水稻干尖線蟲海藻糖6-磷酸合成酶基因雙鏈RNA細菌表達體系構建

關鍵詞：水稻干尖線蟲；海藻糖-6磷酸合成酶基因；雙鏈RNA；RNA干擾中圖分類號： S435.114⁺8 （204號 文獻標識碼：A 文章編號：1000-4440（2025）05-0867-08

Abstract： Exogenous double-stranded RNA （dsRNA）can affct the gene expression of plant nematodes through RNAinterference（RNAi）to achieve the purpose ofpest control. The use of bacterial expression system for dsRNA preparation has high production efficiency and low cost， whichis the preferred strategy forlarge-scale preparation of dsRNA.Inorder toexplore theroleofbacterial dsRNA expression based on RNAi technology in the control of Aph 1 elechoidesbesseyi，in thisstudy，the trehalose-6-phosphate synthase genes AbTPS1 and AbTPS2of Aphelechoidesbes

seyi wereusedastarget genes to designand constructbacterial expressiondouble-strandedRNA（dsAbTPS1 and dsAbTPS2）vectorsandtransform Escherichiacoli HTi15（DE3）.Theinduction expresionconditionsand extractionmethodsof dsRNA wereoptimized，andthe silencing eficiencyof dsRNA expressedbybacteriaontarget genes wasdetermined byfluorescence quantitative PCR，and the control effct of dsRNAonAphelenchoides beseyi was evaluated.The results showed that when the concentration of isopropyl ?β D -thiogalactoside（IPTG）was O.5 mmol/L and the induction time was 6 h ，thedsRNA yieldofthe AbTPS -L4440 expression vector HT115 strain constructed in this study reached the maximum. TheyieldofdsRNA extractedfromtheexpresionstrainsusing Trizolmethodandformamide method was significantlyhigher thanthatobtainedusing ethanol-sodiumchloride method.After treating Aphelenchoidesbeseyi with dsAbTPS1 and dsAbTPS2，the expresion levels of target genes AbTPS1and AbTPS2 were down-regulated.The survival rate of Aphelenchoidesbesseyi underlow temperature of 4 C ，high temperature of 40 ΔC and dehydration and drying conditions was significantlylowerthan thatinM9buffertreatmentanddsGFP treatment.Inthisstudy，thebacterialdsRNAexpresionsystem targeting AbTPS1 and AbTPS2 of A . besseyi was successfully constructed，and the obtained dsRNA exhibited obvious RNAi effects，which provided technical support for the use of RNA-based pesticides to control A .besseyi.

Key Words：Aphelenchoides besseyi； trehalose-6-phosphate synthase genes；double stranded RNA；RNA interferen

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種進化上保守的序列特異機制，能調控大部分真核生物基因表達。一般而言，內源或外源雙鏈RNA（dsR-NA）被加工成 18～30nt 的小RNA，包括小干擾RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA）。這些小RNA可識別互補的mRNA或DNA，通過切割mRNA和抑制翻譯、DNA甲基化和染色質修飾等，在轉錄時或轉錄后調控基因表達[1]。由于dsRNA具有低毒、環境友好以及容易設計等特點，因此，基于RNAi技術，利用dsRNA進行植物病蟲害防治得到越來越多的關注[2]

大量高效制備dsRNA或小RNA是RNAi防治策略得到應用的關鍵步驟?；诩毦w系生產dsRNA，制備簡便且成本低廉，是dsRNA規模化制備的優選策略。目前的研究中通常將靶標基因序列構建進入RNAi載體，轉化至中性、共生或有益細菌，通過優化發酵條件，提取發酵產物中的dsRNA，從而實現dsRNA的量產[2-3]。當前應用較多的細菌表達體系是大腸桿菌HT115（DE3）[4-6]。HT115（DE3）菌株缺乏核酸內切酶RNAaseI基因，從而避免細胞產生的dsRNA降解。此外，HT115（DE3）菌株在異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導下可產生T7聚合酶，因此通過構建帶有T7啟動子的RNAi載體（如L4440 等）可實現dsRNA的大量合成[3，7]但目前有關發酵條件及提取方法對細菌體系dsRNA產量的影響研究較少。

水稻干尖線蟲（Aphelenchoidesbesseyi）是水稻重要病原線蟲之一，被列入世界十大植物病原線蟲名單[8]。干尖線蟲為害水稻時，水稻植株常出現劍葉葉尖干枯或小穗頭等癥狀，導致穗長縮短、穗粒數減少以及稻米品質變差，對水稻安全生產造成嚴重威脅[9]。水稻干尖線蟲是典型的外寄生線蟲，主要為害水稻地上部分生組織，在孕穗期進入穎花，隨著種子成熟停正取食，藏匿米粒和穎殼之間進入脫水休眠狀態，并依賴種子實現遠距離傳播[10]。基于上述寄生特點，水稻干尖線蟲能適應高溫、干燥、高滲透等多種逆境脅迫。

隨著分子生物學研究的深入，作物響應逆境脅迫的海藻糖-6磷酸合成酶（Trehalose-6-phosphatesynthase，TPS）基因等相繼被克隆和分析[10-11]。海藻糖是生物體的血糖，經水解為生物體提供能量，而TPS是昆蟲、線蟲及病原菌海藻糖合成途徑中的關鍵酶，廣泛參與微生物的生長發育、侵染寄生及其對逆境脅迫響應與適應等過程[12]。RdTPS1基因對谷蠹（Rhyzoperthadominica）適應熱逆境至關重要，通過dsRNA處理能顯著降低谷蠹體內海藻糖水平及其在高溫脅迫下的存活率[13]。水稻褐飛虱（Nilapa-rvatalugens）TPS基因在不同發育階段差異化表達，基于RNAi技術可抑制TPS3基因的表達水平，進而造成褐飛虱蛻皮障礙和翅發育畸形[14]。水稻稻瘟病病原菌（Maganaphortheoryzae）MoTPS1基因還可調控病原菌的侵染和致病性[15]。Chen 等[11]鑒定了2個水稻干尖線蟲TPS基因（AbTPS1和AbTPS2），體外合成dsRNA證實這2個基因對線蟲在低氧脅迫逆境中的存活和代謝非常重要，并有望成為水稻干尖線蟲防治的靶標。因此，本研究擬通過構建攜帶AbTPS基因的RNAi載體，利用IPTG誘導大腸桿菌HT115（DE3）表達制備dsRNA，并評估其應用效果，為基于RNAi策略防治水稻干尖線蟲提供技術支撐。

1材料與方法

1 線蟲準備

本研究所采用水稻干尖線蟲種群最初分離自江蘇省發病水稻病穗，后在灰葡萄孢菌（Botrytiscinerea）平板上擴繁培養。用無菌水洗脫平板進行線蟲收集，并用含 100μg/mL 氨芐青霉素 、50μg/mL 卡那霉素和 100μg/mL 兩性霉素的消毒液對蟲體進行消毒[16]。

2 線蟲RNA提取和cDNA合成

收集活性良好的線蟲，液氮速凍后迅速研磨成粉，加入 1mL Trizol試劑（美國Invitrogen公司產品），按照試劑盒說明書進行線蟲RNA提取。利用2% 瓊脂糖凝膠電泳及Nanodrop2000分光光度計（美國Thermo Scientific 公司產品）的 OD₂₆₀/OD₂₈₀ （ 260nm 和 280nm 的吸光度比值）進行RNA質量和產量評估。采用TransScript uni one-step gDNA re-movalandcDNAsynthesissuperMix試劑盒（北京全式金生物技術有限公司產品）進行cDNA合成。

3 靶標片段擴增

將水稻干尖線蟲海藻糖-6磷酸合成酶基因cD-NA序列（AbTPS1：NCBI登錄號KY661388;AbTPS2：NCBI登錄號KY661389）上傳 siRNA target finder網站（https：//www. genscript. com/tools/sirna-target-find-er），設置水稻干尖線蟲（A.besseyi）為靶標物種，含有4個及以上潛在siRNA的序列進行靶標序列分析。采用Primer3 plus 網站（http：//www.primer3plus.com/）設計引物，并用PrimerBlast網站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進行特異性檢驗后，委托生工（上海）生物工程股份有限公司進行引物合成。分別以引物AbTPS1-F/AbTPS1-R和AbTPS2-F/AbTPS2-R擴增AbTPS1和AbTPS2序列片段，并連接至pMD20-T載體，測序正確的重組轉化子提取質粒，用于后續研究。本研究所用引物序列見表1。

4重組表達菌株構建

根據RNAi載體L4440多克隆位點序列，設計含載體接頭序列的引物，以方法3測序正確的重組質粒為模板PCR擴增TPS序列，并以pCambia1304載體DNA為模板PCR擴增綠色熒光蛋白（GFP）片段。PCR反應體系 50μL;2×1 PhantaMasterMix（諾唯贊生物科技股份有限公司產品）25μL 上下游引物（ 10μmol/L， 各 2μL 、質粒模板（10ng）2μL，ddH，0 19μL. 。反應程序如下： 95^°C 預變性3m i n ; 9 5 變性 15s，58‰ 退火 15s，72‰ 延伸45s，32個循環； 72°C 補充延伸 5min 。采用ClonExpress I one stepcloningkit（諾唯贊生物科技股份有限公司產品）將靶標片段連接至HindIl和SmaI雙酶切的L4440載體，并轉化至RNaseII缺陷型大腸桿菌（Escherichiacoli）HT115（DE3）菌株，測序驗證正確的轉化子菌液保存備用。

5靶標dsRNA細菌表達的誘導及誘導條件優化

將含有AbTPS1-L4440重組質粒的 E coliHT115（DE3）轉化子菌液按體積比 1：1 000 添加至含氨芐青霉素 100.0μg/mL 、四環素 12.5μg/mL 的LB 液體培養基， 180r/min 37 9C 振蕩培養 ^16h 。吸取 0.2mL 培養菌液加到 20mL 含上述抗生素的LB培養基繼續培養，至對數生長期（ OD₆₀₀=0.4^? ，加入IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，上海SigmaAldrich公司產品）進行誘導。為明確靶標dsRNA細菌表達的適宜誘導條件，本研究設置 0μmol/mL 0.1μmol/mL，0.5μmol/mL 和 0μmol/mLlt; 4個IPTG濃度，分別振蕩誘導 ^4h ，測定不同IPTG濃度下的dsRNA產量，以明確適宜的IPTG誘導濃度。并在 0.5μmol/mL 的IPTG濃度下，分別振蕩誘導2h，4h，6h，8h 和 ^10h ，測定不同誘導時間下的dsR-NA產量以確定最佳誘導時間。每處理設3個重復。

6 細菌表達dsRNA提取

取IPTG誘導的新鮮菌液 離心收集菌體沉淀，加入 1mL Trizol試劑裂解細胞，提取細菌RNA，提取方法同方法2。為大量制備dsRNA、降低生產成本，進一步分別采用甲酰胺法和乙醇-氯化鈉（EtOH-NaCl）法提取RNA。甲酰胺法提取RNA的方法如下：在 10.0mL 菌液沉淀中加入 0mL 含98.0% 甲酰胺、 0.2% 巰基乙醇、 0.1% 十二烷基硫酸鈉、0.5mol/L乙二胺四乙酸的提取緩沖液，渦旋后置于 60.0^qC 水浴 20min 使菌體充分裂解，離心收集上清液，并通過異丙醇-乙醇法純化RNA[17-18]乙醇-氯化鈉（EtOH-NaCl）法提取RNA的方法如下：10mL 菌液 80^°C 孵育 20min ，離心收集菌體沉淀，依次用 75% 乙醇（ 1×PBS 緩沖液配制）和150μmol/mLNaCl 重懸菌體沉淀，離心收集上清液，得到 RNA 粗提液[19]。使用 T7 RNAi transcription kit（諾唯贊生物科技股份有限公司產品）處理RNA，每 20μL RNA粗提液加入 1μL 質量濃度為2ng/μL 的DNaseI和1個單位RNaseA，于 37^°C 孵育30min 以消化殘留單鏈RNA和DNA。上述方法提取的RNA均通過 5% 瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop2000分光光度計測定dsRNA質量和產量。每處理設3個重復。

7 RNA干擾

將2000條線蟲分別浸泡于 1×M9 緩沖液、1μg/μL 的AbTPS1基因dsRNA、 的AbTPS2基因dsRNA 和 1μg/μL 的GFP基因dsRNA中，25C 避光處理 24h ，通過熒光定量PCR（qPCR）檢測AbTPS1和AbTPS2基因沉默效率。采用EvoM-MLV反轉錄試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司產品）進行cDNA模板制備，通過SYBRGreenPremixProTaqHS試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司產品）在LightCycler96PCR平臺（德國Roche公司產品）進行qPCR分析。以水稻干尖線蟲18SrDNA為內參基因，分別以特異性引物qAbTPS1-F/qAbTPS1-R和qAbTPS2-F/qAbTPS2-R檢測 AbTPS1和AbTPS2的相對表達水平。相對基因表達水平通過 2^-ΔΔct 法計算[20]。為檢測靶標基因沉默后水稻干尖線蟲對逆境脅迫的適應能力，按照文獻[21]的方法，對RNA干擾后的水稻干尖線蟲分別進行 4^°C 低溫 40‰ 高溫和常溫干燥脫水處理，每處理100條線蟲， ^48h 后將蟲體轉移至室溫無菌水中，在體視顯微鏡下觀察線蟲活性，以線蟲蟲體僵直或呈“C”形彎曲、針觸無反應為依據判定線蟲是否死亡，并統計存活率[22]

2 結果與分析

2.1TPS靶標序列的擴增和雙鏈RNA制備

利用L4440載體在E.coliHT115中表達產生靶標dsRNA的流程見圖1A?；贜CBI數據庫中AbTPS1和AbTPS2cDNA序列設計的特異引物，PCR擴增分別獲得 358bp 和 329bp 片段條帶，經測序驗證其序列與預期一致。采用同源重組法分別將獲得的AbTPS1和AbTPS2構建至L4440載體，并轉化至HT115菌株，待細菌生長至指數期加IPTG誘導后可見目標條帶。當用RNaseA和DNaseI消化單鏈

RNA和DNA后，dsRNA條帶清晰可見（圖1B）。

A：RNAi載體構建及細菌表達dsRNA體系流程圖;B：細菌表達靶標基因dsRNA電泳檢測。 Ψ_M ：DNA分子標尺；1：細菌表達含dsAbTPS1的總產物；2：細菌表達含dsAbTPS2的總產物;3：經RNaseA和DNaseI消化后的dsAbTPS1;4：經RNaseA和DNaseI消化后的dsAbTPS2。

2.2 dsRNA誘導條件的優化

以AbTPS1為測試對象，不同IPTG誘導濃度和時間下，細菌表達載體產生dsRNA質量濃度的變化如圖2所示。從圖中可以看出，隨著IPTG濃度的增加，dsRNA質量濃度呈先增后減的趨勢，0μmol/mL， 0.1μmol/mL， 0.5μmol/mL 及0μmol/mL IPTG誘導濃度下，細菌表達載體產生的dsRNA質量濃度分別為 2.13μg/mL，3.11μg/mL

13.45μg/mL 及 10.67μg/mL ，即細菌表達載體產生dsRNA的適宜IPTG 濃度為 0.5μmol/mL （圖2A）。當IPTG 濃度為 0.5μmol/mL 時，隨著誘導時間的增加，細菌表達載體產生的dsRNA質量濃度亦呈先增加后減少趨勢，當誘導時間 6h 時，細菌表達載體產生的dsRNA質量濃度達到最高（圖2B）。因此細菌表達載體產生dsRNA的適宜IPTG濃度為0.5μmol/mL ，誘導時間為 6h 。

2.3不同提取方法對dsRNA質量濃度的影響基于上述最優dsRNA誘導條件，分別采用Trizol法、甲酰胺法及乙醇-NaCI法提取細菌總RNA，并經DNaseI和RNaseA對DNA和單鏈RNA消除后，不同提取方法得到的電泳圖和dsRNA質量濃度如圖3所示。從圖中可以看出，Trizol法、甲酰胺法及乙醇-NaCl法均可獲得單一條帶（圖3A）;采用Trizol法或甲酰胺法提取獲得的dsRNA質量濃度顯著高于乙醇-NaCl法，而Trizol法和甲酰胺法得到的dsRNA質量濃度無顯著差異（圖3B）。由于甲酰胺法提取dsR-NA所需的成本更低，所以從大量生產dsRNA的角度，使用甲酰胺法提取dsRNA是合適的。

A：Trizol法、甲酰胺法及乙醇-氯化鈉法提取細菌總RNA，并經RNaseA和DNaseI消化后的電泳圖； M：DNA 分子標尺；1、2、3分別表示 Tr-izol法、甲酰胺法及乙醇-NaCI法提取的細菌總RNA電泳圖。B：Trizol法、甲酰胺法及乙醇 ?NaCI 法提取得到的dsRNA質量濃度。ns、 ^** 分別表示處理間差異不顯著和差異極顯著（ Plt;0.01 ）。

2.4 RNAi效果評價

用細菌表達的dsAbTPS1和dsAbTPS2浸泡線蟲24h ，對應靶標記基因AbTPS1和AbTPS2的表達水均低于M9緩沖液處理和dsGFP處理（圖4A、圖4B）。在常溫（ 25‰ ）、低溫（ 、高溫（ 40% ）及脫水干燥逆境中，M9緩沖液處理和dsGFP處理的線蟲存活率均超過 94% ，而經細菌表達的dsAbTPS1處理和dsATPS2處理的線蟲在常溫（ 25°C ）下的存活率分別為 75.33% 和833% ，均顯著低于M9緩沖液處理和dsGFP處理。在低溫 （4^°C） 、高溫 （40^qC ）及脫水干燥逆境下，dsAbTPS1處理和dsAbTPS2處理的線蟲存活率為39.67%～62.67% ，顯著低于M9緩沖液處理和dsGFP處理（表2）。

圖4dsRNA處理對水稻干尖線蟲AbTPS1和AbTPS2靶基因表達水平的影響

Fig.4Effetsofdouble-strandedRNA（dsRNA）treatmentontheexpresionlevelsofAbTSandAbTS2inApelenchodesbese

A：AbTPSI的相對表達水平;B：AbTPS2的相對表達水平。M9緩沖液、dsGFP、dsAbTPS1、dsAbTPS2分別利用 1×M9 緩沖液、 GFP 基因的dsRNA、AbTPS1基因的dsRNA、AbTPS2基因的dsRNA浸泡水稻干尖線蟲 24h 處理。**、 分別表示處理間差異極顯著（ Plt;0.01 ）和差異顯著（ Plt;0.05） 1 表示處理間差異不顯著。

3 討論與結論

目前，作物病蟲害防治通常依賴化學藥劑、品種抗性或其他農藝措施，但線蟲病害防治缺乏有效技術手段或抗性資源[2]。基于RNAi技術，應用dsR-

NA干擾線蟲重要靶標基因的表達水平，有效降低植物病原線蟲環境適應性，可達到殺蟲防病的目的[23]。一般而言，體外dsRNA合成需要分別轉錄合成正義RNA和反義RNA序列，然后退火形成dsRNA片段，但該方法大多依賴商業化的試劑盒，成本高昂且流程復雜，不適用病蟲害防治規?；瘧肹24]。原核表達系統生產dsRNA，因具備低成本、效率高等優點，適合批量制備dsRNA[25]

轉化L4440RNAi載體的E.coliHT115誘導生產dsRNA的產量，取決于dsRNA序列及培養方法[3」。計慧君等[2構建了褐飛虱蛋白激酶B雙鏈RNA（dsNIAKT）的原核表達體系，發現當IPTG工作濃度為 0.1μmol/mL 和 0.5μmol/mL ，細菌表達dsNIAKT水平顯著高于 0μmol/mL ，說明低濃度IPTG有助于提高dsRNA產生。本研究結果表明0.5μmol/mL IPTG濃度能誘導dsRNA的高表達，而 0.1μmol/mL 的IPTG不利于dsRNA的制備。同時，隨著誘導時間延長，細菌表達載體表達的dsR-NA質量濃度呈先增加后減少的趨勢，在誘導 6h 時，dsRNA質量濃度達到最高，說明 6h 是本細菌表達體系下的最優誘導表達時間，這一結果與前人的研究結果基本一致[26]。Papic等[27]發現dsRNA的產生與表達細菌生物量密切相關，通過分批進料增加菌體生物量的方式最高可產生 182mg/L dsRNA，這使得細菌表達dsRNA大規模制備成為可能，其制備成本也遠低于體外試劑盒的制備方法。本研究以dsAbTPS1為對象進行測試，優化后的細菌表達體系最高可產生超過 15μg/mL 質量濃度的dsRNA。本研究還比較了3種常用提取細菌RNA方法的效率，其中Trizol法和甲酰胺法提取RNA的質量和效率優于乙醇-氯化鈉法。Trizol試劑是RNA提取最常用試劑，但價格比較昂貴，且萃取過程常需要使用氯仿等有毒試劑。甲酰胺試劑成本低廉，提取操作簡便，適合于細菌表達的dsRNA批量制備。

Chen等[1]研究結果表明，海藻糖合成酶基因AbTPS1和AbTPS2參與水稻干尖線蟲對逆境的適應過程，采用體外合成的dsRNA浸泡蟲體能顯著降低AbTPS1和AbTPS2的轉錄豐度，并導致低氧脅迫下線蟲死亡率增加。本研究利用細菌表達的dsAbTPS1和dsAbTPS2浸泡線蟲 24h ，靶標基因AbTPS1和AbTPS2的表達水平均顯著下降，線蟲在低溫、高溫和干燥脫水逆境下的存活率均低于M9緩沖液處理和dsGTP處理。說明AbTPS1和AbTPS2基因表達水平對水稻干尖線蟲逆境生存能力有重要影響，通過細菌表達的dsRNA可有效降低AbTPS1和AbTPS2基因的表達水平，導致線蟲在環境壓力下的死亡率提高。

綜上所述，本研究建立了水稻干尖線蟲AbTPS基因的dsRNA細菌表達體系，通過優化誘導條件和提取方法，可實現dsRNA的批量生產，為利用RNA農藥防治水稻干尖線蟲提供了技術支持。

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