美洲腦轉(zhuǎn)錄組多態(tài)性EST-SNP標(biāo)記的開發(fā)與利用

美洲（Alosasapidissima）隸屬于鯡形目（Clupeiformes）、鯡科（Clupeidae）、亞科（Alosi-nae）西鯡屬（Alosa），與我國長江（Tenualosareevesii)屬于同一亞科，原分布于北美洲大西洋沿岸水域，是美國漁業(yè)資源保護(hù)的重要野生品種，因具有肉鮮味美、營養(yǎng)豐富、養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等諸多優(yōu)點(diǎn)而被世界各地廣泛引種[1-3]。我國長江素有“魚中西施”之說，曾被列為“、甲、鯧、黃”四大名魚之首，與長江水域的刀魚、河鲀并稱為“長江三鮮”。但是在20世紀(jì)末期，由于過度捕撈、水域污染、水利工程等諸多因素，長江自然種質(zhì)資源急劇衰退，近年來長江流域已鮮見其蹤跡[]。有鑒于此，上海市水產(chǎn)研究所（上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站)自1998 年開始從美國密西西比河水域引進(jìn)美洲受精卵進(jìn)行人工繁養(yǎng)殖研究，并在后期陸續(xù)攻克了其苗種培育、養(yǎng)殖和繁育技術(shù)難關(guān)，以期將其作為長江的理想替代品種以滿足消費(fèi)市場的需求[1，3]。伴隨著美洲人工繁育和養(yǎng)殖技術(shù)的逐漸成熟，其養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量日益擴(kuò)大，但是良種的匱乏嚴(yán)重制約了養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康、可持續(xù)的發(fā)展。開展美洲良種選育需要科學(xué)有效的育種策略，否則極易造成生長和抗逆性等生產(chǎn)性狀的退化，因此，亟須加強(qiáng)美洲種質(zhì)資源的開發(fā)研究，并適時(shí)對養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進(jìn)行檢測，以有效降低種質(zhì)退化和近交衰退發(fā)生的概率[3]

近年來，對美洲的研究主要集中于形態(tài)特征[4]、胚胎發(fā)育[5]、生長特性[1-2]、病害防治[6-8]性腺發(fā)育[9]、環(huán)境脅迫[10-12]、同工酶鑒定[13]等方面，而對于群體遺傳分析和分子標(biāo)記開發(fā)方面的研究相對較少，僅見于國外學(xué)者利用微衛(wèi)星標(biāo)記和線粒體研究不同水域或緯度群體的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化[14-15]，以及國內(nèi)學(xué)者利用微衛(wèi)星標(biāo)記和線粒體研究蘇南地區(qū)美洲不同養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性[16]。美洲養(yǎng)殖群體可用分子標(biāo)記匱乏的現(xiàn)狀在一定程度上制約了其種質(zhì)資源的充分開發(fā)和利用，而基于分子標(biāo)記技術(shù)有效評估養(yǎng)殖美洲的遺傳多樣性能夠?yàn)槠浞N質(zhì)資源的開發(fā)、保護(hù)、利用和遺傳改良提供理論指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)。

伴隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragmentlengthpolymorphism，AFLP）、間簡單重復(fù)序列(inter simple sequence repeat，ISSR）、簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）及單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）等分子標(biāo)記先后在水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)資源評估中綻放異彩。SNP是指在基因組上由單個(gè)核苷酸變異形成的遺傳標(biāo)記，是動(dòng)植物基因組中數(shù)量最為豐富的分子標(biāo)記資源，具有數(shù)量多、密度高、遺傳穩(wěn)定性好、突變率低及易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測分析等優(yōu)點(diǎn)。該標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物群體遺傳學(xué)分析、品種鑒定、重要性狀的基因定位、遺傳圖譜構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助育種等相關(guān)研究，也是復(fù)雜遺傳性狀解析和基因組進(jìn)化研究的重要工具。傳統(tǒng)的SNP標(biāo)記的開發(fā)方法是對DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行直接測序，適用于少量SNP位點(diǎn)的開發(fā)和驗(yàn)證，成本相對較高，不適合規(guī)模化的開發(fā)和應(yīng)用。伴隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展和測序成本的降低，利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序的方法，可以規(guī)模化挖掘動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST)的SNP標(biāo)記（EST-SNP標(biāo)記），并結(jié)合等位基因頻率的評估結(jié)果，獲得與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)性較高的位點(diǎn)用于輔助分子標(biāo)記輔助育種研究。該標(biāo)記相對于EST-SSR標(biāo)記更加穩(wěn)定，能夠直接用于水產(chǎn)動(dòng)物的分子育種實(shí)踐。

魚類大腦作為神經(jīng)系統(tǒng)的高級調(diào)控中樞，不僅能夠通過腦-垂體-肝臟生長軸（GH/IGF)對生長性狀進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，而且能夠通過腦-垂體-性腺軸(BPG)對性別分化、生殖發(fā)育等進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控。研究魚類不同性別或極端生長表型個(gè)體間腦轉(zhuǎn)錄組的差異，對于魚類的生長和發(fā)育等相關(guān)性狀的遺傳解析及新品種（系）的選育具有重要作用，特別是多態(tài)性EST-SNP分子標(biāo)記的挖掘能夠?yàn)轸~類分子標(biāo)記輔助良種培育提供較好的技術(shù)支撐。

目前，關(guān)于美洲腦轉(zhuǎn)錄組EST-SNP標(biāo)記的挖掘、特征分析及多態(tài)性驗(yàn)證等方面的研究相對較少。基于美洲腦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)規(guī)模化開發(fā)多態(tài)性EST-SNP標(biāo)記位點(diǎn)，對于美洲功能性分子標(biāo)記的開發(fā)、遺傳圖譜的構(gòu)建、優(yōu)良種質(zhì)的鑒定及遺傳改良具有較好的應(yīng)用前景。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)手段挖掘美洲腦轉(zhuǎn)錄組中的EST-SNP標(biāo)記，開展初步的特征分析，并對篩選的部分EST-SNP位點(diǎn)開展了有效性和多態(tài)性驗(yàn)證，以期為養(yǎng)殖美洲的種質(zhì)資源評估和分子標(biāo)記輔助良種選育研究提供重要的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1. 1 試驗(yàn)魚

用于腦轉(zhuǎn)錄組測序的6尾美洲取自上海市水產(chǎn)研究所(上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站)奉賢科研基地于2017年貯備的2齡性成熟美洲（性比為 ；用于EST-SNP標(biāo)記有效性和多態(tài)性驗(yàn)證的30尾美洲取自該基地于2017年繁育獲得的美洲亞成魚( 1⁺ 齡）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 美洲鯽腦組織轉(zhuǎn)錄組測序

將6尾2齡性成熟美洲用MS-222麻醉后，迅速解剖，取其腦組織置于液氮速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80^°C 冰箱保存?zhèn)溆谩NA 提取參照Invitrogen公司的TrizolReagents試劑盒說明書進(jìn)行;cDNA測序文庫構(gòu)建參照Illumina轉(zhuǎn)錄組測序文庫試劑盒說明書進(jìn)行;利用Illumina HisSeqXTen高通量測序平臺對3個(gè)雌魚樣品（BF1、BF2和BF3）和3個(gè)雄魚樣品(BM1、BM2和BM3)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序；利用Trinity2.4.0軟件對測序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝、優(yōu)化和分析。

1.2.2 美洲腦轉(zhuǎn)錄組EST-SNP標(biāo)記的挖掘和特征分析

利用HISAT22.1.0軟件中的全局比對方式，將不同長度的cleanreads（經(jīng)處理后得到的高質(zhì)量、干凈的讀取序列)與美洲參考基因組（NCBIbioprojectID：PRJNA736150)進(jìn)行比對，獲得比對文件后，再使用SAMtools1.5軟件將比對文件進(jìn)行排序；然后將雌、雄美洲（BF組和BM組）的所有樣本進(jìn)行排序后的比對文件和相應(yīng)的參考基因組序列輸入到BCFtools1.5軟件中，利用該軟件中的mpileup命令將2組美洲比對后的bam文件轉(zhuǎn)換成vcf文件，并利用BCFtoolsfilter對轉(zhuǎn)換好的vcf文件進(jìn)行過濾。過濾條件：(1)篩選出至少被6個(gè)clean reads覆蓋的 EST-SNP 標(biāo)記;(2)覆蓋度大于8；（3）最小等位基因質(zhì)量 ?20 。最后，利用EXCEL軟件對篩選到的美洲腦轉(zhuǎn)錄組中的EST-SNP標(biāo)記進(jìn)行相關(guān)特征分析。

1.2.3 美洲腦轉(zhuǎn)錄組EST-SNP標(biāo)記的有效性驗(yàn)證

隨機(jī)選取70個(gè)在美洲雌、雄個(gè)體中均存在的EST-SNP分子標(biāo)記位點(diǎn)，對30尾養(yǎng)殖美洲進(jìn)行基因分型，以開展EST-SNP標(biāo)記的有效性和多態(tài)性驗(yàn)證研究。

30尾美洲個(gè)體的DNA提取：每個(gè)美洲樣本取約 25mg 的尾鰭，利用滅菌 ddH₂0 清洗干凈后，剪碎并保存于 1.5mL 離心管中，參照天根生化科技（北京）有限公司的海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（DP324-03）說明書提取美洲不同樣本的基因組DNA。分別利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoVuePlus紫外可見分光光度計(jì)對提取好的DNA樣本的質(zhì)量和濃度進(jìn)行評估。經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示無拖尾降解現(xiàn)象、條帶清晰，且在 260nm 和 280nm 下的吸光度比值 (A₂₆₀/A₂₈₀ 為 1.8～2.0 的DNA 樣品，將其稀釋到 50ng/μL 后，置于 -20^°C 冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

基因分型：委托上海捷瑞生物工程有限公司用SNaPshot基因分型技術(shù)對30尾美洲個(gè)體開展基因分型服務(wù)和分析，參照美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（AppliedBiosystemsInc.，ABI）所提供的SNaPshot試劑盒說明書進(jìn)行操作，然后利用ABI3730xl DNA分析儀進(jìn)行基因分型。

1.2.4 美洲腦轉(zhuǎn)錄組多態(tài)性EST-SNP標(biāo)記的利用

經(jīng)驗(yàn)證多態(tài)性較好的EST-SNP標(biāo)記用于評估1個(gè)美洲養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性。采用GenAlex6.5軟件[17]計(jì)算最小等位基因頻率（mi-norallelefrequency，MAF）觀測雜合度（observedheterozygosity， H_o ）和期望雜合度（expectedheterozygosity， H_e )等遺傳參數(shù)。基于等位基因頻率，利用PopGene321.31軟件，計(jì)算各個(gè)EST-SNP標(biāo)記的多態(tài)信息含量（polymorphismin-formationcontent，PIC）。利用GENEPOP4.0軟件進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡檢測和分析。

2 結(jié)果

2.1 美洲腦轉(zhuǎn)錄組EST-SNP標(biāo)記特征分析

基于IlluminaHisSeqXTen高通量測序平臺和Trinity軟件，從美洲腦轉(zhuǎn)錄組中共獲得總長度為157104493bp的拼接基因257648個(gè)，利用BCFtools軟件總共鑒定到113898個(gè)潛在的EST-SNP位點(diǎn)，平均 1.379kb 就能檢測到1個(gè)EST-SNP位點(diǎn)；其中有50454個(gè)拼接基因檢測到至少有1個(gè)SNP位點(diǎn)，平均每個(gè)拼接基因能夠鑒定到2.26個(gè)EST-SNP位點(diǎn)。

單個(gè)堿基的變異類型主要包括單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失，而一般所說的SNP標(biāo)記往往是指轉(zhuǎn)換和顛換2種類型。在本研究中，對113898個(gè)EST-SNP位點(diǎn)開展堿基置換類型統(tǒng)計(jì)和分析，結(jié)果顯示，美洲雌、雄個(gè)體腦轉(zhuǎn)錄組中的堿基置換類型具有明顯一致的偏好性，不同美洲個(gè)體轉(zhuǎn)換類型EST-SNP位點(diǎn)的數(shù)量均顯著大于顛換類型的數(shù)量（見圖1）。對不同EST-SNP位點(diǎn)突變類型的分布情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CT，AG，TC 和 GA 是最主要的變異類型，約占 65% ，其中 突變類型占比相對較高，約為 17% ，其他幾種EST-SNP位點(diǎn)變異類型相對較少，累計(jì)占比 35% （見圖2）。

2.2 美洲EST-SNP標(biāo)記的有效性檢測

為驗(yàn)證美洲轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中113898個(gè)潛在的EST-SNP標(biāo)記的有效性，隨機(jī)挑選出在雌、雄美洲個(gè)體中均存在的70個(gè)EST-SNP標(biāo)記，利用SNaPshot基因分型技術(shù)對30尾 1⁺ 齡美洲個(gè)體進(jìn)行初步的基因分型，結(jié)果顯示，57個(gè)EST-SNP標(biāo)記能夠穩(wěn)定擴(kuò)增且具有多態(tài)性，能夠成功分型，占比為 81.43% ；其余13個(gè)EST-SNP標(biāo)記未能成功分型

2.3 美洲養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析

基于57個(gè)多態(tài)性較好的EST-SNP標(biāo)記開展美洲養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，最小等位基因頻率（MAF）為 0.067～0.483 ，觀測雜合度( H_o ）和期望雜合度（ ）分別為 0. 033～ 0.567和 57個(gè)EST-SNP標(biāo)記的多態(tài)信息含量（PIC）為 0.117～0.375 ，其中38個(gè)位點(diǎn)為中度多態(tài)性（PIC大于0.25，小于0.50），19個(gè)位點(diǎn)為低度多態(tài)性（PIC小于0.25）。哈迪-溫伯格平衡檢測的結(jié)果顯示，在美洲57個(gè)多態(tài)性EST-SNP位點(diǎn)中，有2個(gè)EST-SNP位點(diǎn)顯著偏離哈迪-溫伯格平衡( P<0.01 （見表1）。

3 討論

伴隨著高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，測序準(zhǔn)確率、效率和測序深度均不斷得到完善。利用生物信息學(xué)技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中規(guī)模化挖掘候選EST-SNP標(biāo)記，并開展相關(guān)功能驗(yàn)證，日趨成為一種高效的EST-SNP標(biāo)記開發(fā)模式，特別是對于無參考基因組物種具有較好的參考價(jià)值。基于高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)目前已在大口黑鱸（Micropterussalmoides ）[18-19]、草魚（Ctenopharyngodon idel-la）[20]、日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）[21]紫貽貝（Mytilusgalloprovincialis）[22]及棘胸蛙（Quasipaaspinosa）[23]等水產(chǎn)動(dòng)物重要經(jīng)濟(jì)品種的EST-SNP開發(fā)應(yīng)用方面獲得了成功，這為美洲多態(tài)性EST-SNP分子標(biāo)記的規(guī)模化開發(fā)和利用提供了良好的借鑒。

本研究從美洲腦轉(zhuǎn)錄組中總共獲得了257 648個(gè)拼接基因和113898個(gè)EST-SNP位點(diǎn)，其中有50454個(gè)拼接基因至少存在1個(gè)EST-SNP位點(diǎn)，約占總拼接基因的 19.58% ，平均每個(gè)拼接基因能夠檢測到2.26個(gè)EST-SNP位點(diǎn)，EST-SNP位點(diǎn)檢出率相對較高，可能與研究材料間的遺傳背景差異有關(guān)。有研究表明，EST-SNP位點(diǎn)的檢出頻率越高，表明所用研究材料的遺傳背景差異越大。SNP變異理論上每個(gè)位點(diǎn)能夠存在4種形式的變異，但是實(shí)際上發(fā)生的只有轉(zhuǎn)換和顛換2種，且二者的比例約為 2:1^[24] 。本研究還發(fā)現(xiàn)，EST-SNP位點(diǎn)的堿基變異類型中， 和 T?C 是主要的變異類型。這4類堿基變異類型均屬于轉(zhuǎn)換突變，約占總EST-SNP位點(diǎn)的 65% ，其他堿基變異類型屬于顛換突變，數(shù)量相對較少，約占總EST-SNP位點(diǎn)的 35% ，平均轉(zhuǎn)換和顛換的比例為 1.86:1 ，略低于理論值(2：1），略高于紫貽貝的相關(guān)比例(1.6：1)[22]

基于生物信息學(xué)技術(shù)手段所開發(fā)的EST-SNP位點(diǎn)往往存在一定比例的假陽性，而且功能基因轉(zhuǎn)錄后， mRNA 存在剪切編輯，需要通過試驗(yàn)方法在基因組DNA水平開展有效性和多態(tài)性的進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究從美洲雌雄個(gè)體腦轉(zhuǎn)錄組中所鑒定到的113898個(gè)潛在EST-SNP位點(diǎn)中，隨機(jī)選取70個(gè)EST-SNP位點(diǎn)開展了有效性和多態(tài)性驗(yàn)證，結(jié)果顯示，81. 43% 的EST-SNP位點(diǎn)較為穩(wěn)定且具有多態(tài)性，還有 18.57% 的EST-SNP位點(diǎn)未分型成功。究其原因，可能是這些序列復(fù)雜性較高或者側(cè)翼序列還存在其他變異位點(diǎn)，導(dǎo)致本研究采用SNaPshot基因分型技術(shù)未能成功分型，后續(xù)需要利用其他基因分型技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

雜合度( H_o/H_e 和多態(tài)信息含量（PIC）等遺傳參數(shù)是評估水產(chǎn)動(dòng)物群體遺傳變異程度的重要參考指標(biāo)，對于美洲養(yǎng)殖群體的種質(zhì)資源評估具有重要參考價(jià)值。本研究利用57個(gè)多態(tài)性EST-SNP分子標(biāo)記評估美洲養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，該群體的平均觀測雜合度( ???? ）、期望雜合度 (H_e ）和多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.3497.0.3410 和0.2756，表明該美洲養(yǎng)殖群體的遺傳變異程度相對較好。基于Botstein 等[25]提出的多態(tài)性劃分標(biāo)準(zhǔn)，即PIC小于0.25屬于低度多態(tài)，PIC大于0.25、小于0.50屬于中度多態(tài)。本研究中有 66.67% 的EST-SNP位點(diǎn)屬于中度多態(tài)， 33.33% 的EST-SNP位點(diǎn)屬于低度多態(tài)，PIC平均值為0.2756，低于課題組前期基于微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)分析該群體所得到的PIC平均值（0.561）[3]。原因主要是這些EST-SNP分子標(biāo)記均屬于二等位基因多態(tài)，相對低于微衛(wèi)星標(biāo)記的多等位基因多態(tài)。哈迪-溫伯格平衡定律亦稱遺傳學(xué)平衡定律，是群體有性繁殖上下代之間基因頻率和基因型頻率是否能夠保持平衡的檢驗(yàn)尺度[26]，也是水產(chǎn)動(dòng)物開展保種和新品種(系)選育的重要理論依據(jù)。本研究對57個(gè)多態(tài)性EST-SNP位點(diǎn)開展哈迪-溫伯格平衡檢測，結(jié)果顯示，55個(gè)EST-SNP位點(diǎn)符合哈迪-溫伯格平衡（ ），2個(gè)EST-SNP位點(diǎn)顯著偏離哈迪-溫伯格平衡( P<0.05) ，表明這2個(gè)EST-SNP位點(diǎn)可能已經(jīng)受到人工選擇壓力的影響，而大部分位點(diǎn)能夠用于美洲養(yǎng)殖群體的遺傳分析。本研究結(jié)果可為后續(xù)美洲的種質(zhì)資源評估、基因分型和性狀關(guān)聯(lián)分析等研究奠定理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]施永海，徐嘉波，陸根海，等.養(yǎng)殖美洲的生長特性[J].動(dòng)物學(xué)雜志，2017，52(4）:638-645.

[2]徐嘉波，稅春，施永海，等.池養(yǎng)美洲 1⁺ 齡魚種生長特性的研究[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，27（1）：55-63.

[3]于愛清，施永海，徐嘉波，等.美洲腦轉(zhuǎn)錄組多態(tài)性EST-SSR的規(guī)模化開發(fā)與利用[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2023，51(11):1-12.

[4]洪孝友，朱新平，陳昆慈，等.孟加拉、美洲和中國形態(tài)學(xué)比較分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，34（2）：203-206.

[5]徐鋼春，張呈祥，鄭金良，等.美洲的人工繁殖及胚胎發(fā)育的研究[J].海洋科學(xué)，2012，36（7)：89-96.

[6]王會(huì)林，晉懷遠(yuǎn)，高曄，等.美洲魚嗜水氣單胞菌病原的分離與鑒定[J].漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2024，45(2)：257-266.

[7]高曉華，高瑋，張明輝.40種中草藥對美洲源溫和氣單胞菌的體外抑菌作用研究[J].飼料工業(yè)，2023，44（12)：67-73.

[8]施永海，鄧平平，徐嘉波.美洲專題系列講座美洲病害防治[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2022（11)：13-14.

[9]袁新程，施永海，徐嘉波，等.美洲V、V期卵巢營養(yǎng)成分、卵黃蛋白原、組織蛋白酶D及其mRNA表達(dá)的比較分析[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2024，33（3）：623-634.

[10]郭印，戴習(xí)林.急性鹽度脅迫對美洲幼魚滲透調(diào)節(jié)的影響[J].水產(chǎn)科學(xué)，2022，41(4):676-681.

[11]袁新程，蔣飛，施永海，等.高溫脅迫對美洲 1⁺ 齡魚種抗氧化與非特異性免疫相關(guān)指標(biāo)的影響[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2021，47(1)：107-117.

[12]張勇，徐鋼春，杜富寬，等.急性操作脅迫對美洲親魚血清生化指標(biāo)及HSP70基因表達(dá)的影響［J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，25(5):652-658.

[13]張濤，周劍光，陳建武，等.美洲形態(tài)特征及其兩種同工酶的組織特異性分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，49（4)：773-779.

[14]JULIANSE，BARTRONML.Microsatellite DNA markersforAmerican shad(Alosa sapidissima） and cross-species amplifica-tion within the family Clupeidae[J].Molecular Ecology Notes，2007，7(5) :805-807.

[15]HASSELMANDJ，BENTZENP，NARUMSR，etal.Formationofpopulation genetic structure following the introduction and es-tablishment of non-native American shad(Alosa sapidissima）alongthe Pacific Coast of North America[J].Biological Inva-sions，2018，20(11):3123-3143.

[16]李玉林，羅明坤，馮冰冰，等.我國蘇南地區(qū)美洲7個(gè)養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2024，33(2):285-296.

[17]PEAKALL R，SMOUSE P E.Genalex 6:genetic analysisinExcel.Population genetic software for teaching and research[J].Molecular EcologyNotes，2006，6(1） :288-295.

[18]李勝杰，白俊杰，趙犖，等.大口黑鱸EST-SNP標(biāo)記開發(fā)及其與生長性狀的相關(guān)性分析［J].海洋漁業(yè)，2018，40（1）：38-46.

[19]馬冬梅，全迎春，樊佳佳，等.基于轉(zhuǎn)錄組測序的大口黑鱸馴食相關(guān)SNP開發(fā)及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2018，42(11):1684-1692.

[20]孫雪，李勝杰，姜鵬，等.利用RNA-Seq技術(shù)分析草魚生長性狀相關(guān)基因和SNP標(biāo)記[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2021，45（3）：333-344.

[21]李喜蓮，楊元杰，李飛，等.日本沼蝦EST-SNP的篩選及多態(tài)性檢測[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，47（2):67-73.

[22]李宏俊，梁瑜，邢坤，等.紫貽貝EST-SNP的篩選及多態(tài)性檢測[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2011，35(3）：348-355.

[23]魏朝宇，謝永廣，魏秀英，等.基于轉(zhuǎn)錄組測序的棘胸蛙SSR和SNP分子標(biāo)記開發(fā)[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2022，53（3)：759-767.

[24]丁佩劍，金秀菊，孫寶信.人類單核苷酸多態(tài)性研究進(jìn)展[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，15（12）：1235-1237.

[25]BOTSTEIND，WHITE RL，SKOLNICKM，etal.Construction ofa genetic linkage map in man using restriction fragment lengthpolymorphisms[J].American Journal of Human Genetics，1980，32(3):314-331.

[26]管宇，張香云，徐群芳，等.哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)及其基因頻率的估計(jì)[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，26(1)：122-126.

Development and application of polymorphic EST-SNP markers from the brain transcriptome of Alosa sapidissima

YUAiqing，SHI Yonghai，XU Jiabo，LIU Yongshi，YAN Yinlong (Shanghai Fisheries Research Institute，Shanghai Fisheries Technical Extension Station，Shanghai ，China)

Abstract:A total of 113 898 single nucleotide polymorphism（EST-SNP）markers based on expression sequence tags were successfully identified from thebrain transcriptome data of Alosa sapidissima by bioinformatics toos，and 57 polymorphic EST-SNP markers were developed for genetic diversity assessment in A . sapidissima. The minor allele frequency（MAF），the observed heterozygosity（ H_o ），expected heterozygosity（ H_e ）and polymorphism information content （PIC） were 0.067-0.483，0.033-0.567，0.124-0.499 and 0.117-0.375，respectively. Two loci of the 57 EST-SNP significantly deviated from the Hardy-Weinberg equilibrium ( P<0， 05 )． The results demonstrated thatthese polymorphic EST-SNP markers were potent tools for evaluating genetic diversity and germplasm analysis of A . sapidissima，which could be capitalized in future conservation strategies and breeding programs to protect and improve thisvaluable fish.

Key words: Alosa sapidissima; transcriptome； single nucleotide polymorphism； genetic diversity