摘""要:桑小頭木虱(Paurocephala"sauteri"Enderlein)是熱帶亞熱帶桑樹重要害蟲,主要為害桑樹頂芽和嫩葉,導致葉片卷曲,難以展開,同時可分泌蠟質,誘發煤煙病,導致桑葉產量和質量顯著下降;為害小苗,可致其全株死亡,嚴重威脅熱帶蠶桑產業的多元化發展。脂酰輔酶A還原酶(FAR)存在于各種生物體內,參與脂肪酸衍生物的生物合成,進而參與繁殖、兩性信息識別與交流、蠟質合成等多項生命活動過程。本研究共篩選到23個桑小頭木虱FAR基因,蛋白分析表明,其中大多數為堿性蛋白,具有親水性;亞細胞定位預測發現,17個FAR蛋白定位于細胞質,1個定位于線粒體,1個定位于細胞核,4個定位于質膜,說明PsmFAR基因發揮功能的主要場所是細胞質。結合其他已知昆蟲FAR基因的功能,以及桑小頭木虱若蟲、雌成蟲、雄成蟲體內及不同部位FAR基因的表達分析發現,桑小頭木虱FAR基因可能參與發育、繁殖、蠟質合成、體表角質層合成、信息素合成及解毒等多個生物學功能,除7個基因可能僅參與蠟質合成功能外,其余16個基因可能參與多個生物學功能,涉及繁殖的有16個(69.56%),涉及蠟質合成的亦有16個(69.56%),與其體表角質層合成相關的有12個(52.17%),與發育相關的有9個(39.13%),與解毒相關的有5個(21.74%),與信息素合成相關的有4個(17.39%)。本研究在轉錄組測序分析的基礎上對桑小頭木虱FAR基因家族進行鑒定、序列組成及表達分析,探究FAR基因在桑小頭木虱生命活動中的功能,為其高效防控技術和針對性藥劑的研發和應用提供理論依據。后續功能的進一步驗證將為以FAR基因為靶標的精準防控藥劑的研發提供依據。
關鍵詞:桑小頭木虱;FAR基因家族;亞細胞定位;基因表達;功能預測分析
中圖分類號:S888.723""""""文獻標志碼:A
Identification"and"Functional"Analysis"of"FAR"Gene"Family"in"Paurocephala"sauteri
LIN"Yating1,"HAO"Yangyang2,"WEI"Hongxian2,"GENG"Tao2,"WANG"Shuchang2*,"LU"Fuping2*
1."Hainan"University,"Haikou,"Hainan"570228,"China;"2."Institute"of"Environment"and"Plant"Protection,"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Key"Laboratory"of"Integrated"Tropical"Crop"Pest"Management,"Ministry"of"Agriculture"and"Rural"Affairs"/"Hainan"Key"Laboratory"of"Tropical"Agricultural"Pest"Monitoring"and"Control,"Haikou,"Hainan"571101,"China
Abstract:"Paurocephala"sauteri"Enderleinnbsp;is"an"important"pest"of"tropical"and"subtropical"mulberry,"which"seriously"threatens"the"diversified"development"of"tropical"sericulture"industry."Fatty"acyl-CoA"reductase"(FAR)"exists"in"various"organisms"and"participates"in"the"biosynthesis"of"fatty"acid"derivatives,"and"then"participates"in"many"life"activities"such"as"wax"synthesis,"reproduction,"sexual"information"recognition"and"communication."A"total"of"23"FAR"genes"were"screened"in"this"study."Protein"analysis"showed"that"most"of"them"were"alkaline"proteins"with"hydrophilicity."Subcellular"localization"prediction"found"that"17"FAR"proteins"were"located"in"the"cytoplasm,"one"FAR"proteinin"the"mitochondria,"one"FAR"protein"in"the"nucleus,"and"four"FAR"proteins"in"the"plasma"membrane,"indicating"that"the"main"place"for"the"PsmFAR"gene"to"function"was"the"cytoplasm."Combined"with"the"function"of"other"known"insect"FAR"genes"and"the"expression"analysis"of"FAR"genes"in"nymphs,"female"adults,"male"adults"and"different"parts"of"P."sauteri,"it"was"found"that"FAR"genes"could"be"involved"in"development,"reproduction,"wax"synthesis,"cuticle"synthesis,"pheromone"synthesis"and"detoxification."In"addition"to"seven"genes"only"involved"in"wax"synthesis,"the"remaining"16"genes"may"be"involved"in"multiple"biological"functions,"including"16"genes"(69.56%)"involved"in"reproduction,"16"genes"(69.56%)"involved"in"wax"synthesis,"12"genes"(52.17%)"involved"in"cuticle"synthesis,"and"nine"genes"(39.13%)"involved"in"development."There"were"five"genes"(21.74%)"related"to"detoxification"and"four"genes"(17.39%)"related"to"pheromone"synthesis."In"this"study,"based"on"the"transcriptome"sequencing"analysis,"the"identification,"sequence"composition"and"expression"analysis"of"the"FAR"gene"family"were"carried"out"to"explore"the"function"of"the"FAR"gene"in"the"life"activities"of"the"P."sauteri,"and"to"provide"a"theoretical"basis"for"its"efficient"prevention"and"control"technology"and"the"development"and"application"of"targeted"insecticides."Further"verification"of"subsequent"functions"would"provide"a"basis"for"the"development"of"precise"prevention"and"control"agents"targeting"the"FAR"gene.
Keywords:"Paurocephala"sauteri"Enderlein;"FAR"gene"family;"subcellular"localization;"gene"expression;"functional"prediction"analysis
DOI:"10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.022
桑小頭木虱(Paurocephala"sauteri"Enderlein)是熱帶亞熱帶桑樹重要害蟲[1-7],主要為害桑樹頂芽和嫩葉,導致葉片卷曲,難以展開,同時可分泌蠟質,誘發煤煙病,導致桑葉產量和質量顯著下降;為害小苗,可致其全株死亡,嚴重威脅熱帶蠶桑產業的多元化發展[8]。
脂酰輔酶A還原酶(fatty"acyl-CoA"reductase,"FAR)屬于NAD(P)H依賴型氧化還原酶家族蛋白,能將脂肪酸轉化為脂肪醇[9],在自然界中普遍存在,在絕大多數生物體中具有重要生物學功能[10],如,FAR參與小眼蟲(Euglena"gracilis)的能量儲備[11],參與植物體表角質層蠟等的合成[12-14];在倉鸮(Tyto"alba)、家雞(Gallus"gallus"domesticus)和家鵝(Anser"anser)等鳥類體內參與蠟酯生物合成和其他途徑,如醚脂合成[15];在哺乳動物體內,參與醚脂和蠟酯的生物合成[16-17]。近年來,大量研究表明,FAR在昆蟲多種生命活動中發揮著重要作用,如FAR可通過調節粉蚧所分泌蠟質的主要成分“表皮碳氫化合物”(CHC)的產生來促進其蠟的生物合成,從而有助于粉蚧適應失水和殺蟲劑等的脅迫[18];FAR可以將蜜蜂的脂肪酸轉化為醇,并生物合成產生高水平的中長鏈蠟單酯[19];FAR參與多種昆蟲,如玉米夜蛾性信息素以及白蠟蟲蠟質的生物合成[20-21];褐飛虱體內的FAR基因家族有17個基因組成,其中10個基因分別對褐飛虱的CHC的產生、角質層合成、繁殖有影響[22];B型煙粉虱體內FAR基因家族有21個基因組成,其中BtFAR11與煙粉虱表皮的蠟酯形成有關[23]。FAR在昆蟲生殖,尤其是半翅目昆蟲的繁殖過程中具有重要的作用,可干擾FAR基因的表達顯著抑制半翅目昆蟲雌蟲的繁殖力,主要表現為壽命縮短、產卵量減少或孵化率降低等[24-25]。
蠟質分泌是伴隨桑小頭木虱若蟲和雌成蟲全生命過程的重要生理現象,為了了解蠟質合成相關重要酶FAR及其基因在桑小頭木虱的生命活動中發揮的重要作用,本研究基于轉錄組測序數據,對桑小頭木虱FAR基因家族進行鑒定、序列組成及組織表達分析,探究FAR基因在桑小頭木虱生命活動中的功能,為桑小頭木虱高效防控技術和針對性藥劑的研發和應用提供理論依據。
1.1""材料
桑小頭木虱若蟲和成蟲采自海南省儋州市試驗場七隊(109°29′47.072″E,"19°34′54.142″N)桑園。
1.2""方法
1.2.1""桑小頭木虱FAR基因家族的篩選與鑒定""根據桑小頭木虱轉錄組序列對其FAR基因家族各基因的CDS序列進行克隆,然后從Uniport數據庫(https://www.uniprot.org/)下載FAR蛋白序列,在桑小頭木虱轉錄組蛋白庫中進行本地BLAST搜索[26]。再利用Interpro網站(https://www.ebi.ac.uk/"interpro/)下載FAR的結構域信息[27],利用TBtools軟件篩選出含有FAR結構域的蛋白序列[28],由此獲得桑小頭木虱轉錄組預測的FAR。將篩選的候補基因上傳到NCBI中的CD-search(https://www."ncbi.nlm.nih.gov/"Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)進行結構域預測,并利用TBtools軟件進行可視化分析,將含有2個完整結構域的序列、含有1種結構域但在線BLAST注釋為FAR的序列均保留作為最終的FAR基因。
1.2.2""桑小頭木虱FAR基因家族的蛋白理化性質預測""利用ExPASy在線數據庫(http://web."expasy.org/)對篩選的桑小頭木虱FAR家族成員進行蛋白理化性質預測[29]。并利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?"page=/NPSA/npsa_sopma.html)進行蛋白質二級結構預測分析。利用WoLF"PSORT(https://wolfpsort."hgc.jp/)預測亞細胞定位[30]。
1.2.3""桑小頭木虱FAR基因家族的保守基序預測""利用TBtools軟件進行桑小頭木虱FAR基因家族保守基序分析,保守基序的最大數量設置為17,其他參數默認[31]。
1.2.4""桑小頭木虱FAR基因家族的系統進化樹構建""利用TBtools軟件對桑小頭木虱FAR家族蛋白序列進行系統進化樹構建;從NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載已報道其他昆蟲(中黑盲蝽、褐飛虱、白蠟蚧、綿粉蚧、煙粉虱、夜蛾、螟蛾、巢蛾、家蠶、黑腹果蠅和蜜蜂)的FAR蛋白序列,利用TBtools軟件進行系統進化樹構建[32-33],結合已報道FAR基因功能進行桑小頭木虱FAR基因功能預測分析[33]。
1.2.5""桑小頭木虱FAR基因家族表達分析""通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)對FAR基因家族在桑小頭木虱若蟲、雌成蟲、雄成蟲的表達量進行分析,并選取雌雄成蟲表達量顯著的基因進行頭胸部、腹部的表達量分析。根據候選基因的CDS序列,通過生工生物工程(上海)股份有限公司在線軟件設計引物(表1),利用RNAprep"Pure動物組織總RNA提取試劑盒提取桑小頭木虱RNA,使用FastKing"cDNA第1鏈合成試劑盒進行反轉錄,合成cDNA。以GAPDH為內參,用2×SYBR"Green"qPCR"Premix進行RT-qPCR。
2.1""桑小頭木虱FAR基因家族鑒定及蛋白理化性質預測
根據Uniport數據庫下載的FAR蛋白序列以及Interpro網站下載FAR的結構域信息,在桑小頭木虱轉錄組中進行鑒定,最終獲得23個FAR基因。蛋白理化性質分析表明,23個桑小頭木虱FAR家族蛋白的氨基酸序列長度最短的為63"aa,最長的為575"aa,分子量為7317.43~66"180.04"Da,理論等電點為4.93~9.22,大部分在7.00以上,表明該家族成員大多為堿性蛋白。不穩定系數為27.14~50.43,其中16個FAR成員的不穩定系數小于40,預測為穩定蛋白,不易降解,7個FAR成員的不穩定系數大于40,預測為不穩定蛋白。脂肪系數為84.88~109.84,平均親水系數為-0.502~0.086,大部分小于0,表明該家族蛋白成員大多具有親水性。亞細胞定位預測發現,17個
FAR蛋白定位于細胞質,1個定位于線粒體,1個定位于細胞核,4個定位于質膜(表2)。
對所有FAR家族成員蛋白的二級結構預測表明,其結構由α-螺旋、延伸鏈和無規則卷曲組成,并且以α-螺旋和無規卷曲為主要構件(表3)。
2.2""桑小頭木虱FAR基因家族的保守基序預測
保守基序預測結果表明,桑小頭木虱FAR基因家族成員共包含17個motif,其中motif"2、motif"3、motif"5、motif"8出現次數最多,均為21次,motif"4出現20次,motif"1出現18次,motif"6和motif"13出現17次,motif"7、motif"9和motif"10出現16次,motif"11和motif"12出現15次,motif"15出現5次,motif"16出現4次,motif"14和motif"17出現2次,次數最少。其中motif"7、motif"9屬于FAR"C結構域;除PsmFAR-1、PsmFAR-2、PsmFAR-3以外的基因中,motif"2、motif"3、motif"4、motif"5、motif"8屬于NADB"Rossmann結構域(圖1)。
"
2.3""桑小頭木虱FAR基因家族功能預測分析
通過構建桑小頭木虱與已報道昆蟲(中黑盲蝽、褐飛虱、白蠟蚧、綿粉蚧、煙粉虱、夜蛾、螟蛾、巢蛾、家蠶、黑腹果蠅和蜜蜂)FAR蛋白序列系統進化樹并對其基因功能進行預測分析,結果表明,在所劃分的9個亞族中,23個桑小頭木虱FAR基因家族成員被劃分至6個亞族,分別為亞族Ⅱ(PsmFAR-11和PsmFAR-12)、亞族Ⅳ(PsmFAR-19和PsmFAR-21)、亞族Ⅴ(PsmFAR-1、PsmFAR-2、PsmFAR-8和PsmFAR-13)、亞族Ⅶ(PsmFAR-4、PsmFAR-5、PsmFAR-6、PsmFAR-7和PsmFAR-9)、亞族Ⅷ(PsmFAR-10、PsmFAR-14、PsmFAR-20、PsmFAR-22和PsmFAR-23)、亞族Ⅸ(PsmFAR-3、PsmFAR-15、PsmFAR-16、PsmFAR-17和PsmFAR-18)(圖2)。其中亞族Ⅱ中已報道的AmFAR基因主要與蠟質合成相關;亞族Ⅳ中的NlFAR4基因主要與繁殖和體表角質層合成相關;亞族Ⅴ中已報道的5個基因NlFAR3、CsFAR、EpFAR、NlFAR10和MvFAR在發育、繁殖、蠟質合成、信息素合成中發揮重要作用;亞族Ⅶ中僅包含桑小頭木虱的5個FAR基因,自成一族,根據相鄰2個亞族中的已知基因功能,分析這些基因可能參與繁殖、蠟質合成、體表角質層合成;亞族Ⅷ中的PsFAR1基因主要在蠟質的生物合成中發揮著重要作用,亞族Ⅸ中的5個基因(PsFAR3、DmFAR、NlFAR6、NlFAR7和NlFAR9)主要與發育、繁殖、體表角質層合成和解毒相關。根據預測,桑小頭木虱體內FAR基因家族中,除7個基因可能僅參與蠟質合成功能外,其余16個基因可能參與多個生物學功能,涉及繁殖的有16個(69.56%),涉及蠟質合成的亦有16個(69.56%),與其體表角質層合成相關的有12個(52.17%),與發育相關的有9個(39.13%),與解毒相關的有5個(21.74%),與信息素合成相關的有4個(17.39%)(表4)。
2.4""桑小頭木虱FAR基因在不同蟲態中的表達分析
對桑小頭木虱五齡若蟲、雌成蟲、雄成蟲FAR基因家族的表達特性進行分析表明,若蟲體內有15個FAR基因(PsmFAR-1、PsmFAR-2、PsmFAR-3、PsmFAR-4、PsmFAR-5、PsmFAR-6、PsmFAR-8、PsmFAR-10、PsmFAR-11、PsmFAR-13、PsmFAR-14、PsmFAR-19、PsmFAR-20、PsmFAR-21、PsmFAR-22)的表達量均顯著高于雌成蟲、雄成蟲(圖3),其中有13個基因(PsmFAR-1、PsmFAR-2、PsmFAR-4、PsmFAR-5、PsmFAR-6、PsmFAR-8、PsmFAR-10、PsmFAR-11、PsmFAR-13、PsmFAR-14、PsmFAR-19、PsmFAR-20、PsmFAR-22)在系統進化樹中指征可能與蠟質合成相關;1個基因(PsmFAR-3)指征可能與發育、繁殖、體表角質層合成、解毒相關;1個基因(PsmFAR-21)指征可能與繁殖、體表角質層合成相關(表4)。
雌成蟲體內有3個基因(PsmFAR-9、PsmFAR-16和PsmFAR-17)的表達量顯著高于雄成蟲和若蟲,其中PsmFAR-16、PsmFAR-17在若蟲、雄成蟲中的表達量無顯著差異(圖3),這3個基因均可能涉及繁殖和體表角質層合成功能,同時PsmFAR-9還可能在蠟質合成中發揮作用,PsmFAR-16和PsmFAR-17亦可能參與發育和解毒功能(表4)。
雄成蟲體內有2個基因(PsmFAR-12和PsmFAR-18)的表達量均高于雌成蟲和若蟲,其中PsmFAR-12的表達量顯著高于雌成蟲和若蟲(圖3),在系統發育樹中,該基因可能主要參與蠟質合成,PsmFAR-18與雌成蟲的表達量無顯著差異,但顯著高于若蟲,在系統發育樹中,該基因可能主要表征發育、繁殖、體表角質層合成、解毒(表4)。
雌成蟲和雄成蟲體內有2個基因(PsmFAR-7和PsmFAR-23)的表達量顯著高于若蟲,且在雌成蟲和雄成蟲間無顯著差異(圖3),PsmFAR-23基因在系統發育樹中歸屬亞族Ⅷ,可能與蠟質合成相關,PsmFAR-7則可能涉及繁殖、蠟質合成及體表角質層合成(表4)。
PsmFAR-15在若蟲和成蟲體內的表達無顯著差異,全生育期穩定表達(圖3),在系統發育樹中,該基因可能主要涉及發育、繁殖、體表角質層合成及解毒等功能(表4)。
2.5""桑小頭木虱FAR基因在不同部位中的表達分析
由2.4的桑小頭木虱不同蟲態體內FAR基因的表達分析中發現,9個FAR基因(PsmFAR-3、PsmFAR-4、PsmFAR-14、PsmFAR-16、PsmFAR-17、PsmFAR-19、PsmFAR-20、PsmFAR-21和PsmFAR-22)在雌成蟲和雄成蟲體內的表達量差異較大,相差2倍以上,7個FAR基因(PsmFAR-7、PsmFAR-9、PsmFAR-12、PsmFAR-16、PsmFAR-17、PsmFAR-18和PsmFAR-23)在成蟲體內的表達量顯著高于若蟲,因此對這14個基因在成蟲體內不同部位的表達差異作進一步分析。結果表明,在分析的14個FAR基因中,在雌成蟲、雄成蟲頭胸部僅2個基因(PsmFAR-3和PsmFAR-23)的表達量顯著高于腹部;在雄成蟲頭胸部有2個基因(PsmFAR-4和PsmFAR-21)的表達量高于腹部,而這2個基因在雌成蟲中則腹部顯著高于頭胸部(圖4)。
在雌成蟲、雄成蟲腹部有3個基因(PsmFAR-14、PsmFAR-19、PsmFAR-20)的表達量顯著高于頭胸部;在雌成蟲腹部有5個基因(PsmFAR-4、PsmFAR-16、PsmFAR-17、PsmFAR-21、PsmFAR-22)的表達量顯著高于頭胸部,在雄成蟲腹部有4個基因(PsmFAR-7、PsmFAR-9、PsmFAR-12、PsmFAR-18)的表達量顯著高于頭胸部(圖4)。
FAR基因家族編碼CHC合成酶,CHC和重要的脂肪酸合成途徑共享基因,影響昆蟲的發育、繁殖、蠟質合成、體表角質層合成、信息素合成及解毒等功能[22-24,"34]。基因家族成員的差異使物種產生不同的差異和生態適應性[35]。本研究基于桑小頭木虱的轉錄組數據,結合已知的多種昆蟲FAR基因家族中各基因的功能,對桑小頭木虱FAR基因家族進行鑒定,并對不同基因的功能進行分析預測,結果在桑小頭木虱體內共獲得23個FAR候選基因,與褐飛虱的數量相似[24]。蛋白特
性分析表明,其大多為堿性蛋白,這與煙粉虱[23]、白蠟蟲[26]的理化性質較為相似。亞細胞定位預測顯示桑小頭木虱的FAR基因大多定位在細胞質,與白蠟蟲FAR基因家族的預測結果[36]相同,說明PsmFAR基因發揮功能的主要場所是細胞質。
結合其他已知昆蟲的FAR基因功能,以及桑小頭木虱若蟲、雌成蟲、雄成蟲體內23個FAR基因的表達分析發現,桑小頭木虱的23個FAR基因可能參與發育、繁殖、蠟質合成、體表角質層合成、信息素合成及解毒等多個生物學功能,其中16個基因(69.56%)可能涉及繁殖和蠟質合成功能,說明FAR基因家族可能在桑小頭木虱的繁殖及重要生理活動中發揮著重要作用,研究也初步證實干擾桑小頭木虱PsmFAR-22基因后,蠟質合成及繁殖受到顯著影響(待發表),后續功能的進一步驗證將為以FAR基因為靶標的精準防控藥劑的研發提供依據。
若蟲體內有15個FAR基因的表達量顯著高于雌成蟲和雄成蟲,其中有13個基因在系統進化樹中指征可能與蠟質合成相關,而桑小頭木虱若蟲期全程分泌蠟質,作為一項重要生理功能,蠟質分泌可能作為桑小頭木虱針對性防控藥劑研發的重要靶標。白蠟蟲的FAR基因家族有22個基因,其中有5個基因與泌蠟功能相關[37]。PsmFAR-15在若蟲和成蟲體內的表達無顯著差異,全生育期穩定表達,且表達量較高,在系統發育樹中,PsmFAR-15與PsFAR3、DmFAR、NlFAR6、NlFAR7、NlFAR9分為同一亞族,可能有相似的功能,如PsFAR3影響昆蟲發育和對農藥的解毒[38],DmFAR影響胚胎發育[39],NlFAR6影響繁殖,NlFAR7影響CHC生物合成以及角質層合成,NlFAR9影響角質層合成以及繁殖[22],因此推測PsmFAR-15可能與桑小頭木虱的發育、繁殖、角質層合成、CHC生物合成及對農藥的解毒等相關。PsmFAR-12和PsmFAR-18在雄成蟲體內的表達量均高于雌成蟲和若蟲,其中PsmFAR-12的表達量顯著高于雌成蟲和若蟲,在系統發育樹中,該基因與AmFAR的同源關系較近[19],而AmFAR影響蠟質合成,推測PsmFAR-12可能主要參與蠟質合成;雄成蟲體內PsmFAR-18的表達量與雌成蟲無顯著差異,但顯著高于若蟲,推測該基因可能與雄成蟲特有的蜜露合成相關。PsmFAR-12是否參與雄成蟲特有的蜜露合成及其他生理功能還有待驗證,目前已研究昆蟲FAR基因的功能尚不完全,需進一步通過基因敲除研究去證實。
頭胸部、腹部FAR基因的表達分析發現,在分析的14個FAR基因中,在雌雄成蟲頭胸部僅PsmFAR-3和PsmFAR-23的表達量顯著高于腹部,這與檢測的白蠟蟲[40]FAR基因表達量結果較為相似。桑小頭木虱腹部含有精巢、卵巢結構,對這些差異顯著的FAR基因進行研究,分析這些基因在桑小頭木虱繁殖過程中的功能,為針對降低其繁殖力方面進行防控技術的研發奠定基礎。PsmFAR-4和PsmFAR-21基因存在雌雄成蟲不同部位表達不一致的現象,在雌成蟲腹部的表達量顯著高于頭胸部,而在雄成蟲頭胸部卻高于腹部,說明這2個基因可能在雌蟲體內具有調節繁殖等功能,而在雄成蟲體內則可能存在協調信息素的合成及釋放功能,后續將進一步驗證該功能,為FAR基因在桑小頭木虱繁殖、信息素合成與釋放功能的深入研究和阻斷方式的研究提供依據。
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