tva受體基因起始密碼子突變對清遠麻雞感染K亞群禽白血病病毒的影響

摘要：【目的】探究tva受體基因起始密碼子突變 對清遠麻雞感染K亞群禽白血病病毒（Avianleukosis virus subgroupK，ALV-K）的影響?！痉椒ā坷弥苯訙y序方法對清遠麻雞不同品系tve ι c .3 Ggt; A 突變位點進行基因分型。利用流式細胞術和RT-qPCR 檢測RCASBP（K）-EGFP熒光報告病毒和ALV-KGD1601病毒感染清遠麻雞tva c. 3 Ggt; A 突變位點不同基因型雞胚成纖維細胞（Chickenembryo fibroblasts，CEFs）的情況。利用RT-qPCR檢測ALV-KGD1601病毒感染清遠麻雞 突變位點不同基因型雛雞的情況?！窘Y果】tvac . 3 G gt; Λ 突變位點的基因分型結果顯示，雜合突變基因型 t ν a c. 3 G/ A 和純合突變基因型 存在于清遠麻雞K、M品系， 頻率分別為0.183、0.133，tvac.3A/A頻率分別為0.116、0.033。流式細胞術和RT-qPCR檢測結果顯示，tva c. 3 Ggt;A 突變位點野生型 tva c.3G/G CEFs對 RCASBP（K）-EGFP 和 ALV-KGD1601病毒易感，而純合突變基因型tv ι c. 3 A/ A CEFs有效抗RCASBP（K）-EGFP和ALV-KGD1601病毒的感染，表明tvac. 3 Ggt; A 突變導致清遠麻雞體外抗ALV-K的感染。ALV-K攻毒試驗結果表明，tva c. 3 Ggt; A 突變導致清遠麻雞體內抗ALV-K的感染?！窘Y論】tva c. 3 Ggt; A 突變引起清遠麻雞體外、體內抗ALV-K的感染，該突變位點可作為清遠麻雞ALV-K抗性選育的遺傳標記。

中圖分類號：S855.3 文獻標志碼：A 文章編號：1001-411X（2025）03-0351-07

Effect of initiation codon mutation within tva gene on Qingyuan partridge chicken resistance to infection by avian leukemia virus subgroup K

XU Huijuan1， KUANG Zhixiang2， ZUO Kejing2， WU Chengyang'， ZHENG Honghao'， XIE Qingmei'，CHEN Weiguo' （1 College ofAnimal Science，South China Agricultural University/Guangdong Provincial KeyLaboratoryof Animal Health Aquaculture andEnvironmental Control， Guangzhou 510642， China; 2Guangdong Love-Health Biotechnology Co.，Ltd， Qingyuan 511800， China; 3 Guangzhou Zoo/Guangzhou Wildlife Research Center， Guangzhou 510070， China）

Abstract： 【Objective】 To investigate the effect of initiation codon mutation within tva receptor gene （tva ） on Qingyuan partridge chicken resistance to infection by avian leukosis virus subgroup K （ALV-K）.

【Method】 The tva c . 3 G gt; A mutation site within Qingyuan partridge chicken lines was genotyped by using direct sequencing method. The infection of RCASBP（K）-EGFP fluorescent reporter virus and ALV-K GD1601 virus to chicken embryo fibroblasts （CEFs） with different genotypes of tva c. 3 Ggt;A mutation site were detected by flow cytometry and RT-qPCR， respectively. The infection of ALV-K GD160l virus to Qingyuan partridge chicks with different genotypes of tva c. 3 Ggt;A mutation site were detected by RT-qPCR. 【Result】 The genotyping results of tva c. 3 Ggt;A mutation site showed that the heterozygous mutant genotype tva c . 3 G gt; A and the homozygous mutant genotype tva c.3A/A existed in Qingyuan partridge chicken lines K and M， with the frequencies of0.183 and 0.133 for tva c.3G/A，0.116 and 0.033 for tva c.3A/A，respectively.The results of flow cytometry and RT-qPCR showed that the tva mutation site wild-type tva c.3G/G CEFs were susceptible to infection of both RCASBP（K）-EGFP and ALV-K GD1601 virus， while the homozygous mutant genetype tva c.3A/A CEFs were effectively resistant to infection of RCASBP（K）-EGFP and ALV-K GD1601 viruses， demonstatingthat tva c. 3 Ggt;A mutation caused Qingyuan partridge chicken resistance to infection of ALV-K in vitro. The results of ALV-K challenge test indicated that tva c . 3 Ggt;A mutation led to Qingyuan partridge chicks resistance to infection of ALV-K in vivo. 【Conclusion】 The tva c. 3 Ggt;A mutation confers Qingyuan partridge chickenresistance to infection of ALV-Kboth in vitro and invivo，indicating that itcan be used as a genetic marker for ALV-K resistance selection in Qingyuan partridge chicken.

Key words： Qingyuan partridge chicken; Avian leukosis virus subgroup K; tva receptor gene; Mutation; Genetic resistance

K亞群禽白血病是由K亞群禽白血病病毒（AvianleukosisvirussubgroupK，ALV-K） 感染引起的禽免疫抑制性腫瘤性傳染病[1]。ALV-K是感染雞群的禽白血病病毒新亞群[2-3]；然而，近年來我國雞種禽白血病流行病學調查研究發現，ALV-K在我國不同類型雞種中普遍發生與流行[4-9]，已成為我國雞群禽白血病的主要病原。感染雞群會產生持續性的病毒血癥、生產性能下降以及嚴重的免疫抑制，給我國養禽業造成重大的經濟損失[4，10]。迄今為止，K亞群禽白血病尚無商品化疫苗和有效的治療方法，主要通過傳統的種群凈化措施進行防控[11-12]；然而，種群凈化周期長、費用高，且凈化后陰性雞群依然面臨再次感染ALV-K的風險，很難維持種群凈化的成效[13-14]。因此，迫切需要控制K亞群禽白血病的新策略和技術手段。

雞tva受體基因編碼Tva受體蛋白，介導A亞群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup A，ALV-A）侵入宿主細胞，繼而發生感染[15]。有研究表明tva受體基因的遺傳突變可能導致宿主對ALV-A的感染產生抗性[16-17]。陳偉國等[18]研究發現，我國黃羽肉雞品系tva受體基因編碼區第3位堿基由G突變為 ，導致tva受體基因起始密碼子由ATG突變為ATA，致使我國黃羽肉雞品系抗ALV-A感染。Prikryl等[19報道ALV-K與ALV-A共用tva受體基因編碼的Tva受體蛋白作為細胞受體。本研究前期工作發現清遠麻雞品系中存在 突變，然而，該突變對清遠麻雞感染ALV-K的影響尚不清楚。因此，本研究將在體外、體內驗證 突變是否致清遠麻雞抗ALV-K感染，以期鑒定清遠麻雞ALV-K抗性位點，為清遠麻雞K亞群禽白血病抗病育種提供具有育種價值的分子標記。

1材料與方法

1.1試驗動物、細胞株、毒株及質粒

清遠麻雞F、K、M、W品系抗凝血樣均采自廣東愛健康生物科技有限公司，每個品系均隨機采血60份，共240份血液樣品。 t ν a c. 3 Ggt;A 突變位點野生型 ，雜合突變基因型 和純合突變基因型 t i v a c . 3 A/ A 種蛋和1日齡雛雞均由廣東愛健康生物科技有限公司清遠麻雞原種場提供。1日齡無特定病原（Specific pathogen free，SPF）雞苗和9日齡SPF胚蛋均購自廣東新興大華農禽蛋有限公司SPF實驗動物中心。DF-1細胞系和RCASBP（K）-EGFP重組質粒為廣東省畜禽健康養殖與環境控制重點實驗室保存。ALV-KGD1601毒株為華南農業大學曹偉勝教授惠贈。

1.2 主要試劑

血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；質粒小量提取試劑盒、凝膠DNA回收試劑盒均購自諾維贊（南京）公司；KOD-FX酶購自Toyobo公司；pMD19-T、反轉錄試劑盒、PrimeScript？One Step RT-PCRKit購自Takara 公司;FastStart SYBR Green Master（Rox）購自Roche公司；DMEM細胞培養基、胎牛血清（Fetalbovineserum，FBS）、Opti-DMEM無血清培養基、青鏈霉素、胰蛋白酶均購自Gibco公司；Lipofectamine300o 轉染試劑、TRIZOL reagent 購自Invitrogen公司；ELISA試劑盒購自哈爾濱國生公司。

1.3RCASBP（K）-EGFP熒光報告病毒的拯救及ALV-KGD1601株病毒的擴繁

將重組質粒RCASBP（K）-EGFP轉染入DF-1細胞，7d內觀察GFP熒光表達情況，從DF-1細胞上清液中分離出表達綠色熒光蛋白的重組病毒RCASBP（K）-EGFP，測定其感染單位（IU），將 的重組病毒RCASBP（K）-EGFP分裝并保存于 冰箱備用。用 孔徑濾膜過濾ALV-KGD1601株病毒液后，接種于 80 % 匯合度的DF-1細胞系，孵育 2 h 后，換成含 2 % （）FBS的維持培養液繼續培養。至DF-1細胞長滿后，正常盲傳3＼～4代。收集含ALV-KGD1601株病毒液的DF-1細胞上清液，用ELISA試劑盒檢測病毒效價，確保樣品與陽性對照的光密度比值 （ S / P ） ? 2 . 0 ，置于 冰箱保存以備后續試驗。

1.4清遠麻雞品系 突變位點的基因分型

提取清遠麻雞F、K、M、W品系抗凝血樣的基因組DNA，采用PCR擴增 t ν a c. 3 Ggt;A 突變位點所在的tva基因序列[20]。將PCR擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，應用Chromas2.4軟件分析測序序列中 突變位點的遺傳變異，對清遠麻雞品系的 突變位點進行基因分型。

1.5清遠麻雞 突變位點不同基因型雞胚成纖維細胞的分離與培養

將清遠麻雞 突變位點不同基因型（野生型 t ν a c. 3 G/ G. 、雜合突變基因型 和純合突變基因型 的9日齡胚蛋消毒后，用彎頭鑷子打開氣室、殼膜，挑出雞胚置于含PBS溶液的平血中，用眼科剪和鑷子剔除四肢、內臟，漂洗2次去除血污。將清洗后的肌肉組織塊置于 2 m L 離心管中，使用眼科剪剪成肉糜狀，加入 0 . 2 5 % （ w ） 胰酶溶液后，置于水浴箱中充分消化 2 0 ～ 3 0 m i n ，最后加入適量FBS停止消化。使用 孔徑細胞濾膜過濾后，將組織濾液于 離心 4 m i n ，保留底部消化細胞，用完全培養基對其進行重懸，分裝入無菌培養皿中，獲取純化的雞胚成纖維細胞（Chicken embryo fibroblasts，CEFs），置于 體積分數為 的培養箱中培養。

1.6利用流式細胞術檢測RCASBP （ K） -EGFP熒光報告病毒的體外感染

將清遠麻雞 突變位點不同基因型的CEFs分別接種于24孔板中，每種基因型3次重復，每孔接種 個細胞。培養 2 4 h 左右待細胞長至約 80 % 后，向每孔CEFs加入 2 5 0 μ L RCASBP（K）-EGFP病毒液（終濃度為 。孵育 后，移除病毒液，使用含 1 % （φ）FBS的維持培養基繼續培養。在感染后的第5天，利用BDFACSVerseTM流式細胞儀（BectonDickinson，美國）分析 突變位點不同基因型CEFs中GFP陽性細胞的百分率。

1.7 利用RT-qPCR檢測ALV-KGD1601病毒的體外感染

將清遠麻雞 突變位點不同基因型CEFs分別接種于24孔板中，每種基因型3次重復，每孔接種 個細胞。培養 2 4 h 后，利用 2 5 0 μ L ALV-KGD1601株病毒液 （ S / P = 2 . 2 ） 感染CEFs。感染后 2 4 h ，將培養基替換為新鮮培養基，將CEFs置于 體積分數為 條件下孵育 。感染后第1、2、3和4天，分別收集細胞上清液，進行RNA提取和cDNA合成，參照前期建立的ALV-KRT-qPCR方法檢測ALV-KGD1601毒株感染 t ν a c. 3 Ggt;A 突變位點不同基因型CEFs后的病毒滴度[20]。

1.8 ALV-K體內攻毒試驗

利用清遠麻雞K品系 t ν a c. 3 Ggt;A 突變位點不同基因型種雞進行配種，收集種蛋進行孵化，隨機挑選40只孵化的1日齡雛雞分為2組，每組20只，每組另選3只1日齡SPF雛雞作為攻毒對照，飼養于2個隔離器，提供飼料和水。1日齡時，每只雛雞腹腔接種 0 . 4 m L ALV-KGD1601株病毒液 （ S / P=2 . 2 ） ，5日齡時，使用相同的方法再次進行ALV-K攻毒。攻毒后2周，采集每只雛雞的抗凝血樣，通過直接測序方法對每只雛雞 t ν a c. 3 Ggt;A 突變位點進行基因分型，確定每只雛雞的基因型[19]。攻毒后4周，采集每只雛雞的抗凝血樣，抽提總RNA并合成cDNA，利用前期建立的RT-qPCR方法檢測 t r a c . 3 Ggt;A 突變位點不同基因型雛雞對ALV-KGD1601毒株的感染情況[20]

1.9 數據處理

使用GraphPadPrism8.0軟件進行數據統計分析和繪圖，數據結果以平均值 ± 標準差表示。利用Popgene軟件分析 突變位點在清遠麻雞F、K、M、W品系中的基因型頻率分布。

2結果與分析

2.1 清遠麻雞不同品系 突變位點的基因型頻率

清遠麻雞F、K、M、W品系t a c. 3 Ggt;A 突變位點的基因分型結果如表1所示。在清遠麻雞K、M品系中存在雜合突變基因型 t i v a c . 3 G / A 和純合突變基因型tvac.3A/A，tvac.3G/A 頻率分別為0.183、0.133，tvac.3A/A頻率分別為0.116、0.033。在清遠麻雞F、W品系中沒有檢測到 突變位點。

2.2 RCASBP（K）-EGFP熒光報告病毒的拯救

將RCASBP（K）-EGFP表達質粒轉染入DF-1細胞，轉染后 ，用倒置熒光顯微鏡觀察DF-1細胞中GFP熒光標記蛋白的表達情況。結果如圖1所示，DF-1細胞高度表達GFP綠色熒光，表明成功拯救了RCASBP（K）-EGFP熒光報告病毒。

2.3tva 突變致清遠麻雞體外抗RCASBP -EGFP的感染

RCASBP（K）-EGFP病毒對 突變位點不同基因型CEFs的感染情況如圖2、3所示。RCASBP（K）-EGFP病毒對野生型 、雜合突變基因型tvac.3G/ACEFs的感染率分別為9 7 % 和 81 % ，而對純合突變基因型tvac.3A/ACEFs的感染率低于 0 . 3 % ，呈不感染狀態，表明tvac. 3 Ggt;A 突變導致清遠麻雞體外抗RCASBP（K）-EGFP感染。

為進一步驗證RCASBP（K）-EGFP感染的結果，利用ALV-KGD-1601株分別感染 A突變位點不同基因型，ALV-K在 突變位點不同基因型CEFs中的增殖情況如圖4所示。ALV-KGD-1601毒株在野生型tvac.3G/GCEFs中復制和生長迅速，感染后第4天滴度達到約 。相比之下，在純合突變基因型tvac.3A/ACEFs中，ALV-KGD-1601毒株沒有明顯的生長趨勢。雜合突變基因型tvac.3G/ACEFs被ALV-K野毒有效感染，ALV-K的生長動力學特征與野生型 CEFs相似，感染后第4天滴度約為 。結果表明 突變引起清遠麻雞在體外抗ALV-KGD-1601病毒感染。

2.4tva r c. 3 Ggt;A 突變致清遠麻雞體內抗ALV-K 的感染

tva c. 3 Ggt;A 突變對清遠麻雞體內感染ALV-K的影響如圖5所示。感染ALV-KGD-1601毒株4周后，6只SPF雛雞均為ALV-K陽性，血清病毒滴度介于 ，說明ALV-K體內攻毒試驗成立。野生型 雛雞（16只）攻ALV-KGD-1601病毒后，血清病毒滴度介于 ，均為ALV-K陽性；雜合突變基因型tvac. 3 G/ A 雛雞（13只）攻ALV-K野毒后有10只為ALV-K陽性，其血清病毒滴度介于 另外3只雛雞未檢測到ALV-K；而純合突變基因型tvac.3A/A雛雞（11只）均為ALV-K陰性。結果表明， 突變導致清遠麻雞在體內抗ALV-K 感染。

3討論與結論

近年來禽白血病的分子流行病學調查研究發現，ALV-K在我國地方雞種、黃羽肉雞、白羽肉雞、蛋雞中普遍發生與流行[4，7-9]。ALV-K持續不斷地感染雞群，賦予雞群極大的選擇壓力，導致某些個體為適應或逃逸病毒的侵染而對ALV-K的感染產生遺傳抗性。本研究鑒定發現清遠麻雞品系tva受體基因中存在 突變，致使清遠麻雞在體外、體內均抗ALV-K感染，證實 突變位點為ALV-K抗性位點。

ALV受體基因的遺傳突變可能導致受體蛋白表達完全缺失或表達一個不適合作為病毒受體的缺陷型受體蛋白，從而缺失或降低ALV表面糖蛋白與受體蛋白的結合親和力，致使宿主細胞對特定亞群ALV的感染產生抗性[20-22]。Prikryl等[19]報道雞tva基因編碼的Tva蛋白是ALV-K與ALV-A的共用細胞受體，其可有效地介導ALV-K感染并進入宿主細胞。Tva受體中的幾個區域和特定的氨基酸殘基已被確認為是與ALV-K包膜糖蛋白結合親和力的關鍵決定因子，并介導病毒的有效感染與進入。決定Tva受體蛋白相關功能的LDL-A（Low-densitylipoproteinA）結構域，由40個氨基酸構成，位于Tva受體蛋白成熟肽氨基端胞外區域第11—51殘基之間，6個半胱氨酸之間的3個二硫鍵維持Tva受體蛋白的穩定結構，從而充分介導ALV-K進入宿主細胞[23]。Li等[24]研究報道Tva受體蛋白殘基E53、L55、H59和G70是Tva受體蛋白介導ALV-K感染的關鍵氨基酸殘基。tva c. 3 Ggt;

A突變引起tva受體基因起始密碼子由ATG突變為ATA，致使Tva受體蛋白第1個氨基酸由甲硫氨酸變為異亮氨酸，推測該突變可能導致Tva受體蛋白表達缺失或表達一個不適合作為ALV-K受體的缺陷型Tva受體蛋白，這也解釋了 t v a c . 3 Ggt;A 突變致使清遠麻雞抗ALV-K感染的原因。

陳偉國等[18]前期研究發現我國黃羽肉雞品系存在 突變，致使我國黃羽肉雞品系對ALV-A的感染產生抗性。因此，t ∵ a c. 3 Ggt; A 突變位點可作為ALV-A、ALV-K的共同抗性位點?？共∮N是控制禽白血病的重要手段和有效策略，本研究發現清遠麻雞K、M品系中存在雜合抗性基因型 和純合抗性基因型tvac.3A/A，tvac.3G/A頻率分別為0.183、0.133，tvac.3A/A頻率分別為0.116、0.033，表明清遠麻雞K、M品系具有良好的ALV-A、ALV-K協同抗性改良潛力，可用于篩選抗ALV-A、ALV-K新品種（品系）的育種素材，為實現清遠麻雞A、K亞群禽白血病的抗性選育提供技術支撐。

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