過表達(dá)VIM基因的LMH細(xì)胞系構(gòu)建及對GAstV增殖效率的影響

中圖分類號：S855.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-411X（2025）03-0342-09

Construction of LMH cell line overexpressing VIM gene and effect on replication efficiencyofGAstV

TANG Zheng12， XIANG Yong2， SUN Minhua2， FENG Saixiang1， LIAO Ming12， HUANG Yu3， WAN Chunhe3，LIU Rongchang3，F(xiàn)U Guanghua3， LUO Kaijian1

（1 Colleg of VeterinaryMedicine，SouthChina Agricultural University，Guangzhou510642，China; 2IstituteofAnimal Health，

Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratoryfor Prevention and Control of Avian Influenza and Other Major Poultry Diseases，MinistryofAgriculture and Rural Affairs/KeyLaboratory ofLivestock Disease Preventionof Guangdong

Province， Guangzhou510640，China;3 Institute ofAnimal Husbandryand VeterinaryMedicine，F(xiàn)ujian Academyof Agricultural Sciences/Fujian Provincial KeyLaboratory for Avian Diseases Control and Prevention，F(xiàn)uzhou 35oo3，China）

Abstract： 【Objective】 To improve the proliferation eficiency of goose astrovirus （GAstV） by constructing a leghorn male hepatoma （LMH） celline stably overexpressing vimentin （VIM） gene. 【Method】 The VIM gene was amplified from goose-derived cels by PCR and subsequently ligated into the lentiviral gene overexpression system vector pLV-sfGFP （2A） Puro by homologous recombination to obtain the recombinant lentiviral plasmid pLV-sfGFP （2A） Puro-VIM-Flag（pLV-VIM）. The 293T cells were used to package the recombinant lentivirus particles， which subsequently infected LMH cels and were screened with puromycin to obtain target cells. The effect of VIM on GAstV proliferation efciency was evaluated by Western blot， RT-qPCR， indirect immunofluorescence and assays. Finally， the effect of VIM on GAstV invasion was analyzed by antibody blocking test. 【Result】 The recombinant lentiviral vector pLV-VIM was successfully constructed as confirmed by sequencing and restriction enzyme digestion. After screening， LMH-VIM celline overexpressing the VIM gene （LMH-VIM） and its control group cell line （LMH-NC） were obtained. The results of Western blot showed that the expression level of VIM protein in LMH-VIMcells was significantly higher than that in LMHNC cells. Overexpression of VIM significantly upregulated GAstV mRNA and protein expression levels in LMH-VIMcels，as well as viral titer in the cellsupernatant. Antibody blocking test showed thatcell surface VIM could actively promote GAstV invasion into cels. 【Conclusion】 The study provides a new insight and ideas for improving the proliferation titerof GAstV in the in vitro cell culture and is of great significance for the vaccine research and development， as well as prevention and control of gosling gout disease caused by GAstV infection.

Key words： Vimentin gene; Leghorn male hepatoma celline; Gene overexpression; Goose astrovirus Proliferation efficiency

新型鵝星狀病毒（Gooseastrovirus，GAstV）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種致雛鵝痛風(fēng)且高度致死的禽星狀病毒[1]，感染后主要造成雛鵝內(nèi)臟器官表面和關(guān)節(jié)腔內(nèi)產(chǎn)生大量的尿酸鹽沉積，感染率和死亡率分別可高達(dá) 80 % 和 50 % 左右 ? [ 2 ? 6 ] 。GAstV屬于星狀病毒科禽星狀病毒屬3型禽星狀病毒成員，為單股正鏈、無囊膜的RNA病毒[]。

由GAstV造成的致死性雛鵝痛風(fēng)疾病在我國廣泛流行，給養(yǎng)鵝業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[8-9]；且該疾病疫苗研發(fā)的進(jìn)展尤其緩慢，尚無疫苗可用，防控形勢十分嚴(yán)峻。目前適用于GAstV增殖的可傳代細(xì)胞系通常為雞肝癌（Leghornmalehepatoma，LMH）細(xì)胞[1]，但其培養(yǎng)的病毒滴度較鵝胚原代腎細(xì)胞低，在一定程度上限制了對該病毒致病機制的深入研究，同時也限制了該疾病疫苗研發(fā)的高效性和便利性?；诖耍岣逩AstV在LMH細(xì)胞中的增殖滴度對疫苗研發(fā)、生產(chǎn)和該疾病致病機制的研究具有重要意義。

波形蛋白（Vimentin，VIM）作為一種高度保守的中間纖維蛋白，最初發(fā)現(xiàn)于間葉細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞骨架的重要組成成分之一。VIM可影響細(xì)胞黏附與遷移，參與細(xì)胞的信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和增殖，并具有警報素功能[11-12]。VIM在細(xì)胞內(nèi)高豐度表達(dá)，其在細(xì)胞表面及胞外的存在直到近些年才被發(fā)現(xiàn)，并逐漸有研究報道VIM在新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）[13-15]、豬繁殖與呼吸綜合征病毒[16]、寨卡病毒[17]等多種病毒的侵入和復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用。同時，病毒感染能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)VIM重排，加強其與病毒蛋白的互作并促進(jìn)病毒復(fù)制[18-20]。

目前關(guān)于VIM在GAstV中的作用的研究報道還較少。本研究在前期工作中利用鵝胚原代腎細(xì)胞及LMH細(xì)胞研究GAstV的感染機制，其中，以GAstVVP70為誘餌蛋白，通過GSTpull-down和Co-IP等方法從鵝胚腎細(xì)胞的膜蛋白中捕獲到眾多關(guān)鍵蛋白分子，VIM便是其中之一；基于此，本研究推測VIM是潛在影響GAstV侵入和感染的關(guān)鍵調(diào)控因子之一。因此，研究VIM與GAstV病毒復(fù)制之間的關(guān)系，對于防控GAstV所致雛鵝痛風(fēng)疾病具有重要意義。本研究擬通過慢病毒基因過表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建可穩(wěn)定過表達(dá)VIM基因的LMH細(xì)胞系，以期顯著促進(jìn)GAstV的增殖水平，為提高GAstV的增殖滴度提供新的見解和思路。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞、病毒與載體LMH細(xì)胞、人腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞、GAstVGD-ZJ-21-01病毒株由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽流感等家禽重大疾病防控重點實驗室分離鑒定并保存；慢病毒基因過表達(dá)載體pLV-sfGFP（2A）Puro（貨號：VL3408）及其輔助載體pH1和pH2均為北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.2主要試劑和抗體高保真酶Phanta？MaxSuper-FidelityDNAPolymerase（貨號：P505）、無縫克隆試劑盒 ClonExpress？II One Step Cloning Kit（貨號：C112）為南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；內(nèi)切酶XbaI（貨號：R1045）和XhoI（貨號：R1046）為NewEnglandBiolabs公司產(chǎn)品；總RNA提取試劑盒（貨號：220011）為上海飛捷生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA體外轉(zhuǎn)染試劑PolyJet（貨號：SL100688）為SignaGen公司產(chǎn)品；凝膠回收試劑盒DNAGelExtractionKit（貨號：D2500）、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒Endo-freePlasmidMidiKit（貨號：D6929）為Omega公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRTMasterMixRealTime（貨號：RR036A）為TaKaRa公司產(chǎn)品；熒光定量PCR酶Hieff？qPCRSYBRGreenMasterMix（貨號：11201ES08）為上海翌圣生物科技有限公司產(chǎn)品。鼠抗Flag-tag單克隆抗體（貨號：F1804）為Sigma公司產(chǎn)品；兔抗GAPDH抗體（貨號：ab181602）為Abcam公司產(chǎn)品；鼠抗Vimentin單克隆抗體（貨號：sc-80975）為Santa公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（貨號：A0208）、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（貨號：A0216）、AlexaFluor488標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（貨號：A0423）均為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；GAstV-2VP27多克隆抗體由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所制備并惠贈[21]。

1.2方法

1.2.1VIM基因的擴(kuò)增及質(zhì)粒構(gòu)建參照試劑盒說明書，從鵝源組織細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參考NCBI中鵝源VIM基因序列（Genebank：XM048061750.1），按照表1中自行設(shè)計的引物（VIM-F、VIM-R），以cDNA為模板通過PCR擴(kuò)增VIM基因！ （ 1 3 8 0 b p） 。以回收的VIM基因為模板，利用引物（VIM-F2、VIM-R-Flag）通過PCR進(jìn)一步在VIM基因末端添加Flag標(biāo)簽與VIM基因融合表達(dá)（VIM-Flag）以便于檢測；回收目的基因VIM-Flag，以其作為模板，利用同源臂引物（VIM-pLV-F、VIM-pLV-R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使得VIM-Flag基因兩端分別添加位于pLV-sfGFP（2A）Puro載體XbaI和XhoI酶切位點兩側(cè)至少長為20bp左右的序列（VIM-Flag-pLV），以便其與XbaI和XhoI雙酶切后的慢病毒載體進(jìn)行同源重組。將上述帶有同源臂的VIM-Flag-pLV基因與線性化的pLV-sfGFP（2A）Puro載體進(jìn)行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，即獲得重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLV-sfGFP（2A）Puro-VIM-Flag，下文簡稱pLV-VIM（圖1）。

1.2.2VIM基因重組慢病毒包裝在直徑為 1 0 c m 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待 2 9 3 T 細(xì)胞單層融合至 90 % 時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取無菌 1 . 5 m L 離心管（A管），加入 DMEM培養(yǎng)基，隨后加入 的DNA體外轉(zhuǎn)染試劑PolyJet并充分混勻；另取一無菌 1 . 5 m L 離心管（B管），加入 DMEM培養(yǎng)基，隨后加入待包裝的慢病毒基因過表達(dá)質(zhì)粒pLV-VIM或pLV-NC（對照） 、慢病毒包裝輔助載體 p H 1 3 . 7 5 μ g 及 p H2 1 . 2 5 μ g 并充分混勻。將A管中已稀釋好的轉(zhuǎn)染試劑加入B管中，立刻充分混勻，于室溫靜置孵育 1 0～1 5 m i n 。在孵育等待時，用胰酶消化293T細(xì)胞，用含 1 0 % （ φ ） F B S 的DMEM培養(yǎng)基制備成約 的細(xì)胞懸液。根據(jù)需要制備的病毒量，將細(xì)胞懸液放入 1 5 m L 或 5 0 m L 離心管備用；將每 1 m L 轉(zhuǎn)染混合液加入 1 0 m L 細(xì)胞懸液，輕輕吹吸細(xì)胞混勻；將混勻細(xì)胞懸液加入 細(xì)胞培養(yǎng)皿，于 條件下培養(yǎng) 2 4 h ；去除含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基，清洗2遍細(xì)胞，加入 1 0 m L 慢病毒培養(yǎng)基［（DMEM培養(yǎng)基 + 1 0 % （ φ ） F B S+ 1 m m o l / L 丙酮酸鈉]。 4 8 h 后于 離心 去除細(xì)胞碎片，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清液；上清液中即為含有待表達(dá)基因的重組慢病毒顆粒，可直接用于靶細(xì)胞感染。

1.2.3穩(wěn)定過表達(dá)VIM基因的LMH細(xì)胞系構(gòu)建及鑒定取狀態(tài)良好的LMH細(xì)胞均勻接種至24孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至 70 %～8 0 % 時棄培養(yǎng)液，加入pLV-VIM重組慢病毒懸液于 培養(yǎng)箱中孵育 （同時設(shè)置空載體對照組）；孵育 2 h 后棄病毒液，加入新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)傳代；每次傳代培養(yǎng)時加入終濃度為 2 μ g / m L 的嘌呤霉素進(jìn)行抗性篩選，得到的陽性多克隆株即為慢病毒介導(dǎo)的過表達(dá)VIM基因的LMH細(xì)胞系，命名為LMH-VIM，對照組為LMH-NC。篩選過程中，通過熒光顯微鏡觀察自發(fā)綠色熒光的陽性細(xì)胞的占比，直至觀察到幾乎所有細(xì)胞均為陽性時，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行篩選驗證。將篩選好的細(xì)胞系傳代培養(yǎng)（含嘌呤霉素）10代后，提取細(xì)胞總蛋白，分別通過Flag抗體和VIM抗體進(jìn)行Westernblot檢測，分析2種細(xì)胞系中VIM蛋白的表達(dá)水平。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)首先將未做任何處理的LMH細(xì)胞用胰酶消化后制備成細(xì)胞懸液（每毫升不超過 個細(xì)胞），隨后上機至流式細(xì)胞儀，選取4 8 8 n m 為激發(fā)波長，以此為陰性對照將試驗參數(shù)調(diào)整到位。同理，將已制備好的自發(fā)綠色熒光的

LMH-VIM和LMH-NC單細(xì)胞懸液上機至流式細(xì)胞儀，試驗參數(shù)不變，對LMH-VIM和LMH-NC細(xì)胞中的綠色陽性細(xì)胞進(jìn)行篩選分析，明確陽性細(xì)胞的比例；并將分選出的陽性細(xì)胞收集至離心管中，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗。

1.2.5過表達(dá)VIM基因的LMH細(xì)胞對GAstV增殖效率的影響以 M O I=0 . 1 的GAstV分別感染LMH-VIM和LMH-NC 細(xì)胞，并置于 培養(yǎng)箱吸附 。吸附結(jié)束后棄病毒液，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞3次，更換為含 1 % （ φ ） F B S 的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。于感染 2 4 、 4 8 、 7 2 h 后收取細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白及RNA；通過Westernblot及RT-qPCR分析GAstV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制水平，同時在 時收取細(xì)胞上清液進(jìn)行 測定。

1.2.6RT-qPCR 參考總RNA 提取試劑盒說明書提取細(xì)胞RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。參考如下引物（GAstV ORF2： -GGGTGATCCGCAAGGAAATA- ！ -AAGTTTCGCCAGGGTTAGAG- GAPDH： -GGAAAGTCATCCCTGAGCTG- GGTCAACAACAGAGACATTGG- 對目的基因進(jìn)行RT-qPCR檢測。反應(yīng)體系：Hieff？qPCRSYBRGreen Master Mix 1 0 μ L. 上下游引物 各 1 μ L 、cDNA 1 μ L 、RNase Free 補足至2 0 μ L. 。擴(kuò)增條件： 預(yù)變性 5 m i n 變性 1 5 s 退火 3 5 s ，共40個循環(huán)。以GAPDH基因作為內(nèi)參，按照 方法計算各個基因mRNA的相對表達(dá)水平。

1.2.7Westernblot按照SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒說明書配制好凝膠；取出變性后的蛋白質(zhì)，每孔加入等量蛋白質(zhì)樣品。在 8 0 V 恒壓條件下垂直電泳直至溴酚藍(lán)指示劑接近分離膠底部，隨后在 恒壓下將蛋白膠轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜。取出硝酸纖維膜，用含 5 % （ w ） 脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉 2 h ；洗滌3次后加入一抗，于 孵育 1 2～1 8 h 用TBST緩沖液洗滌3次，加入二抗，于室溫孵育 ，洗滌3次后通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

1.2.8抗體封閉試驗為了明確細(xì)胞表面VIM對GAstV侵入細(xì)胞是否有影響，本研究進(jìn)行了抗體封閉試驗。將VIM單克隆抗體與LMH細(xì)胞于 孵育 （以IgG為對照），棄上清液，用PBS緩沖液清洗3次；隨后加入GAstV病毒液 于 孵育 ，棄上清液并清洗細(xì)胞3次，加入新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 2 4 h ；提取細(xì)胞蛋白及RNA，通過Westernblot及RT-qPCR分析細(xì)胞內(nèi)GAstV的復(fù)制水平；同時利用 4 % （ w ） 多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，進(jìn)行GAstV的間接免疫熒光試驗。

1.2.9間接免疫熒光試驗將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞用PBS緩沖液清洗3次；用 4 % （ w ） 多聚甲醛溶液固定 1 5 m i n 、PBS緩沖液清洗3次后加入通透液孵育 ；用PBS緩沖液清洗3次，加入封閉液于室溫孵育 3 0 m i n ；棄封閉液，加入一抗于 孵育1 2～1 8 h ；用PBST緩沖液清洗3次，棄廢液，加入綠色熒光二抗，于 避光孵育 ，PBST緩沖液清洗3次后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.10數(shù)據(jù)分析相關(guān)試驗至少進(jìn)行3次獨立重復(fù)，統(tǒng)計學(xué)分析使用GraphPadPrism軟件，試驗數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差呈現(xiàn)，統(tǒng)計學(xué)差異按照 t 檢驗進(jìn)行評估， Plt;0 . 0 5 表示具有顯著差異。

2結(jié)果與分析

2.1 VIM基因擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增VIM基因后，通過 1 0 g / L 瓊脂糖凝膠電泳觀察到約1383bp的目的條帶（VIM），與預(yù)期相符；回收目的基因后繼續(xù)通過PCR在VIM基因末端添加Flag標(biāo)簽基因，經(jīng) 1 0 g / L 瓊脂糖凝膠電泳觀察到約1407bp的目的條帶（VIM-Flag）；回收目的基因后繼續(xù)通過PCR在VIM基因兩端融合目標(biāo)載體的同源臂，經(jīng) 1 0 g / L 瓊脂糖凝膠電泳觀察到約1449 bp 的目的條帶（VIM-Flag-pLV）（圖2）?；厥詹⒓兓康幕颍瑴y序結(jié)果顯示其基因序列正確無誤。

2.2 重組慢病毒VIM基因過表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

將構(gòu)建好的pLV-VIM質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切（XbaI和XhoI，酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果（圖3）顯示，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳后可見2條明顯的條帶，與預(yù)期1395bp（VIM基因）和9000bp（線性載體）保持一致，說明酶切驗證無誤。測序分析進(jìn)一步表明該重組質(zhì)粒成功構(gòu)建。

2.3 穩(wěn)定過表達(dá)VIM基因的LMH細(xì)胞系的篩選及鑒定

將重組慢病毒顆粒感染LMH細(xì)胞后，在第1代細(xì)胞時僅有少量可自發(fā)綠色熒光的陽性細(xì)胞。由于嘌呤霉素可將陰性細(xì)胞殺死使得陽性細(xì)胞繼續(xù)增殖，隨著細(xì)胞的不斷傳代培養(yǎng)，陽性細(xì)胞逐漸增多，至第12代時，幾乎所有細(xì)胞均為陽性細(xì)胞（圖4），這一點也通過流式細(xì)胞術(shù)得到了驗證（圖5）。

M：DNAmarkerDL2000;1：以引物VIM-F、VIM-R進(jìn)行擴(kuò)增（VIM）;3：以引物VIM-F2、VIM-R-Flag進(jìn)行擴(kuò)增（VIM-Flag）；5：以引物VIM-pLV-F、VIM-pLV-R進(jìn)行擴(kuò)增（VIM-Flag-pLV）；2、4、6：陰性對照。

1：未酶切的pLV-VIM質(zhì)粒；2：經(jīng)XbaI和XhoI雙酶切的pLVVIM質(zhì)粒;M： DNA markerDL10000。 1：Undigested pLV-VIMplasmid;2：pLV-VIMplasmiddigestedwith XbaIandXhoI;MDNAmarkerDL10000.

Westernblot結(jié)果（圖6A）顯示，VIM-Flag融合蛋白成功在LMH-VIM細(xì)胞中表達(dá)，而對照組LMH-NC細(xì)胞中則未檢測到該融合蛋白表達(dá)。另一方面，利用VIM單克隆抗體進(jìn)行檢測也能發(fā)現(xiàn)LMH-VIM細(xì)胞中VIM的表達(dá)水平顯著高于對照組LMH-NC（圖6B），表明穩(wěn)定過表達(dá)VIM的LMH細(xì)胞系構(gòu)建成功。

2.4過表達(dá)VIM基因的LMH細(xì)胞系對GAstV增殖效率的影響

在過表達(dá)VIM基因的LMH細(xì)胞系（LMH-VIM）中，不論是病毒的mRNA表達(dá)水平抑或蛋白表達(dá)水平，均顯著高于LMH-NC細(xì)胞（ （ Plt;0 . 0 1

圖7、8）。除此之外，收集感染 后的細(xì)胞上清液進(jìn)行病毒 的測定，LMH-VIM細(xì)胞上清液中的病毒滴度顯著高于對照組LMH-NC（ Plt;0 . 0 0 1

圖9）。以上結(jié)果表明，過表達(dá)VIM的LMH細(xì)胞系對GAstV的增殖具有顯著的促進(jìn)作用。

2.5 細(xì)胞表面VIM促進(jìn)GAstV侵入細(xì)胞

當(dāng)利用VIM單克隆抗體阻斷細(xì)胞表面VIM時，GAstV侵入細(xì)胞內(nèi)的效率降低（圖10），其在LMH細(xì)胞中的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降 ，圖11、12）。由以上結(jié)果可知，VIM單克

“ ”“**”分別表示在 Plt;0 . 0 5 和 水平差異顯著 （ t 檢驗）。 “*”and“**” indicate significant differences at P lt; 0 . 0 5 and Plt;0 . 0 1 respectively （t test）.

隆抗體抑制GAstV侵入細(xì)胞具有濃度依賴性；當(dāng)抗體濃度越高，阻止病毒侵入細(xì)胞的作用越顯著（ P lt; 0.05）。以上結(jié)果提示VIM可能是GAstV的輔助受體之一，進(jìn)而影響GAstV的復(fù)制。

3討論與結(jié)論

3.1穩(wěn)定過表達(dá)VIM基因的LMH細(xì)胞株的構(gòu)建

慢病毒基因過表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白細(xì)胞系的方法，該病毒包裝系統(tǒng)的基本原理是將攜帶目的基因的慢病毒載體整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，以實現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞中的持續(xù)表達(dá)[22]，可用于研究某種蛋白的功能及其對病毒復(fù)制的影響；如穩(wěn)定表達(dá)人HDAC6基因的Vero細(xì)胞系的構(gòu)建及其對狂犬病病毒增殖的影響[23]，非洲豬瘟病毒的D1133L蛋白在MA-104細(xì)胞中的穩(wěn)定過表達(dá)[24]，穩(wěn)定過表達(dá)人TMPRSS2基因的BHK細(xì)胞系的構(gòu)建及其對新城疫病毒增殖效果的影響[25]等。

外源目的基因?qū)爰?xì)胞有多種方式，但大部分方法不能將外源基因整合入基因組，且導(dǎo)入的目的基因容易在篩選后的傳代培養(yǎng)過程中丟失和突變；而慢病毒載體可以將攜帶的外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，通過反轉(zhuǎn)錄將目的基因整合到細(xì)胞基因組，并穩(wěn)定表達(dá)，具有操作簡便、擴(kuò)增周期短、轉(zhuǎn)染效率高、能長期穩(wěn)定表達(dá)的特點，且能夠感染分裂和不分裂細(xì)胞，適用于難轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞，在研究中被廣泛使用[2。因此，本研究基于慢病毒基因過表達(dá)系統(tǒng)，利用VIM基因過表達(dá)的重組慢病毒顆粒感染LMH細(xì)胞，通過嘌呤霉素進(jìn)行初步篩選；篩選至第12代時，在顯微鏡下觀察到幾乎所有細(xì)胞均自發(fā)熒光，表明VIM在絕大多數(shù)細(xì)胞中成功過表達(dá)。為明確是否所有細(xì)胞均過表達(dá)VIM基因，本研究通過流式細(xì)胞術(shù)對其進(jìn)行分選，將分選得到的陽性細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行VIM蛋白表達(dá)分析；結(jié)果顯示VIM蛋白成功過表達(dá)，即得到過表達(dá)VIM基因的LMH細(xì)胞系。這為尋找更優(yōu)的GAstV增殖系統(tǒng)提供了研究思路，也為GAstV致病機制的深入研究及抗病毒策略的探索提供了理論基礎(chǔ)。除此之外，在后續(xù)的研究中，可利用該系統(tǒng)將細(xì)胞永生化相關(guān)基因整合至鵝源原代細(xì)胞（如腎細(xì)胞、肝細(xì)胞等）中，以嘗試構(gòu)建鵝源可傳代細(xì)胞系，將為GAstV的高效增殖提供更佳的解決方案。

3.2 VIM對GAstV復(fù)制的影響

VIM是中間絲蛋白家族中廣泛表達(dá)和高度保守的蛋白之一，主要表達(dá)于中胚層來源的細(xì)胞中，廣泛存在于成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫系統(tǒng)細(xì)胞中；其由4個 a - 螺旋片段組成的桿狀蛋白組成，頭部為非螺旋體的氨基端，尾部為羧基端，在熒光顯微鏡下顯示為網(wǎng)狀海綿結(jié)構(gòu)，與微管、微絲一起構(gòu)成細(xì)胞網(wǎng)格[27]。作為骨架蛋白，VIM自身很少引起研究者的關(guān)注，但除了發(fā)揮骨架蛋白應(yīng)有的物理功能外，VIM還參與多種病原體的入侵過程，并在多種病毒的感染過程中發(fā)揮重要作用。Stefanovic等[20]研究發(fā)現(xiàn)，非洲豬瘟病毒感染導(dǎo)致細(xì)胞中VIM重排，在病毒裝配位點的周圍形成“籠狀”結(jié)構(gòu)，并且這一結(jié)構(gòu)的形成與病毒晚期結(jié)構(gòu)蛋白的出現(xiàn)同步，說明病毒晚期蛋白的表達(dá)可能需要VIM的參與。Zheng等[28]對傳染性法氏囊病病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該病毒顯著下調(diào)VIM的表達(dá)水平，并且VIM的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，推測其可能與病毒粒子的釋放有關(guān)。Zhang等[29]研究表明，藍(lán)舌病毒衣殼蛋白VP2與VIM的相互作用可促進(jìn)病毒的釋放。Zhang等[30]研究表明，VIM與豬傳染性胃腸炎病毒的N蛋白存在直接互作，沉默VIM抑制TGEV的釋放。對豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒的研究發(fā)現(xiàn)，VIM是該病毒受體復(fù)合物的組成成分，VIM抗體孵育后的Marc-145細(xì)胞能阻斷病毒侵入[31]。

本研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定過表達(dá)VIM基因的LMH細(xì)胞可顯著促進(jìn)GAstV的mRNA和蛋白表達(dá)水平，并提高細(xì)胞上清液中GAstV的病毒滴度。在此過程中，細(xì)胞表面VIM蛋白在病毒侵入細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要角色，即當(dāng)利用VIM單克隆抗體阻斷細(xì)胞表面VIM蛋白時，顯著抑制GAstV侵入細(xì)胞的效率，但并無法完全阻斷病毒侵入細(xì)胞；這表明VIM并不是GAstV的主要功能性受體，可能是其輔助受體之一，但還需要進(jìn)一步的佐證，譬如進(jìn)行VIM基因的敲除試驗，或在非易感細(xì)胞中進(jìn)行受體重建試驗。另一方面，Xiang等[32]研究發(fā)現(xiàn)，VIM是GAstV結(jié)構(gòu)蛋白VP70的宿主結(jié)合伴侶之一，VIM可通過與VP70相互作用以正向調(diào)節(jié)GAstV的復(fù)制，完整的VIM網(wǎng)格結(jié)構(gòu)及VIM-VP70互作是GAstV高效復(fù)制所必需的；這便揭示了VIM促進(jìn)GAstV復(fù)制的分子機理。同時，本研究也正不斷探索VIM調(diào)控GAstV復(fù)制的深層次原因，以期為GAstV的科學(xué)防控提供新的理論基礎(chǔ)。

3.3結(jié)論

本研究利用慢病毒基因過表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)VIM基因的LMH細(xì)胞系（LMH-VIM），其可顯著促進(jìn)GAstV復(fù)制，提高病毒增殖滴度。本研究初步探究了VIM與GAstV增殖的相關(guān)性，為深入闡明VIM調(diào)控GAstV復(fù)制的分子機制提供了理論基礎(chǔ)，也為GAstV的防控和抗病毒研究提供了潛在的候選靶點。

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