimeScriptTMOneStepRT-PCRKitVer.2購自寶生物工程（大連）有限公司，瓊脂糖品牌為西班牙Biowest，核酸染料GelRed為美國Biotium公司產品。

引物：對GenBank中已登錄的不同地理來源和寄主品種的柑橘碎葉病毒基因序列進行比對分析，選取保守區域設計用于擴增外殼蛋白基因全長的引物CTLV-Fn（5'-CCCTCTCAGCTAGAATTGAA-3'）和CTLV-Rn（5'-AGAGTGGACAAACTCTAGAC-3），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2病害調查與樣品采集

2019一2022年，持續在浙江省各柑橘產區調查柑橘碎葉病發生情況，觀察并記錄病害癥狀，從疑似病樹上或隨機選取的橘樹上剪取帶有3＼～5枚葉片的枝條，置于塑料自封袋中，帶回實驗室后立即處理或暫存于 4^°C 冰箱中。

1.3病原一步法RT-PCR檢測

稱取 0.1g 柑橘葉片組織放入 2mL 塑料研磨管中，置于冷凍研磨儀中在 -49^°C 條件下將樣品研磨粉碎，然后以總RNA小量制備試劑盒提取樣品總RNA，最后將制得的RNA溶解在TE緩沖液中備用。以樣品總RNA為模板，以特異性引物CTLV-Fn/CTLV-Rn進行一步法RT-PCR擴增，反應體系為：

模板RNA 1μL，2× One Step Mix 25μL ，One StepEnzyme Mix 2.5μL ，引物CTLV-Fn 0.5μL ，引物CTLV-Rn 0.5μL ，無菌水 20.5μL ，總體積 50μL 。反應條件為： 50^°C30min;94^°C3min;94^°C30s ，57^°C30s，72^°C1min，35 個循環； 。反應結束后，取反應產物上樣于 1.5% 的瓊脂糖凝膠進行電泳。電泳結束后，將凝膠置于凝膠成像系統中觀察并拍照。若樣品泳道出現與陽性對照大小一致的條帶，且陰性對照和空白對照無對應條帶，則視為陽性；若樣品泳道未出現與陽性對照大小一致的條帶，且陰性對照和空白對照無對應條帶，則視為陰性。

1.4外殼蛋白基因測序分析

在紫外切膠儀中切取瓊脂糖凝膠上的目的條帶，以DNA凝膠回收試劑盒回收純化PCR產物，然后送交生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。去掉測序結果5末端和3末端非編碼區，僅保留完整的柑橘碎葉病毒外殼蛋白開放閱讀框全長，然后用軟件DNAstar中的MegaAlign程序對序列進行兩兩比對，分析不同分離物外殼蛋白基因核苷酸序列和氨基酸序列的相似率，并將序列信息登錄到GenBank中。用于系統發育分析的序列均從Gen-Bank中下載，具體登錄號為PP734420＼～PP734530，KP025652＼～KP025671，MH108975＼～MH108986，JX4-16228，MK481978，KY861873。包含在本研究中獲得的相似率低于 99% 的所有序列，同一地理來源同一品種上相似率大于 99% 的多個序列則取其中之一，共111個。從GenBank中選取已登錄的不同地理來源和柑橘品種的CTLV外殼蛋白基因序列33個，及寄主種類為蘋果的ASGV外殼蛋白基因序列1個。以發狀病毒屬的櫻桃病毒A為外群，利用MEGA5.05軟件的鄰接法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 田間病害癥狀

對于已經顯癥的病樹，柑橘碎葉病在不同柑橘品種上表現的病害癥狀大致相同，病樹通常比健樹生長緩慢，樹勢較弱，病樹上的葉片初期呈現系統性輕微黃化，之后不斷加重，至后期葉片嚴重黃化并陸續從樹體上脫落，結果少甚至不結果，最后整個植株枯死。受強風或用手推拉等外力作用時，病樹的砧穗接合處易斷裂，且裂面光滑。在病樹上靠接枸頭橙等其他砧木，能在一定程度上增強樹勢，但葉片黃化、結果少、砧穗接合處易斷裂等現象不能得到徹底改善，包括病樹與靠接砧的結合部位也存在易斷裂的情況（圖1）。

2.2 病害發生分布

對采集的951份柑橘樣品進行檢測，結果顯示有311份樣品感染柑橘碎葉病，陽性檢出率為32.70% 。從地域上來看，除湖州地區外，柑橘碎葉病已廣泛分布在浙江省各柑橘產區（圖2），病原物檢測陽性率 6.52%～57.14% 不等（表1），其中尤以紹興地區和寧波地區陽性檢出率最高，分別達 57.14% 和 55.91% ，其次為金華、溫州和衢州等地區，陽性檢出率分別為 42.86%，38.02% 和 35.29% ，而杭州地區陽性檢出率最低，僅為 6.52% 。在同一地區內，不同縣（市、區）之間的陽性檢出率也存在明顯差異，如在整體檢出率為 29.40% 的臺州地區，黃巖區和溫嶺市的檢出率分別高達 54.17% 和 43.01% ，臨海市則僅為14.97% ，而三門縣14個樣品均表現為陰性。從品種上來看，在所檢測的43個柑橘品種（品系）中，有27個表現為陽性，其中柑橘屬的枸櫞類10個佛手樣品和酸橙類2個枸頭橙樣品的檢測結果均為陽性，橘橙類雜柑的陽性率高達 48.54% ，顯著高于橘柚類雜柑（ 12.33% ）、柑類（ 16.54% ）、橘類 （16.22% ）和柚類（ 13.85% ），而葡萄柚類相對較低，僅為 4.55% ，而檸檬黎檬類的4個樣品、枳屬的1個樣品和金柑屬的5個樣品均表現為陰性。在同一大類中，不同柑橘品種（品系）的陽性率也存在明顯差異，如在整體檢出率為 48.54% 的橘橙類雜柑樣品中，沃柑等4個品種的樣品均表現為陰性，甘平陽性率為 6.25% ，而金秋砂糖橘、明日見、紅美人等9個品種的樣品陽性率均在 40% 以上；在整體檢出率為 12.33% 的橘柚類雜柑樣品中，春香的檢出率高達 85.71% ，而甜橘柚的檢出率則僅為 4.55% 。

2.3 CTLV外殼蛋白基因同源性分析

測序獲得202個CTLV分離物的外殼蛋白基因序列，其核苷酸序列全長為714個堿基。分析發現不同地理來源不同品種CTLV分離物之間外殼蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似率分別為87.7%～100.0% 和 91.6%～100.0% ，不同地理來源相同品種上CTLV分離物之間外殼蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似率分別為 87.7%～100.0% 和92.0%～100.0% ，同一地理來源不同品種上CTLV分離物之間外殼蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似率分別為 89.2%～100.0% 和 92.0%～100.0% ，同一地理來源同一品種上CTLV分離物之間外殼蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似率分別為88.8%～100.0% 和 92.0%～100.0% 。此外，對單個樣品測序圖譜分析發現，有的分離物外殼蛋白基因序列中單個或多個堿基處呈現重疊峰，說明存在基因雜合的情況。相比較浙江省柑橘產區，來自云南、四川、廣東、廣西等柑橘產區同一地理來源同一品種上的分離物相對保守，序列相似率多為 100.0% 。

圖1柑橘碎葉病的田間病害癥狀

2.4 CTLV系統發育分析

基于CTLV外殼蛋白基因序列構建的系統發育樹如圖3所示，在系統發育樹上所有144個CTLV分離物明顯地分為兩個大的分支，第一大分支包含98個CTLV分離物，及ASGV分離物Shaaxi-3；第二大分支包含46個CTLV分離物。

從地理來源以鄉鎮為單位來看，在來自浙江省36個不同鄉鎮的分離物中，有31個鄉鎮的分離物聚在第一大分支中，有21個鄉鎮的分離物聚在第二大分支中，其中16個鄉鎮的分離物在兩大分支中均有分布；從地理來源以縣（市、區）為單位來看，在來自浙江省17個不同縣（市、區）的分離物中，有15個縣（市、區）的分離物聚在第一大分支中，有10個縣（市、區）的分離物聚在第二大分支中，其中8個縣（市、區）的分離物在兩大分支中均有分布；從地理來源以地級市為單位來看，第一大分支包含了來自浙江省所有8個地級市的分離物，第二大分支則包含6個地級市的分離物；從地理來源以省份為單位來看，筆者在本研究中獲得的和GenBank中登錄的共10個省份的分離物均有在第一大分支中分布，其中浙江省的分離物有70個，第二大分支則包含7個省份的分離物，其中浙江省的分離物有32個。從地理來源以國家為單位來看，第一大分支包含中國的92個分離物、美國的5個分離物和日本的2個分離物，而第二大分支則僅包括來自中國的45個分離物。第一個大分支中的98個CTLV分離物又分為7個分支，浙江省的70個分離物在每個分支中均有分布，其中臺州市的32個分離物也廣泛分布在其中的6個分支中，每個分支中包含2個至多個來自不同省份的分離物，美國的5個分離物和日本的2個分離物與中國浙江、四川等地的6個分離物則聚為一個分支，而來自中國的分離物R40和TL112則與ASGV分離物Shaanxi-3具有更近的親緣關系，單獨聚為一個分支。第二個大分支中的46個CTLV分離物又分為5個分支，浙江省的32個分離物在每個分支中均有分布，其中臺州市的15個分離物也廣泛分布在其中的4個分支中，臨海市的3個分離物聚為一個分支，而浙江溫州市蒼南縣分離物R43則單獨為一個分支，其他3個分支中均包含來自不同省份的分離物。此外，每個分支下多包含2個至多個小分支及更小的分支。

從寄主品種來看，在來自46個柑橘品種（品系）的分離物中，有36個品種（品系）的分離物聚在第一大分支中，有22個品種（品系）的分離物聚在第二大分支中，12個品種（品系）的分離物在兩大分支中均有分布，其中數量最多的紅美人品種上的分離物在兩大分支中的分布數分別是36個和21個，而媛小春品種上的5個分離物和佛手品種上的4個分離物均全部聚在第一大分支中，2個砂糖橘品種上的分離物均聚在第二大分支中。從柑橘品種（品系）所屬大類來看，用于分析的所有10個柑橘大類的分離物在第一大分支中均有分布，第二大分支則包含其中的9個大類，其中數量最多的橘橙類上的分離物在兩大分支中的分布數分別是55個和26個，而酸橙類的2個分離物均聚在第一大分支中。在第一大分支下的7個分支中，除四季柚上的分離物R40和枸緣上的分離物TL112與ASGV分離物 Shaanxi-3聚為一個分支外，其他6個分支中均包含3個以上柑橘大類4個以上柑橘品種（品系）的分離物，特別是第一分支中多達7個柑橘大類17個柑橘品種（品系）。橘橙類上的55個分離物（其中紅美人品種上36個分離物）廣泛分布在6個分支中，柑類溫州蜜柑品種上的15個分離物也在其中的4個分支中均有分布，而橘橙類媛小春品種上的5個分離物和枸緣類佛手上的4個分離物分別集中聚在同一分支中。在第一分支下又分為2個小的分支，其中一個小分支中包含來自11個品種（品系）的30個分離物，但其所屬大類相對其他分支較為單一，除1個酸橙類分離物外，其余均為柑類和橘橙類。在第二大分支下的5個分支中，除柚類四季柚品種上的分離物R43單獨聚為一個分支，柑類宮川溫州蜜柑分離物SJ16R、XZ1R與橘橙類紅美人分離物SJ13R聚為一個分支外，其余3個分支均包含4個以上柑橘大類4個以上柑橘品種（品系）的分離物，其中最大的一個分支包含6個柑橘大類12個柑橘品種（品系）。橘橙類紅美人品種的分離物在4個分支中均有分布，柑類溫州蜜柑品種（品系）也廣泛分布在其中的3個分支中。

3討論

多數柑橘品種感染CTLV后通常不表現明顯癥狀，但以積及其雜種為砧木的柑橘植株被感染后會表現葉脈黃化、嫁接部位腫大易斷裂、葉片易脫落、植株矮化乃至整株枯死等病害癥狀[4.1415]。近年來研究發現，黃金蜜柚、三紅柚、紅肉琯溪蜜柚等品種感染CTLV后還會表現新梢黃化、斑駁花葉等癥狀，在不知火品種上則會表現為新葉脈明癥狀，而在默科特、沃柑等品種上則會表現為果實變小、僵硬和不轉色癥狀[1]。筆者在本研究中發現，以枳殼為砧木的紅美人、媛小春等柑橘品種病害癥狀尤為嚴重，多表現為植株黃化矮小、葉片易脫落、砧穗結合處易斷裂和整株枯死。新葉脈明癥狀雖也有在溫州蜜柑等品種上被發現，但檢測發現其同時攜帶CTLV和柑橘黃化脈明病毒，因葉片脈明是柑橘黃脈病的典型癥狀，因此分析認為本研究中的新葉脈明癥狀系CYVCV感染所致。此外，在CTLV侵染的部分紅美人植株上存在果實變小、僵硬等癥狀，但通過營養元素測定分析認為該癥狀或是由缺硼引起（相關數據待發表），是否與CTLV侵染有相關性尚需進一步研究。

浙江省最早于20世紀70年代由日本防疫所在從黃巖引進的柑橘品種上發現柑橘碎葉病，之后相繼在臺州和溫州地區檢測到該病害[5。近年來，項周等利用PCR技術對來自浙江省的10份樣品進行檢測未發現其感染CTLV，而高海馨等[12則從浙江省46份樣品中檢出17份樣品感染有CTLV，陽性率高達 36.96% 。筆者在本研究中從來自浙江省全部11個地級市的951份樣品中檢測到10個地級市的311份樣品感染有CTLV，陽性率為 32.70% ，說明柑橘碎葉病已在浙江柑橘產區廣泛分布。研究還發現浙江省不同地區及同一地區不同縣（市、區）之間陽性率存在明顯差異，如從國外引種較為活躍的象山縣陽性率高達 54.87% ，而種植品種較為單一、引種和苗木調運頻次較低的慶元縣則僅為 5.17% ，因此認為從國外頻繁引種和苗木無序調運可能是導致柑橘碎葉病發生蔓延的原因。

柑橘碎葉病在柑橘類植物上具有廣泛的寄主，從20世紀60年代開始，人們陸續通過指示植物鑒定出北京檸檬、溫州蜜柑、蕉柑等20余個柑橘品種感染CTLV[。20世紀以來，通過PCR或熒光定量PCR技術檢測到砂糖橘、沃柑、默科特等多個品種感染有CTLV[17-19]，特別是高海馨等[12]從七大類55個柑橘品種中檢測到了CTLV。筆者在本研究中也從浙江省八大類26個柑橘品種（品系）中檢測到了CTLV，包括溫州蜜柑、柱柑等傳統品種和紅美人、媛小春等新興的雜柑品種，說明該病害已在各柑橘品種中廣泛分布。筆者在本研究中檢測的枸緣類10個佛手樣品均表現為陽性，與高海馨研究結果一致，不同的是筆者在本研究中發現橘橙類和橘柚類雜柑陽性率較高，達 43.74% ，而柚類陽性率僅有13.85% ，特別是水晶柚、麻步文旦、皋泄香柚等地方特色品種均表現為陰性，這可能與該地區種植品種較為單一、鮮有外來苗木引入從而未導致碎葉病傳播擴散有關。地區檢出率的高低與其所種植的品種（品系）表現出一定的相關性，如種植橘橙類比例較高的寧波和紹興地區較其他幾個地區有更高的檢出率，而湖州和嘉興地區盡管所檢測樣品均為橘橙類紅美人，但其檢出率卻為最低，這應該與該地區檢測樣品數量較少或所種植苗木多為無病毒苗木有關。

已有研究表明，CTLV的CP基因相對保守，但也存在著不同程度的遺傳變異，核苷酸和氨基酸序列相似率為 88.1%～100.0% 和 91.1%～100.0% 不等，而這種變異與CTLV的來源地域、寄主品種沒有直接相關性[10.11.13]。筆者在本研究中對浙江省202個CTLV分離物的外殼蛋白基因分析發現，其核苷酸序列和氨基酸序列相似率分別為 87.7%～100.0% 和91.6%～100.0% ，核苷酸序列最大變異超 12% ，其變異未表現出與地理來源和寄主品種明顯的相關性，這與已報道的研究結果相似。有意思的是，筆者在本研究中發現CTLV的CP基因在有的樣品中存在雜合的情況，且在不同樣品中表現不盡一致，說明在自然條件下存在CTLV不同株系混合侵染同一柑橘植株的現象，且其種群遺傳結構會不斷發生變化，這可能與帶毒接穗在不同柑橘品種上被頻繁高接有關，與劉科宏等[的研究發現相符合，即CTLV接種不同柑橘品種后其CP基因核苷酸位點會發生變異，認為病毒株系在不同類型柑橘上的適應性存在差異，或是由于不同類型的柑橘在各自與病毒的共同演化過程中產生了不同的防御機制。

與高海馨等通過CTLV全基因組分析發現來自同一省份的CTLV分離物多聚在相同的分支中不同，本研究中浙江省101個分離物在系統發育樹中廣泛分布在不同的分支中，這與項周等對湖北省分離物的分析結果和張金珠等對廣西分離物的分析結果相似。筆者在本研究中發現美國的5個分離物、日本的2個分離物與浙江和四川的6個分離物聚在同一個小的分支中，由此說明不同國家的CTLV分離物呈現一定的地理相關性，這與張金珠等的分析結果一致，也符合CTLV起源于亞洲的論斷和起源點病毒序列高度多樣性的原則[4，20-21]。與高海馨等發現采自柚類的CTLV分離物多聚在相同的分支中不同，在本研究中，柚類分離物多分布在不同的分支中，未呈現明顯聚集的情況。其他柑橘大類分離物特別是橘橙類紅美人品種上的分離物廣泛分布在不同分支中，這可能與該品種在各柑橘產區推廣種植及在各柑橘品種上廣泛高接相關，符合CTLV接種不同柑橘品種后其基因發生變異的研究結論[15]。橘橙類媛小春品種上的5個分離物和枸櫞類佛手上的4個分離物分別集中聚在同一分支中，CTLV是否在這兩個品種上具有更高的保守性尚需要更多的分離物序列分析確定。此外，在本研究中，32個浙江分離物與宋震等[3報道的6個弱毒分離物聚在一大分支中，其余分離物與10個強毒分離物聚在另一大分支中，這些分離物是否存在致病性強弱差異尚有待進一步研究確定。

4結論

柑橘碎葉病在浙江柑橘產區發生普遍，廣泛危害不同的柑橘品種（品系），其病原物種群存在豐富的遺傳多樣性，但其分化與地理隔離和寄主品種不存在明顯的相關性。研究結果為進一步探究CTLV的起源、系統演化和致病性分化奠定了基礎，同時也揭示了規范化品種引進和苗木調運程序是預防該病害發生的關鍵。

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