兔出血癥病毒 RHDV1 和 RHDV2一步法雙重 Taq-Man探針熒光定量RT-PCR體系的建立和應用

中圖分類號：S855.3 文獻標識碼：A 文章編號：1000-4440（2025）05-0937-06

Abstract：Rabbit hemorrhagic disease（RHD）caused by rabbit hemorrhagic disease virus（RHDV）isan acute ndhighlylethal infectiousdiseasethat posesaseriousthreattotherabitbreding industry.Inthisstudy，primersand

TaqMan probeswere designed based on the capsid protein （VP6O）gene sequences of RHDVto establish a dual TaqMan quantitativeRT-PCRdetectionsystem capableof simultaneously detecting both RHDV1 and RHDV2 strains. Thereaction system included 10.0μL of 2× One Step RTPCR Buffer Il ， 0.6μL of forward primer（10 μmol/L），

0.6μL of reverse primer （ 10μmol/L ， 0.4μL of ROX Reference Dye （ 50× ）， 0.8μL of each fluorescent probe（10 μmol/L ）， 2.0μL of test sample，and 4.8μLddH₂O . The reaction program was as follows： 42ΩΩ for 5 min， 95‰ for 10s ， 959C for5s， 60YC for 30s ，and 4O cycles.Results showed that the system had strong specificity and no cross-reactions with rotavirus，Pasteurell multocida，Bordetella bronchiseptica，Pseudomonas aeruginosa，and Salmonella spp.，and high sensitivitywithaminimumdetectionlimitof1OOcopiesper microliter.Repeatabilityanalysis through intra-groupand inter-group repetitions showed that the coefficient of variation of Ct valueswas between 0.2% and 2.9% ，indicating good stabilityofthesystem.When testing112 clinicalsamples（6Olivertisuesand 52 nasal and anal swabs）usingthis system， the overall detection rate of RHDV reached 69 % ，while the detection rate of the conventional RT-PCR system was only 51% .The dual quantitative RT-PCR method established in this study has high sensitivity，strong specificity，and good repeatability，providing areliable technical support for therapid clinical diagnosisand quantitative analysis of RHDV.

Key words：rabbit hemorrhagic disease virus； fluorescence quantitative RT-PCR；TaqMan probe

兔病毒性出血癥（Rabbit hemorrhagicdisease，RHD），又稱兔出血癥或兔瘟，是由兔出血癥病毒（Rabbithemorrhagicdiseasevirus，RHDV）引起的一種急性、高度接觸傳染性、致死性疾病，主要感染家兔和野兔[1]。RHDV 屬于杯狀病毒科兔病毒屬成員，目前有GI.1和GI.2兩種基因型。該病毒基因組為 7.4kb 的正鏈RNA，包含2個開放閱讀框（ORF）。ORF1編碼1個多蛋白，該多蛋白可被切割成衣殼蛋白（VP60）和7個非結構蛋白，ORF2編碼次要結構蛋白（VP10）[2-3]。RHDV于1984年在中國首次被報道[4]，隨后迅速傳播至全球。截至2010年，中國主要流行的RHDV1毒株為GI.1基因型，GI.1基因型可分為GI.1a亞型和GI.1c亞型。2010年，在歐洲首次發現RHDV2，該毒株屬于GI.2基因型，在系統發育和抗原性方面與GI.1基因型存在差異[5-7]。2020 年之前，中國僅流行RHDV1毒株，2020 年首次發現RHDV2毒株[8]。由于RHDV1疫苗對RHDV2的交叉保護作用有限，導致RHDV2在全國范圍內迅速傳播。目前，RHDV1和RHDV2均在中國流行[9-14]

RHD潛伏期為1＼～3d，臨床主要表現為神經癥狀、呼吸道癥狀、精神沉郁和食欲減退，病兔常在體溫升高后 12～36h 死亡。RHDV1僅感染家兔，4＼～6周齡仔兔多呈亞臨床癥狀，2月齡以上的家兔易出現明顯的臨床癥狀。RHDV2不僅可感染家兔，還能跨物種感染野兔以及地中海田鼠等嚙齒類動物。感染RHDV2的10＼～15日齡幼齡家兔也會出現明顯的臨床癥狀。2種基因型RHDV引起的特征性病理變化均為壞死性肝炎[15]。值得注意的是，研究發現RHDV2在野外環境中已逐漸取代RHDV1[16]，這為RHDV防治帶來了新的挑戰。

目前針對RHDV1已建立多種診斷方法，如抗原捕獲夾心ELISA、逆轉錄PCR（RT-PCR）、實時定量RT-PCR（RT-qPCR）和免疫電鏡等[17-18]。隨著RHD2暴發流行，亟需建立能區分2種基因型的診斷方法。雖然RT-qPCR具有高敏感性和特異性，但現有方法步驟較多且無法同時檢測2種基因型毒株。為此，本研究擬通過分析RHDV1和RHDV2的VP6O基因序列，設計特異性引物和探針，建立一步法雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系，旨在為兔出血癥病毒的防治和流行病學研究提供技術支持。

1材料與方法

1.1病毒樣本

輪狀病毒、兔多殺性巴氏桿菌、兔支氣管敗血波氏菌、綠膿桿菌、沙門氏菌、兔出血癥病毒1型、兔出血癥病毒2型cDNA均由本實驗室 -80°C 保存備用。臨床樣本為2022年采集自山東、河南、四川、安徽和等地兔場的疑似感染RHDV的家兔肝臟組織，以及本實驗室保存的鼻肛拭子樣本。重組質粒pMD18-T-VP60-1、pMD18-T-VP60-2由本實驗室構建，分別含有RHDV1VP6O基因和RHDV2VP60基因。

1.2 試劑與儀器

RNA提取試劑RNAisoPlus、一步法RT-PCR試劑盒One Step PrimeScriptTM RT-PCRKit（PerfectRealTime）購自TaKaRa公司。PCR儀為杭州博日科技有限公司產品。紫外凝膠成像系統為伯樂生命醫學產品有限公司產品。QuantStudio1熒光定量PCR 儀為美國 Applied Bio-systems 公司產品。

1.3 引物設計

采用NanoDrop測定重組質粒濃度并計算拷貝數，用 ddH₂O 將重組質粒pMD18-T-VP60-1（61.8ng/μL ）和pMD18-T-VP60-2（ 75.5ng/μL 分別稀釋至 1μL 1×10¹⁰ 拷貝。通過BLAST比對分析，選取保守區域設計引物和探針，所有引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物和探針序列如表1所示。

1.4 反應體系優化

按照One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit說明書，采用 20μL 體系以及表1中的引物和探針擴增質粒標準品。通過優化引物濃度（ 0.1μmol/L，0.2 μmol/L，0.3μmol/L，0.4μmol/L，0.6μmol/L，0.8 μmol/L 和 1.0μmol/L ）、探針濃度（ 0.1μmol/L?0.2 μmol/L，0.3μmol/L，0.4μmol/L，0.6μmol/L，0.8 μmol/L 和 1.0μmol/L ）、退火溫度 和65^°C ）等參數，建立最佳雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR 體系。

1.5 標準曲線的建立

將pMD18-T-VP60-1質粒（ 1μL1×10¹⁰ 拷貝）和pMD18-T-VP60-2質粒 1μL1×10¹⁰ 拷貝）等體積混合。將混合質粒10倍梯度稀釋為 10⁴ 拷貝，分別使用雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系進行擴增，使用QuantStudioTMDesignamp;AnalysisSoftware生成標準曲線。

1.6特異性試驗

分別使用雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系擴增兔支氣管敗血波氏菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、兔多殺性巴氏桿菌、輪狀病毒的cDNA以及pMD18-T-VP60-1（ 1μL1×10⁸ ）和pMD18-T-VP60-2（ 1μL1×10⁸ ）等體積混合質粒，以 ddH₂0 為對照，進行特異性檢測。

1.7 敏感性試驗

將pMD18-T-VP60-1質粒 1μL1×10¹⁰ 拷貝）和pMD18-T-VP60-2質粒（ 1μL1×10¹⁰ 拷貝）等體積混合。將混合質粒10倍梯度稀釋為 1μL1×10⁸～1× 10¹ 拷貝，分別使用雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系進行擴增，以 ddH₂0 為對照，進行敏感性檢測。同時按照《兔出血癥診斷技術》（NY/T572-2023）中常規RT-PCR體系擴增質粒。

1.8 重復性試驗

將pMD18-T-VP60-1質粒（ 1μL （204號 1×10¹⁰ 拷貝）和pMD18-T-VP60-2質粒（ 1μL1×10¹⁰ 拷貝）等體積混合。將混合質粒10倍梯度稀釋為 1μL1×10⁶ 拷貝、1×10⁵ 拷貝和 1×10⁴ 拷貝，分別使用雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系進行擴增，并進行組內重復檢測和組間重復檢測（各3次重復）。以 Ct 值的變異系數評估該方法的重復性。

1.9 臨床樣本的檢測

使用雙重 TaqMan 熒光定量RT-PCR體系和常規RT-PCR體系分別對112份臨床樣本（60份肝臟組織和52份鼻肛拭子）進行檢測。

2 結果與分析

2.1 雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系

本研究對引物濃度、探針濃度、退火溫度等參數進行優化，最終建立 20μL 雙重 TaqMan 熒光定量RT-PCR體系： 2×One Step RT-PCR Buffer I 10.0 μL ，上下游引物（ 10μmol/L ）各 0.6μL ，ROXRefer-ence Dye I（ 50× ） 0.4μL ，兩種熒光探針（10μmol/L 各 0.8μL ，待測樣本 2.0μL ddH₂O 4.8μL 。反應程序設定為： 42°C5min 95^°C 10s， 95^°C 4 個循環。

2.2雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系標準曲線

如圖1所示，RHDV1熒光強度與質粒拷貝數的標準曲線方程為 Y=-3.323 1lgx+14. 168 ，相關系數（r）=0.999 ，擴增效率為 99.94% ;RHDV2熒光強度與質粒拷貝數的標準曲線方程為 Y=-3.301 1lgx+ 13.536，相關系數 ξ（r）=0.999 ，擴增效率為 100.88% 。熒光強度與質粒拷貝數之間呈現出良好的線性關系，表明本研究建立的雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系可靠，能夠滿足定量分析的要求。

2.3雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系的 特異性檢驗

利用本研究建立的雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系分別對兔支氣管敗血波氏菌、兔多殺性巴氏桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、輪狀病毒的cD-NA以及pMD18-T-VP60-1和pMD18-T-VP60-2混合質粒進行檢測。如圖2所示，僅pMD18-T-VP60-1和pMD18-T-VP60-2擴增產生特異性擴增曲線，表明本研究構建的方法特異性較好。

圖2雙重 TaqMan 探針熒光定量RT-PCR體系的擴增曲線 Fig.2Amplificationcurves ofthedual TaqManprobe quantitativeRT-PCRsystem

2.4雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系的 敏感性檢驗

如圖3所示，本研究建立的雙重 TaqMan 探針 熒光定量RT-PCR體系最低檢測限為 1μL 1×10² 拷 貝。常規RT-PCR體系對質粒pMD18-T-VP60-1的 最低檢測限為 1μL 1×10⁴ 拷貝，對質粒pMD18-TVP60-2的最低檢測限為 1μL 1×10³ 拷貝。雙重 TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系的靈敏度為常 規RT-PCR體系的 10～100 倍。

2.5雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系的 重復性分析

根據雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系得到的 Ct 值，計算其變異系數。如表2所示，組內重復和組間重復的變異系數均小于 3% ，表明建立的雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系穩定性較好。

2.6 臨床樣本檢測

利用已建立的雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系和常規RT-PCR體系分別對60份肝臟組織和52份鼻肛拭子進行檢測。如表3所示，利用本研究建立的雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR體系檢出16份感染RHDV1的肝臟組織、27份感染RHDV2的肝臟組織、2份RHDV1、RHDV2混合感染的肝臟組織、3份攜帶RHDV1的鼻肛拭子、29份攜帶RHDV2的鼻肛拭子，檢出率為 69% ；用常規RT-PCR體系檢出14份感染RHDV1的肝臟組織、23份感染RHDV2的肝臟組織、20份攜帶RHDV2的鼻肛拭子，檢出率為 51% 。表明本研究建立的雙重Taq-Man探針熒光定量RT-PCR體系優于常規RT-PCR體系。

3 討論與結論

兔出血癥病毒（RHDV）引起的兔出血癥是家兔的重要傳染病。RHDV2在法國被首次發現，并迅速在歐洲蔓延，目前已傳播至澳大利亞、非洲、北美和亞洲[19-21]。RHDV2具有與RHDV1相似的高致病性，其快速傳播能力和高致死率引起了廣泛關注[22] 。

目前，傳統組織滅活疫苗對RHDV2感染的保護效果有限，缺乏有效的交叉保護。RHDV2在中國兔場廣泛流行，給養兔業造成嚴重損失。目前已經建立了多種診斷RHD1和RHD2的方法，如病毒分離 RT-PCR^[23] 、實時 RT-PCR^[24-26] 、ELISA等方法。SYBRGreen或 TaqMan 能夠產生特異性熒光信號，且其靈敏度較高，已被廣泛用于病毒檢測[22.27]。本研究基于RHDVVP6O設計引物和探針，通過優化反應條件和體系，建立雙重 TaqMan 探針熒光定量RT-PCR檢測體系： 2×One Step RT-PCR Buffer III10.0μL ，上下游引物（ 10μmol/L 各 0.6μL ，ROXReferenceDye II（ 50× ） 0.4μL ，兩種熒光探針（10μmol/L 各 0.8μL ，待測樣本 2.0μL，ddH₂O 4.8 μL 。反應程序設定為； ：42%5min，95%10s，95% 5s，60%30s，40 個循環。該體系對RHDV1和RHDV2具有高度特異性，檢測靈敏度達到 1μL 100拷貝，是常規RT-PCR體系靈敏度的10＼～100倍。重復性試驗結果表明， Ct 值變異系數為 0.2%～2.9% ，表明該方法穩定性較好。

與現有檢測技術相比，本研究采用一步法直接檢測樣本RNA，并通過兩種探針實現RHDV1和RHDV2的同步檢測，顯著縮短檢測時間，簡化操作流程，更適用于臨床樣本的高通量篩查。該方法兼具高特異性和高靈敏度的優勢，可大幅提升臨床檢測效率，為RHD的快速診斷與防治提供技術支持，并為后續開發商業化診斷試劑盒研制奠定基礎

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（責任編輯：成紓寒）