基于RPA技術的紅火蟻快速可視化檢測方法

摘""要：紅火蟻（Solenopsis"invicta）是一種原產于南美洲的嚴重入侵害蟲，目前已在我國廣泛分布，對農業、自然生態系統及公共衛生造成嚴重威脅。出入境檢疫作為防止紅火蟻入侵和擴散的關鍵環節，需要在短時間內對檢疫對象進行準確鑒定。現有紅火蟻鑒定方法包括形態學鑒定、DNA條形碼、免疫檢測及環介導等溫擴增等技術，這些技術均存在一定局限性，在簡便性、檢測時間和靈敏度等方面難以滿足快速檢測的要求。重組聚合酶擴增技術（recombinase"polymerase"amplification，"RPA）是一種具有反應條件簡單、靈敏度高及擴增效率高的等溫擴增技術。為實現紅火蟻快速、準確的現場檢測，本研究基于RPA技術，建立了一種紅火蟻可視化快速檢測方法。通過分析NCBI數據庫中紅火蟻及其近緣種、形近種的線粒體基因組序列，比對后選取線粒體NADH2脫氫酶基因作為擴增目標，并設計了RPA特異性引物。結果表明：設計引物對紅火蟻具有高度特異性；瓊脂糖凝膠電泳檢測的RPA反應靈敏度達到1.0×10?4"ng/μL，為PCR反應靈敏度的1.0×103倍。同時通過檢測添加核酸染料后的熒光反應開發了可視化檢測技術，可視化熒光檢測的靈敏度約為1.0×10?1"ng/μL。最后本研究探索了DNA樣品的快速提取方法，采用無菌超純水研磨螞蟻樣品，并在100"℃水浴加熱1"min條件下成功粗提DNA，取代傳統DNA提取過程。本方法可在37"℃下完成對紅火蟻基因的擴增，并通過熒光反應判斷檢測結果，30"min內完成對紅火蟻的快速檢測，為紅火蟻的檢疫和防控提供了方便、快速、準確、可靠的技術支持。

關鍵詞：紅火蟻；重組聚合酶擴增；可視化；快速檢測；靈敏度中圖分類號：Q968.1；S433""""""文獻標志碼：A

A"Rapid"Visual"Detection"Method"for"Red"Fire"Ants"Based"on"RPA"Technology

QIN"Lei，"ZHANG"Xufeng，"YUAN"Hongchao，"GUO"Jixing，"ZHOU"Xiang*

School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University"/"Key"Laboratory"of"Green"Prevention"and"Control"of"Tropical"Plant"Diseases"and"Pests"（Ministry"of"Education），"Danzhou，"Hainan"571700，"China

Abstract："Red"fire"ant，"Solenopsis"invicta，"a"serious"invasive"pest"native"to"South"America，nbsp;has"been"widely"distributed"in"China，"posing"significant"threats"to"agriculture，"natural"ecosystems，"and"public"health."Effective"entry-exit"quarantine"measures"are"essential"to"prevent"the"invasion"and"spread"of"S."invicta，"which"requires"rapid"and"accurate"identification"of"the"pest."Existing"detection"methods，"including"morphological"identification，"DNA"barcoding，"immunoassay，"and"loop-mediated"isothermal"amplification"（LAMP）"have"limitations"in"simplicity，"detection"speed"and"sensitivity."Recombinase"polymerase"amplification"（RPA）"is"an"isothermal"amplification"technique"characterized"by"its"simplicity，"high"sensitivity，"and"efficient"amplification."To"enable"rapid"and"accurate"on-site"detection"of"S."invicta，"this"study"developed"a"visual"detection"method"based"on"RPA"technology."Mitochondrial"genome"sequences"of"S."invicta"and"closely"related"or"morphologically"similar"species"were"analyzed"using"data"from"the"NCBI"database."The"mitochondrial"NADH2"dehydrogenase"gene"was"selected"as"the"target"for"amplification，"and"specific"RPA"primers"were"designed."Experimental"results"confirmed"that"the"primers"demonstrated"high"specificity"for"S."invicta."Sensitivity"testing"using"agarose"gel"electrophoresis"revealed"that"the"RPA"reaction"could"detect"as"low"as"1.0×10?4"ng/μL，"which"is"103"times"more"sensitive"than"conventional"PCR."A"visual"detection"method"was"further"developed"by"incorporating"nucleic"acid"dyes"into"the"reaction，"achieving"a"sensitivity"of"approximately"1.0×10?1"ng/μL."Additionally，"a"rapid"DNA"extraction"method"was"explored."This"method"involved"grinding"ant"samples"in"sterile"water"followed"by"heating"at"100"℃"in"a"water"bath"for"one"minute，"which"successfully"yielding"crude"DNA."The"developed"method"enables"gene"amplification"of"S."invicta"at"37"℃，"with"detection"results"assessed"via"fluorescence"reactions，"completing"the"entire"process"within"30"minutes."This"approach"provides"a"convenient，"rapid，"accurate，"and"reliable"technical"method"for"detecting"S."invicta，"offering"valuable"technical"support"for"its"quarantine，"prevention"and"control.

Keywords："Solenopsis"invicta;"recombinant"polymerase"amplification;"visualization;"rapid"detection;"sensitivity

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.023

紅火蟻（Solenopsis"invicta）原生于南美洲巴拉那河流域[1]，被認為是世界上最危險的100種惡性入侵物種之一[2]。在全球化貿易背景下，紅火蟻隨著人類活動，借助各類交通工具在全球范圍內快速傳播擴散[3]。我國最早在2003年于臺灣省桃園、嘉義發現紅火蟻入侵，隨后2004年在廣東省吳川市出現，此后分布范圍不斷擴大。截至2021年，華南、華中、華東和西南地區的12個省份均有紅火蟻發生的報道[4]。紅火蟻具有極強的破壞力和環境適應能力，能夠在農田、綠化帶、草地等多種生境中迅速定殖并成為優勢種，給農業生產、生態、城市及公共衛生等方面帶來嚴重危害[5-8]。

紅火蟻的入侵主要通過人類活動傳播，例如隨苗木和土壤運輸等途徑擴散[9]。檢疫措施是防止紅火蟻進一步擴散的重要手段[10]，而快速、準確的檢測技術是檢疫工作的關鍵。目前紅火蟻的鑒定依賴形態學和DNA條碼技術鑒定，但紅火蟻的體型小，形態特征不易觀察，特別是在脫離蟻巢后，直觀識別難度大，需借助體視顯微鏡并依賴專業人員的經驗。而DNA條碼技術雖然準確性高，但檢測流程繁瑣，耗時較長，難以滿足現場快速檢測的需求。VALLES等[11]開發了基于紅火蟻特異性毒液蛋白的單克隆抗體檢測法，但該方法需要至少5只工蟻的毒液蛋白，靈敏度較低，當捕獲的蟻群較少時難以滿足檢測需求。LAMP技術被開發用于紅火蟻檢測[12]，但LAMP技術容易受氣溶膠污染產生假陽性，此外反應需要60"℃和90"℃"2個反應溫度，需要儀器設備且操作流程相對繁瑣，檢測時間較長[13-17]。因此，開發一種準確、高效、簡便的紅火蟻檢測方法具有重要意義。重組聚合酶擴增（recombinase"polymerase"amplification，"RPA）是一種不通過高溫解旋，利用酶打開模板鏈，不需要高溫使DNA變性，也不需要高溫進行擴增反應[18]，不依賴PCR儀完成核酸指數擴增的恒溫擴增技術，反應條件簡單，在25～43"℃恒溫條件下即可實現核酸的指數擴增[19-20]。相對PCR和其他恒溫擴增技術，如環介等溫擴增（loop-mediated"isothermal"amplification，"LAMP），反應時間更短，條件更簡單，靈敏度更高。自2006年報道以來[21]，RPA已被廣泛應用于多種有害生物的現場快速檢測。本研究開發了一種基于RPA技術的紅火蟻可視化檢測方法，快速高效、簡便易行，靈敏準確，對于防控紅火蟻的進一步擴散具有重要的應用價值。

1""材料與方法

1.1""材料

1.1.1""供試蟲源""紅火蟻（Solenopsis"invicta）、法老小家蟻（Monomorium"pharaonis）采自海南省儋州市海南大學儋州校區，熱帶火蟻（S."geminata）采自海南省海口市那央村，廣大頭蟻（Pheidole"megacephala）采自海南省樂東黎族自治縣尖峰嶺，細紋毛切葉蟻（Trichomyrmex"destructor）、邁氏毛切葉蟻（T."mayri）采自海南省瓊中黎族自治縣黎母山。螞蟻樣本均為成蟲，保存在無水乙醇中，存放于?20"℃冰箱內。

1.1.2""主要試劑""血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、大腸桿菌感受態（DH5α）購自天根生化科技（北京）有限公司，Premix"Taq酶、載體pMD?18-T購自寶日醫生物技術（北京）有限公司，RPA基礎擴增試劑盒購自英國TwistDx公司；PCR產物純化試劑盒購自德國默克公司。

1.2"""方法

1.2.1""DNA提取""用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書，分別提取幾種螞蟻樣本DNA，用超微量紫外分光光度計（歐洲米歐儀器有限公司）對提取DNA的濃度及質量進行測定，保存在?20"℃冰箱內備用。

1.2.2""PCR擴增及物種鑒定""COI基因通用引物LCO1490和HCO2198[22]由擎科生物科技股份有限公司（海口）合成，對各螞蟻樣本的DNA進行PCR反應擴增，PCR反應使用25"μL體系，包括12.5"μL"Premix"Taq、9.5"μL無菌超純水、1.0"μL"DNA模板和正、反向引物（10.0"μmol/L）各1"uL。LCO1490的PCR反應條件：94"℃預變性1"min；94"℃變性40"s，45"℃退火30"s，72"℃延伸1"min，預擴增5個循環；HCO2198的PCR反應條件：94"℃變性40"s，51"℃退火40"s，72"℃延伸1"min，35個循環；72"℃延伸5"min。將PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，使用DNA純化回收試劑盒對目的條帶進行純化回收，將純化產物和載體pMD?18-T連接，取連接產物轉化到感受態（DH5α）中，篩選陽性克隆，將菌液送往擎科生物科技股份有限公司（海口）測序。

1.2.3""引物設計""引物按照TwistAmp?檢測設計手冊指南（https：//www.twist"dx.co.uk）設計，根據NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的紅火蟻線粒體全基因組與試驗中5種近緣種和形體近似螞蟻的線粒體全基因組用MEGA"11進行比對，找到紅火蟻的特異性堿基位點，最終選取長度為961"bp的紅火蟻的線粒體NADH脫氫酶2（ND2）基因序列，使用Primer"Premier"5軟件設計引物，將設計引物序列在NCBI使用Primer-BLAST功能對引物進行分析篩選，得到ND2F和ND2R，初步檢驗引物的特異性，篩選出特異性良好的引物，并由擎科生物科技股份有限公司（海口）合成（表1）。

1.2.4""PCR驗證引物特異性""對RPA引物進行PCR反應驗證特異性，在25"μL體系中進行，體系包括12.5"μL"Premix"Taq酶，10"μL無菌超純水，正反向引物各1"μL，0.5"μL"DNA模板。PCR擴增反應程序：94"℃預變性5"min；94"℃變性30"s；58"℃退火30"s；72"℃延伸30"s，30個循環；72"℃延伸10"min。取20"μL反應產物，在3%瓊脂糖凝膠100"V恒壓電泳30"min，電泳結束后在凝膠成像系統紫外透射下觀察并且保存結果。

1.2.5nbsp;"RPA驗證引物特異性""對引物進行RPA反應檢驗，按照試劑盒進行操作，RPA反應體系為50"μL體系，包括29.5"μL"Rehydration"buffer，11.2"μL無菌超純水，正反向引物各2.4"μL，1"μL"DNA模板，2.5"μL"280"mmol/L醋酸鎂[Mg（CH3COO）2]溶液，簡寫為MgOAc，先將Rehydration"buffer、無菌超純水、正反向引物混勻后加入反應管溶解管中的酶，后加入DNA模板和MgOAc，充分震蕩混勻后離心，在PCR儀上37"℃孵育20"min終止反應。將反應產物按照PCR產物純化試劑盒說明書進行純化后，取20"μL與2"μL"10×loading"buffer混勻點樣，在3%瓊脂糖凝膠上100"V恒壓電泳30"min，電泳結束后在凝膠成像系統紫外透射下觀察并且保存結果。

1.2.6""反應終點的可視化""將螞蟻DNA進行RPA反應后產物中加入1"μL的SYBR"GREEN"Ⅰ"核酸染料震蕩離心后，放在激發光源下進行觀察。

1.2.7""RPA反應的靈敏度檢驗""將初始濃度為100"ng/μL紅火蟻DNA模版按照梯度依次稀釋至1.0×101、1.0、1.0×10?1、1.0×10?2、1.0×10?3、1.0×"10?4、1.0×10?5"ng/μL，PCR和RPA的體系不變，分別進行RCR和RPA反應，PCR結果通過瓊脂糖凝膠電泳驗證，RPA結果通過瓊脂糖凝膠電泳和熒光反應驗證。

1.2.8""DNA快速提取方法的探索""參照PRITI等[23]在棕櫚薊馬RPA檢測中的DNA快速提取方法。在1.5"mL離心管中加入50"μL無菌超純水，用研磨棒對螞蟻進行充分研磨，研磨后將離心管在100"℃水浴鍋中水浴加熱1"min得到螞蟻DNA粗提液。用12.2"μL的粗提液等體積代替原體系中11.2"μL無菌超純水和DNA進行RPA反應，將反應產物按照PCR產物純化試劑盒說明書進行純化后，取20"μL與2"μL"10×loading"buffer混勻點樣，在3%瓊脂糖凝膠上100"V恒壓電泳50"min，電泳結束后在凝膠成像系統紫外透射下觀察并且保存結果。

將待檢測螞蟻放入裝有50"μL無菌超純水的離心管中用研磨棒研磨，將離心管放入便攜式金屬浴中100"℃加熱1～2"min，取11.2"μL粗提液加入提前混入引物與buffer的反應管中，加入2.5"μL"MgOAc顛倒混勻，將反應管握在手中或放入37"℃便攜式金屬浴水浴加熱20"min后，加入1"μL"SYBR"GREEN"Ⅰ核酸染料，搖勻后在激發光源下觀察。

2""結果與分析

2.1""紅火蟻及近似種鑒定

COI通用引物擴增產物的凝膠電泳結果如圖1所示，1～6號泳道均出現條帶，表明目標片段擴增成功。通過NCBI的BLAST工具將測序結果與數據庫中的物種基因序列進行比對，序列同源性均大于98%，可確認螞蟻樣本物種。

2.2""RPA引物特異性分析

首先利用普通PCR對RPA引物的特異性進行分析，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示，1號泳道有明顯條帶，2～6泳道無條帶出現，引物特異性良好。

RPA反應瓊脂糖凝膠電泳結果如圖3所示，泳道1有明顯條帶，泳道2～6無條帶出現，引物在RPA反應中特異性良好。

2.3""可視化熒光檢測分析

對5種螞蟻DNA樣品進行RPA反應，反應后向體系內加入1"μL"SYBR"GREEN核酸染料，震蕩混勻。結果顯示，1號管的樣品在激發光源下呈顯著熒光，2～6號管無熒光現象（圖4）。

2.4""PCR與RPA反應靈敏度檢測

利用普通PCR方法分析RPA引物對不同濃度模版檢測靈敏度，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，1～3號泳道有明顯條帶，4號泳道隱約可見條帶，5號泳道無條帶出現，PCR反應的靈敏度檢測最低限度為1.0×10?1"ng/μL（圖5）。

RPA反應的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示1～4號泳道有明顯條帶，5～7號泳道隱約可見條帶，8號泳道無條帶出現，RPA反應的靈敏度檢測最低限度為1.0×10?4"ng/μL（圖6）。

可視化熒光檢測結果顯示，1～3號管可檢測到顯著熒光信號，4～6號管未檢測到熒光信號，RPA反應的可視化熒光檢測靈敏度檢測最低限度為1.0×10?1"ng/μL（圖7）。

2.5""DNA快速提取方法的探索

將粗提的DNA進行RPA反應，再將反應產物純化后進行瓊脂糖凝膠電泳，據瓊脂糖凝膠電泳結果，泳道1有明顯的條帶，證明引物對紅火蟻粗提的DNA成功擴增（圖8）。該結果同時證明，可用粗提DNA的方式代替DNA提取，來達到減少檢測時間，提高檢測效率的目的。

以粗提DNA代替試劑盒提取DNA過程，RPA反應后向體系加入1"μL"SYBR"GREEN核酸染料，在激發光源下，管1有顯著熒光現象（圖9）。據該結果，可用向體系中加入核酸染料在激發光源下觀察是否有熒光現象代替瓊脂糖凝膠電泳，進而減少檢測時間，提高檢測效率。

3""討論

紅火蟻作為一種適應能力極強、危害嚴重的入侵害蟲，已引起全球范圍的高度關注[24]。紅火蟻通過人類活動、苗木及土壤等途徑傳播擴散，全球諸多地區均存在紅火蟻入侵的潛在風險，隨著經濟貿易全球化，世界各國之間貿易往來頻繁，增加了紅火蟻通過人類活動隨交通工具進行傳播的風險。紅火蟻一旦定殖，紅火蟻對農業、環境、城市基礎設施及人類健康都會造成嚴重危害。目前檢疫仍是預防紅火蟻入侵最有效的手段，國內外對紅火蟻檢疫工作越來越重視，快速、準確的分子檢測技術對紅火蟻的早期防控至關重要。本研究開發了一種基于RPA技術的紅火蟻可視化檢測方法，快速高效、簡便易行，靈敏準確，對于防控紅火蟻的進一步擴散具有重要的應用價值。

RPA檢測為紅火蟻分子鑒定提供了新的方式，相較于DNA條形碼、免疫檢測法、LAMP等方法，RPA檢測時間更短，靈敏度更高，操作更簡便，無需儀器即可完成，適用于各個場景，為其他膜翅目害蟲的分子鑒定提供了可借鑒的技術支持。現階段RPA等溫擴增技術已被廣泛應用于病原菌和病毒的快速檢測，但在昆蟲的鑒定和檢疫中，應用案例較少。PRITI等[23]建立了基于RPA反應的棕櫚薊馬快速檢測方法，是RPA等溫擴增在昆蟲的檢測與檢疫的首次應用，該方法無需PCR儀等設備即可在30"min內完成檢測，僅通過觀察反應前后指示劑顏色變化就能判斷反應結果；LEWALD等[25]基于RPA技術結合Cas12a，建立了番茄潛葉蛾（Phthorimaea"absoluta）的快速檢測方法，該方法僅需0.1"ng的DNA作為模板即可完成擴增，且僅需簡單的紫外激發光源就能判斷反應結果，方法簡便對操作人無知識儲備要求；SHASHANK等[26]結合了RPA和CRISPR，相比實時熒光定量PCR，RPA反應時間更短，靈敏度更高，對番茄莖麥蛾、番茄潛葉蛾和斜紋夜蛾（Spodoptera"litura）準確性達到了100%。ZENG等[27]建立的谷斑皮蠹（Tro g od erma"granarium）RPA和CRISPR/Cas12a快速可視化檢測，能夠在40"min完成對目標的檢測，靈敏度達到了1.0×"10?1"ng/μL，王雅娜等[28]建立的基于RPA-CRISPR/"Cas12a的美國白蛾可視化快速檢測通過RPA擴增目標序列，結合CRISPR檢測技術并對反應條件進行優化，最終該體系靈敏度可檢測的最低限度為1.0×10?1"ng/μL，檢測體系在30"min內即可實現對害蟲的現場快速、可視化、精準鑒定。

為有效防控紅火蟻，在檢疫中快速、準確地鑒定紅火蟻，本研究對紅火蟻和近緣種和近似種的螞蟻通過RPA反應對目標序列擴增，實現對紅火蟻的快速鑒定。為滿足在野外以及海關口岸等場景下快速檢測的目的，應精簡反應所需設備與流程。RPA反應所需溫度和人體溫接近，將反應的試管握在手中20"min代替PCR儀或在37"℃便攜式金屬浴中加熱，皆可完成RPA反應。在現場檢測場景中，若無凝膠成像系統，則無法觀察瓊脂糖凝膠電泳的結果，同時瓊脂糖凝膠電泳耗時較長，不符合現場檢測簡便性這一重要原則，故采取使用熒光染料作為反應終點的指示劑代替瓊脂糖凝膠電泳過程。成功擴增的核酸被核酸染料染色，在激發光源下，有顯著熒光現象。反應后在藍光或紫外燈等激發光源下有顯著熒光現象，靈敏度約為1.0×10?1"ng/μL，時間比RPA結合瓊脂糖凝膠電泳減少了30"min，比LAMP反應減少了60"min。該檢測方法經多次重復檢驗，重復性良好，且鑒定結果實現可視化，適用場景包括海關口岸、田間以及缺少實驗設備的地方，該方法在發現殘缺蟲體，難以區分時，仍可以準確鑒定，同時該方法使用簡便，非專業人員仍可按方法準確鑒別。新方法為紅火蟻的檢疫防控提供了技術支持，同時為其他檢疫害蟲的快速檢測提供了經驗。

本研究相比形態學鑒定、DNA條形碼、LAMP等方法，有檢測時間更短，靈敏度更高等優點。但是同時目前該方法仍存在不足之處，該檢測體系有待進一步改進。包括指示劑的改良，羥基萘酚藍作為指示劑相比熒光染料更加簡便，無需激發光源即可觀察檢測結果，但在該方法中測試反應前后顏色變化不明顯，有待進一步研究。

參考文獻

[1]"CALLCOTT"A"M"A，"COLLINS"H"L."Invasion"and"range"expansion"of"imported"fire"ants"（Hymenoptera："Formicidae）"in"North"America"from"1918—1995[J]."Florida"Entomologist，"1996，"79（2）："240-251.

[2]"GLORIA"M"L，"CéLINE"B，"CLEO"B，"ELSA"B，"PIERO"G，"DANIEL"S，"FRANCK"C."The"100th"of"the"world’s"worst"invasive"alien"species[J]."Biological"Invasions，"2014，"16："981-985.

[3]"ASCUNCE"M"S，"YANG"C"C，"OAKEY"J，"CALCATERRA"L，"WU"W"J，"SHIH"C"J，"GOUDET"J，"ROSS"K"G，"SHOEMA KER"D."Global"invasion"history"of"the"fire"ant"Solenopsis"invicta[J]."Science，"2011，"331（6020）："1066-1068.

[4]"陸永躍，"曾玲，"許益鐫，"王磊."外來物種紅火蟻入侵生物學與防控研究進展[J]."華南農業大學學報，"2019，"40（5）："149-160.LU"Y"Y，"ZENG"L，"XU"Y"J，"WANG"L."Research"progress"of"invasion"biology"and"management"of"red"imported"fire"ant[J]."Journal"of"South"China"Agricultural"University，"2019，"40（5）："149-160."（in"Chinese）

[5]"ROEDER"K"A，"PENUELA"USECHE"V，"LEVEY"D"J，"RESASCO"J."Testing"effects"of"invasive"fire"ants"and"disturbance"on"ant"communities"of"the"longleaf"pine"ecosystem[J]."Ecological"Entomology，"2021，"46（4）："964-972.

[6]"MCGLYNN"T"P."The"worldwide"transfer"of"ants："geographical"distribution"and"ecological"invasions[J]."Journal"of"Biogeography，"1999，"26（3）："535-548.

[7]"MORRISON"L"W."Long-term"impacts"of"an"arthropod"community"invasion"by"the"imported"fire"ant，"Solenopsis"invicta[J]."Ecology，"2002，"83（8）："2337-2345.

[8]"GOTELLI"N"J，"ARNETT"A"E."Biogeographic"effects"of"red"fire"ant"invasion[J]."Ecology"Letters，"2000，"3（4）："257-261.

[9]"曾玲，"陸永躍，"何曉芳，"張維球，"梁廣文."入侵中國大陸的紅火蟻的鑒定及發生為害調查[J]."昆蟲知識，"2005（2）："144-148，"230-231.ZENG"L，"LU"Y"Y，"HE"X"F，"ZHANG"W"Q，"LIANG"G"W."Identification"of"red"imported"fire"ant"Solenopsis"invicta"to"invade"Chinese"mainland"and"infestation"in"Wuchuan"Guangdong[J]."Chinese"Bulletin"of"Entomolog，"2005，"42（2）："144-148，"230-231."（in"Chinese）

[10]"鄭華，"趙宇翔."外來有害生物紅火蟻風險分析及防控對策[J]."林業科學研究，"2005，"18（4）："479-483."ZHENG"H，"ZHAO"Y"X."Alien"pest"risk"analysis"and"control"countermeasure"of"Solenopsis"invicta"Buren[J]."Forest"Research，"2005，"18（4）："479-483."（in"Chinese）

[11]"VALLES"S"M，"STRONGnbsp;C"A，"CALLCOTT"A"M"A."Development"of"a"lateral"flow"immunoassay"for"rapid"field"detection"of"the"red"imported"fire"ant，"Solenopsis"invicta"（Hymenoptera："Formicidae）[J]."Analytical"and"Bioanalytical"Chemistry，"2016，"408："4693-4703.

[12]"NAKAJIMA"N，"SAKAMOTO"Y，"GOKA"K."Rapid"detection"of"the"red"fire"ant"Solenopsis"invicta"（Hymenoptera："Formicidae）"by"loop-mediated"isothermal"amplification[J]."Applied"Entomology"and"Zoology，"2019，"54："319-322.

[13]"LI"J，"MACDONALD"J."Advances"in"isothermal"amplification："novel"strategies"inspired"by"biological"processes[J]."Biosensors"and"Bioelectronics，"2015，"64："196-211.

[14]"DENG"H，"GAO"Z."Bioanalytical"applications"of"isothermal"nucleic"acid"amplification"techniques[J]."Analytica"Chimica"Acta，"2015，"853："30-45.

[15]"KIM"J，"EASLEY"C"J."Isothermal"DNA"amplification"in"bioanalysis："strategies"and"applications[J]."Bioanalysis，"2011，"3（2）："227-239.

[16]"DE"PAZ"H"D，"BROTONS"P，"MU?OZ-ALMAGRO"C."Molecular"isothermal"techniques"for"combating"infectious"diseases："towards"low-cost"point-of-care"diagnostics[J]."Expert"Review"of"Molecular"Diagnostics，"2014，"14（7）："827-843.

[17]"ALMASSIAN"D"R，"COCKRELL"L"M，"NELSON"W"M."Portable"nucleic"acid"thermocyclers[J]."Chemical"Society"Reviews，"2013，"42（22）："8769-8798.

[18]"孫魁，"邢微微，"徐東剛."重組酶聚合酶擴增技術的研究進展[J]."軍事醫學，"2015，"39（10）："802-804，"807.SUN"K，"XING"W"W，"XU"D"G."Advances"in"recombinase"polymerase"amplification[J]."Military"Medical"Sciences，"2015，"39（10）："802-804，"807."（in"Chinese）

[19]"LILLIS"L，"LEHMAN"D，"SINGHAL"M"C，"CANTERA"J，"SINGLETON"J，"LABARRE"P，"TOYAMA"A，"PIEPENB U RG"O，"PARKER"M，"WOOD"R，"OVERBAUGH"J，"BOYLE"D"S."Non-instrumented"incubation"of"a"recombinase"polymerase"amplification"assay"for"the"rapid"and"sensitive"detection"of"proviral"HIV-1"DNA[J]."PLoS"One，"2014，"9（9）："108-189.

[20]"SHEN"F，"DAVYDOVA"E"K，"DU"W，"KREUTZ"J"E，"PIEPENBURG"O，"ISMAGILOV"R"F."Digital"isothermal"quantification"of"nucleic"acids"via"simultaneous"chemical"initiation"of"recombinase"polymerase"amplification"reactions"on"SlipChip[J]."Analytical"Chemistry，"2011，"83（9）："3533-"3540.

[21]"PIEPENBURG"O，"WILLIAMS"C"H，"STEMPLE"D"L，"AR MES"N"A."DNA"detection"using"recombination"proteins[J]."PLoS"Biology，"2006，"4（7）："e204.

[22]"FOLMER"O，"BLACK"M，"HOEH"W，"LUTZ"R，"VRIJEN HO EK"R."DNA"primers"for"amplification"of"mitochondrial"cytochrome"c"oxidase"subunit"Ⅰ"from"diverse"metazoan"invertebrates[J]."Molecular"Marine"Biology"and"Biotechnology，"1994，"3（5）："294-299.

[23]"PRITI，"JANGRA"S，"BARANWAL"V"K，"DIETZGEN"R"G，"GHOSH"A."A"rapid"field-based"assay"using"recombinase"polymerase"amplification"for"identification"of"Thrips"palmi，"a"vector"of"tospoviruses[J]."Journal"of"Pest"Science，"2021，"94："219-229.

[24]"XU"Y"J，"VARGO"E"L，"TSUJI"K，"WYLIE"R."Exotic"ants"of"the"Asia-Pacific："invasion，"national"response，"and"ongoing"nee ds[J]."Annual"Review"of"Entomology，"2022，"67（1）："27-"42.

[25]"LEWALD"K"M，"SONG"W，"EWEIS-LABOLLE"D，"TRUONG"C，"GODFREY"K"E，"CHIU"J"C."Probe-based"quantitative"PCR"and"RPA-Cas12a"molecular"diagnostics"for"detection"of"the"tomato"pest"Phthorimaea"absoluta"（Lepidoptera："Gelechiidae）[J]."Journal"of"Economic"Entomology，"2023，"116"（3）："993-1001.

[26]"SHASHANK"P"R，"PARKER"B"M，"RANANAWARE"S"R，"PLOTKIN"D，"COUCH"C，"YANG"L"G，"NGUYEN"L"T，"PRASANNAKUMAR"N"R，"BRASWELL"W"E，"JAIN"P"K，"KAWAHARA"A"Y."CRISPR-based"diagnostics"detects"invasive"insect"pests[J]."Molecular"Ecology"Resources，"2023，"24（1）："e13881.

[27]"ZENG"L，"ZHENG"S，"STEJSKAL"V，"OPIT"G，"AULICKY"R，"LI"Z."New"and"rapid"visual"detection"assay"for"Trogoderma"granarium"everts"based"on"recombinase"polymerase"amplification"and"CRISPR/Cas12a[J]."Pest"Management"Science，"2023，"79（12）："5304-5311.

[28]"王雅娜，"于艷雪，"田茜，"張柳，"李紅衛，"楊碩，"翟俊峰."基于RPA-CRISPR/Cas12a的美國白蛾可視化快速檢測新方法[J]."環境昆蟲學報，"2024，"46（5）："1051-1058.WANG"Y"N，"YU"Y"X，"TIAN"Q，"ZHANG"L，"LI"H"W，"YANG"S，"ZHAI"J"F."New"and"rapid"visual"detection"assay"for"Hyphantria"cunea"Drury"based"on"recombinase"polymerase"amplification"and"CRISPR/Cas12a[J]."Journal"of"Environmental"Entomology，"2024，"46（5）："1051-1058."（in"Chinese）