一例雞源mcr-1陽性大腸桿菌感染病例分析及耐藥特征研究

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：A文章編號：1673-1085（2025）05-0062-06

大腸桿菌是導致雞感染性疾病最常見的細菌之一，可引起雞的敗血癥、氣囊炎、心包炎、腹膜炎及輸卵管炎等多種病癥，既可單獨發病，也能與其他病原體混合感染。該菌在雞群中即可垂直傳播，也可水平傳播，并能在雞體內長時間持留[1-2]。雞大腸桿菌病全年均可發生，且雛雞最為易感，具有較高的發病率和死亡率，給雞養殖業造成不少的經濟損失[3]。目前，抗生素仍是預防和治療雞大腸桿菌病的重要手段，但長期且不合理的使用促進了大腸桿菌的耐藥性進化。在畜禽養殖領域，多黏菌素曾被廣泛用于促進動物生長及預防細菌感染。然而，隨著多黏菌素的大量使用，問題逐漸浮現。細菌進化出了可水平轉移的多黏菌素耐藥機制mcr-1，這一機制的產生與多黏菌素的濫用緊密相連[4]。鑒于此，2016年我國農業部發布第2428號公告，明確決定停止將硫酸黏菌素作為飼料添加劑用于動物促生長，力求通過政策手段遏制耐藥問題的惡化。

1材料與方法

1.1病例信息

本研究所用病例來自于濟南市某養雞場，35周齡海蘭褐蛋雞，部分雞只出現腹瀉、蛋殼粗糙以及輕微呼吸道癥狀，雞群中還伴有零星死亡現象，疑似大腸桿菌感染。剖檢死亡雞只，采集心臟、肝臟作為檢測病料。

1.2 試劑

無菌脫纖羊血培養基，購自廣東環凱微生物科技有限公司；尿道菌顯色培養基，購自法國科瑪嘉公司；MHB肉湯、LB肉湯，均購自北京陸橋技術股份有限公司；抗菌藥物，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；細菌基因組提取試劑盒，購自廣州美基生物科技有限公司。

1.3主要設備

生物安全柜（HR50-ⅡA2），購自海爾生物醫療股份有限公司；麥氏比濁儀（VITEKDENSICHEK），購自法國梅里埃公司；恒溫培養箱（BB150），購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀，購自德國Bruker公司。

1.4 細菌分離培養及純化

剖檢病死雞，采集心臟、肝臟，在生物安全柜中用 75% 酒精對組織表面消毒，使用無菌剪刀將組織剪開，使用一次性無菌采樣拭子蘸取樣品，并涂抹在血瓊脂培養基一側，隨后用一次性無菌接種環從樣品涂抹處開始分區劃線。將平血倒置，放入 恒溫培養箱，過夜培養。挑取優勢菌的單菌落，劃線于尿道顯色培養基上， 培養16～18h 。

1.5細菌種屬鑒定

選取尿道顯色培養基上的紅色單菌落均勻涂抹在靶板上，依次加入 1μL 甲酸和基質液，晾干后放入基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀中鑒定。

1.6 藥物敏感性試驗

采用CLSI推薦的微量肉湯稀釋法測試大腸桿菌分離株對14種抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC），質控菌株為大腸桿菌ATCC25922。具體步驟為：將對數生長期的菌液定量至麥氏比濁0.5，MHB肉湯稀釋100倍；在96孔板的第1＼～11列倍比稀釋抗菌藥物，第12列不加藥物，作為對照，體積 100μL ；每孔加入 100μL 稀釋菌液，震蕩混勻后放入 恒溫培養箱靜置培養； ^18h 后讀取藥敏值，即從低濃度孔開始，第一個無肉眼可見菌體沉淀的藥物濃度即為MIC值，敏感性結果根據CLSI和EUCAST的標準判定。

1.7細菌基因組提取及測序

挑取大腸桿菌單克隆于1mLLB肉湯中， ，200rpm 震蕩培養 16～18h 后，按細菌基因組提取試劑盒說明書操作。將提取成功的基因組送至安諾優達公司二代測序。

2 結果與分析

2.1臨床癥狀

患病雞精神萎靡不振，羽毛蓬亂，食欲減退，排黃白色或黃綠色稀糞，逐漸消瘦，輕微呼吸困難，產蛋減少，蛋殼質量差，最終死亡。

2.2 剖檢病變

解剖病死雞，打開胸腔、腹腔，可聞到較大臭味；心包膜增厚，內有心包積液，心包膜表面有黃色纖維素性滲出物附著，見圖1a；肺臟水腫、出血；肝臟表面有膠凍樣滲出物，見圖1b；腸壁變薄，十二指腸充血，盲腸鼓氣，直腸末端彌漫性出血；卵泡充血，卵黃破裂，見圖1c。

注：a.心包膜增厚；b.肝臟表面膠凍樣滲出物；c.卵泡充血、卵黃破裂。

2.3細菌分離鑒定

血瓊脂培養基上，生長出大量灰白色、表面濕潤、光滑、邊緣整齊的圓形菌落，純化后在尿道菌顯色培養基上呈現為紅色菌落，見圖2；質譜鑒定為大腸桿菌，見圖3，命名為EC232。

2.4藥物敏感性結果

藥敏試驗結果如表1所示。EC232為多重耐藥菌株，對9種受試抗菌藥物耐藥，其中氟苯尼考、氯霉素、四環素的MIC 值最高，均為 128μg/mL 多黏菌素的MIC值達到 8μg/mL ；該菌僅對阿米卡星、替加環素、頭孢他啶、阿莫西林/克拉維酸及美羅培南敏感。

2.5 耐藥基因

通過與ResFinder數據庫比對，EC232中鑒定出7大類17種已知耐藥基因，其中氨基糖苷類耐藥基因種類最多，達到7種，詳見表2。該菌攜帶多黏菌素耐藥基因mcr-1，同時也檢測出超廣譜β -內酰胺酶（ESBLs）編碼基因 bla_CTX-M-65 。

2.6 mcr-1遺傳環境

mcr-1位于IncHI2型質粒上，該基因下游為2型磷脂酸磷酸酶基因pap2和溶血素表達調節蛋白hha，相鄰兩側未發現IS插入序列，但在該基因下游33424bp處發現截斷的Tn3轉座子基因。序列比對發現，EC232的mcr-1contig與NCBIGenBank中多條序列的核苷酸同源性大于 99% 這些同源序列不僅來自于禽源分離株，也在人源分離株中檢出，如人醫臨床ICU大腸桿菌分離株的質粒序列（pE-T84-1-mcr-1）、人血流感染來源肺炎克雷伯菌分離株的質粒序列（pKP121-1-mcr）及人源沙門菌分離株的質粒序列（pSC2017167-mcr-256k）。具體如圖4所示。

3討論

大腸桿菌是家禽消化道的共生菌，也是常見的條件致病菌，在禽只免疫力低下時可致病。大腸桿菌病常與新城疫[5]、傳染性法氏囊病[及傳染性支氣管炎[等病毒性傳染病發生混合感染，導致雞生產性能下降及死亡率升高，給養殖戶帶來經濟損失。雞養殖中，常使用抗生素預防或治療大腸桿菌病，包括氟苯尼考、多黏菌素、阿莫西林、頭孢噻、慶大霉素等，這些藥物長期不合理使用，使雞源大腸桿菌產生了耐藥性，削弱了抗生素的治療效果[8。本研究分離株為多重耐藥菌株，對一半以上的受試抗生素耐藥，對常用抗生素氟苯尼考、四環素的MIC值高達 128μg/mL ，對慶大霉素、頭孢噻及復方新諾明的MIC值也均高于 32μg/mL 對多黏菌素的MIC達到了 8μg/mL ，超出耐藥折點3倍。

此前，被稱作“最后防線”藥物的多黏菌素常被添加在飼料中用于促進畜禽生長和預防細菌感染，直到可轉移性多黏菌素耐藥基因mcr-1的出現，迫使人們重新審視這一用法的合理性。mcr-1可由多種質粒攜帶，以IncI2、IncX4、IncHI2型質粒最為流行，本研究分離株mcr-1基因位于IncHI2質粒上。在該基因兩側通常存在插入序列，如ISApl1，通過形成復合轉座子的方式介導mcr-1轉移，但也有部分mcr-1兩側無插入元件。Snesrud等[推斷，這可能是mcr-1為維持在菌體中穩定存在而丟棄了插入元件。更糟糕的是，mcr-1基因常與多種重要耐藥基因共存，如ESBLs基因、碳青霉烯酶基因等[10]，導致菌株對多種抗生素耐藥。數據顯示，大腸桿菌是mcr-1的常見細菌宿主之一，在食品動物中十分常見[10]。有研究認為，mcr-1基因的全球擴散可能與基于食物鏈的傳播途徑有關[1]。序列比對發現，本研究菌株EC232mcr-1兩側序列與人源菌株核苷酸一致性可達 99% 以上，菌株不局限于大腸桿菌，也包括沙門菌和肺炎克雷伯菌等，這意味著mcr-1的宿主十分廣泛，跨種傳播風險較高。

綜上所述，致病性大腸桿菌耐藥性問題已日趨嚴重，如不采取應對措施將會使養殖業逐步陷入無藥可用的境地，造成更為巨大的經濟損失，也會對人類健康構成威脅。停止盲目用藥、盡可能避免預防性用藥是首要措施；其次要加強對養殖場污水、污物排放的監管，降低耐藥菌、耐藥基因污染環境的風險；同時，應實施科學的生物安全管理制度，降低大腸桿菌致病風險[12]。

參考文獻：

[1] BOJESEN A M，AHMED U，SKAARUP H， et al. Recurring outbreaks by the same Escherichia coli ST10 clone in a broiler unit during18 months[J]. Veterinary Research，2022，53（1）.

[2] WANG C，PORS SE，OLSENRH，et al. Transmission and pathogenicity of Gallibacterium anatis and Escherichia coli in embryonated eggs[J].Vet Microbiol，2018，217： 76-81.

[3]姜曉彤，王義敏，何元龍，等.山東省禽源性大腸桿 菌耐藥性研究[J].家禽科學，2023，45（4）：51-55+67.

[4]LIUY，WANGY，WALSHTR，etal.Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China： a microbiological and molecular biological study[J].The Lancet Infectious Diseases，2016，16（2）：161-168.

[5]李強.一例肉雞新城疫繼發大腸桿菌病的防治[J]. 家禽科學，2020 （11）：29.

[6] 韓利萍.一例雞傳染性法氏囊病和大腸桿菌混合感 染的診治[J].家禽科學，2024，46（9）：90-92.

[7]高榮均.雞傳染性支氣管炎與大腸桿菌病混合感染 診治[J].畜牧獸醫科學，2020（11）：153-154.

[8] 余洪濤，周應海.雞大腸桿菌病的科學預防與治療[J]. 家禽科學，2021（08）：29-31.

[9]SNESRUD E，HE S，CHANDLERM， etal.A Model for Transposition of the Colistin Resistance Gene mcr-1 by ISApl1[J].Antimicrob Agents Chemother， 2016，60（11）： 6973-6976.

[10]GAO R，HU Y，LI Z，et al.Dissemination and Mechanism for the MCR-1 Colistin Resistance[J]. PLOS Pathogens，2016，12（11）： e1005957.

[11] ZHI C，LVL，YUL F，et al.Dissemination of the mcr-1 colistin resistance gene[J].Lancet Infect Dis， 2016，16（3）： 292-293.

[12]王明月.蛋雞大腸桿菌病的診療和防治措施技 術[J].家禽科學，2023，45（06）：27-29+48.

Case Study and Antibiotic Resistance Profiling of an mcr-1 Positive Escherichia coliInfection in Chickens

WANG Yao12，LI Yujie2，LI Bo² ，WANG Guisheng2，SHENG Yingxia，SONG Shikail [1.PoultryResearch Institute，ShandongAcademyofAgriculturalScience，Jinan25ooo，China; 2.ShandongAnimal DiseasePreventionand Control Center（ShandongProvincial Zoonotic Disease SurveillanceCenter），Jinan 250i00，China; 3.ShandongProvincialAnimal HusbandryGeneral Station，Jinan25oloo，Chinal

Abstract：With the increasing intensification of poultry farming，the incidence and difficulty of prevention and control of colibacillsis have increased accordingly.The number of chickens dying from colibacillosis in China each year is enormous，resulting in severe economic losses.In February 2023，a strain of mcr- I -positive multidrug-resistant Escherichia coli was isolated from the viscera of a dead chicken.This strain carries 17 antibiotic resistance genes and is resistant to gentamicin，florfenicol，chloramphenicol，tetracycline，ceftriaxone，cefotaxime，polymyxin， ciprofloxacin，and trimethoprim ?^- sulfamethoxazole.Sequence analysis revealed that mcr-1 is located on the IncHI2 plasmid，with its flanking sequences highly homologous to those of humanderived E.coli，Salmonella，and Klebsiellapneumoniae.The emergence of critical antibiotic resistance genes such as mcr-1 in chicken-derived pathogenic E .colinot only posesa threat to thehealthy development of the poultry industry but also elevates the risk of antibiotic-resistant bacteria and genes spreading to humans along the chicken product production chain.

Keywords：Chicken;Escherichia coli;mcr-1