表達副豬格拉瑟菌 GAPDH和OmP26的重組豬霍亂沙門氏菌構建及免疫學評價

中圖分類號：S855.12 文獻標志碼：A 文章編號：1001-411X（2025）03-0319-07

CHENLianlandOmP26ofGlaesserella parasuis[J]. Journal ofSouth China Agricultural University，2025，46（3）： 319-325.

Construction and immunological evaluation of recombinant Salmonella choleraesuis expressing GAPDH and OmP26 of Glaesserella parasuis

CHEN Lixuan，FU Ying， CHEN Zhengquan， LI Lili， ZHANG Weixiao， ZHANG Jianmin

（NationalandRegionalJointEngineeringLaboratoryforMedicamentofZoonosis Preventionand Control/KeyLab for Zoonosis of

Ministryof Agricultureand Rural Affairs/KeyLaboratoryof Animal Vaccine Developmentof Ministryof Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Key Laboratoryof Zoonotic Diseases of Animal Origin/Collge of Veterinary Medicine，South China Agricultural University， Guangzhou ， China）

Abstract： 【Objective】 The objective of this study was to construct a recombinant Salmonella choleraesuis strain co-expressing GAPDH and OmP26， two immunogenic antigens derived from Glaesserella parasuis evaluate its potential as a bivalent vaccine candidate，and provide a novel and eficacious solution for the prevention of both G parasuisand choleraesuis infections in swine populations. 【Method】 GAPDH and O mP2 6 ，which are widely present in variousserotypes of G parasuis，were selectedas exogenous antigens.A recombinant strain of G parasuis-S. choleraesuis， which was capable of expressing both the GAPDH and O mP2 6 ， was constructed by using S . choleraesuis C5ooAasd deletion strain as vector. The biological characteristic and immune effect of the recombinant strain were then investigated. 【Result】Results of PCR and Sanger-sequencing showed that we successfully constructed the recombinant strain C50l （pYA-GAPDHOmP26）， which was able to stably harbor GAPDH and OmP26 （sizes of 1 020 and 798 bp， respectively） . The target fragments were stably amplified from the strain in 1Oo consecutive passages，and the recombinant strain was consistent with the parent strain C5O1（pYA3493） in terms of growth curves and biochemical characteristics. The recombinant strain C501 （pYA-GAPDH-OmP26） showed 6 2 . 5 % and 5 0 . 0 % protection rates against S. choleraesuis C78-1 and G parasuis type 5 strong strain SH0165， respectively， while C501 （pYA3493） showed 5 0 . 0 % protection rate against S. choleraesuis C78-1 and no protection effect against G . parasuis type 5 strong strain SH0165. 【Conclusion】 The recombinant S. choleraesuis C50l （pYA-GAPDH-OmP26） can stably carry heterologous genes. Compared with the parent strain， the recombinant strain has similar biological and good expression characteristics， can induce the organism's combined immune response against G parasuis and S . choleraesuis. The study lays the foundation for the development of the bivalent genetically engineered vaccine for G parasuisandS.choleraesuis.

Key words： Pig; Glaesserella parasuis; Salmonella choleraesuis; C500Aasd deletion strain; GAPDH; OmP26

豬格拉瑟病是由副豬格拉瑟菌Glaesserellaparasuis引起的以豬的多發性漿膜炎、腦膜炎、關節炎、心包炎為特征的細菌性傳染病[1]。G.parasuis可感染斷奶至屠宰任何階段的豬群，并且與多種細菌、病毒、支原體等病原的混合感染廣泛發生，給養豬業帶來嚴重損失[2-3]。G.parasuis具有很強的基因變異性4，目前已知有15種血清型，不同血清型在基因型構成、毒力方面差異較大，這極大地制約了人們對G.parasuis感染的控制[5-7，使得該病成為世界范圍內引起仔豬死亡的重要因素之一。在臨床治療中，抗生素的廣泛使用加速了G.parasuis耐藥性的產生，為該病的防控帶來巨大挑戰。疫苗免疫是G.parasuis防控的主要手段，當前中國市場上的 G . parasuis可用商品化疫苗主要是本地分離株滅活苗類。但滅活苗的保護效果有限，不同血清型之間缺少交叉保護作用[8]，而不同豬群流行的 G . parasuis血清型可能不同，甚至同一頭病豬的不同部位也可能存在不止一種血清型[9]。因此，研究具有交叉保護力的新型疫苗成為G.parasuis防控研究的重點[10]。

磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）是廣泛存在于真核生物以及原核生物中的一種酶，可與免疫細胞表面的受體結合激活相關信號通路。研究發現，GAPDH是 G parasuis的新型免疫原[]，Fu等[12]通過基因測序與生物信息學分析發現，GAPDH廣泛存在于各種血清型的G.parasuis中并且高度保守。但GAPDH作為G.parasuis普遍存在的免疫原性蛋白，卻較少有針對該蛋白重組疫苗株的研究。外膜蛋白（Outermembraneproteins，OMPs）是細菌表面重要的抗原成分，能夠參與決定宿主的特異性免疫應答。有學者發現在針對G.parasuis的免疫應答中存在OMPs的抗體，但沒有脂多糖等成分的抗體，這表明OMPs比該生物體其他成分或許更具有免疫原性[13]。多個團隊的研究者[14-16]從G.parasuis基因組中篩選出不同的OMPs作為潛在毒力相關因素，并證實其在豚鼠、小鼠模型中對致死量G.parasuis的攻擊具有顯著的保護作用。已有研究[1顯示，編碼G.parasuisGAPDH 和 O m P2 6 蛋白的基因在G.parasuis不同血清型菌株中普遍存在，且能夠介導免疫反應，這意味著它們有可能成為廣譜的免疫原。

理想的疫苗載體應具備多種優良特性，包括安全性、免疫原性等。趙戰勤等[18]通過基因工程方法構建豬霍亂沙門氏菌Salmonellacholeraesuisasd缺失株C5004asd，并證明該缺失株相較親本菌株C500毒力降低；同時具有良好的生長特性、穩定的遺傳背景及高效的表達能力。隨后，徐引弟等[19]和趙戰勤等[20]對C5004asd缺失株展開更進一步研究，證實在C5004asd缺失株中插入不同外源抗原如支氣管敗血波氏桿菌免疫原性基因、巴氏桿菌毒素基因后重組菌株仍具有良好的遺傳穩定性，并高效表達外源抗原，將重組菌株通過口服免疫小鼠和仔豬，外源抗原有良好的表達活性，且接種動物無任何不良反應。上述研究成果表明，C5004asd缺失株是構建重組菌株的有力候選載體。

因此，本研究選擇GAPDH基因和OmP26基因作為免疫原性基因，將上述基因同時導入S.choleraesuisC500Aasd缺失株，以求構建能夠高效表達G.parasuis免疫基因，同時能有效刺激機體產生針對S.choleraesuis特異性免疫保護作用的重組菌株，并對其基本生物學特性及免疫效果進行評估；旨在探索一種更為有效的豬格拉瑟病防控策略，同時為G.parasuis和S.choleraesuis混合感染的防控提供新的思路和方法，以應對這2種疾病給養豬業帶來的挑戰。

1材料與方法

1.1 主要試劑和試驗動物

S.choleraesuisC500弱毒疫苗株的asd基因缺失株、大腸埃希菌Escherichiacoli x6 0 9 7 及無抗性原核表達質粒pYA3493由華南農業大學動物傳染病教研室保存；限制性內切酶EcoRI+SalI、SalI+HindIII等各種內切酶購自NewEnglandBiolabs公司；T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；His標簽蛋白純化試劑盒（P2226）購自碧云天公司；4周齡雌性BALB/c小鼠購自廣東省實驗動物中心。

1.2 引物設計和基因克隆

參考Genebank中G.parasuis血清5型SH02165菌株的膜蛋白基因GAPDH（GenBank ID：72 785 966）和外膜蛋白基因OmP26（GenBank ID：219691637）的序列，利用Primer5.1設計引物（GAPDH-F：CGGAATTCATGGCAATTAAAATTG，GAPDH-R：GCGTCGACTTAGCCTTTGTAGTTG;OmP26-F：GCGTCGACATGAAAAATTTATTTAAACTTGC，OmP26-R：CCAAGCTTTTATTTTTTCACTTCTTCTGG），并以G.parasuisSH02165菌株的基因組為模板擴增引物。

1.3 重組質粒的構建

分別利用限制性內切酶 E c o R I + S a l I ， S a l I + HindIII對“1.2”回收獲得的基因片段GAPDH、OmP26進行雙酶切，原核表達質粒pYA3493使用對應限制性內切酶進行雙酶切，然后經瓊脂糖凝膠電泳回收GAPDH、OmP26基因片段與相應的線性質粒pYA3493，以T4DNA連接酶進行連接。將質粒轉入 x6 0 9 7 ，涂布在無抗性培養基上，挑取單菌落，在LB液體培養基中于 培養 后進行質粒小提，以酶切鑒定方法獲取陽性克隆pYA-GAPDH和pYA-OmP26。用 雙酶切基因片段OmP26與 載體，回收、純化、連接后轉入 x6 0 9 7 ，重復上述步驟，獲得pYA-GAPDH-OmP26質粒，并將其送至上海生工生物工程有限公司進行測序鑒定。

1.4 重組菌株的構建

將重組質粒pYA-GAPDH、pYA-OmP26和pYA-GAPDH-OmP26電轉入C501，完成電擊后迅速加入 預熱培養基，并將菌液轉移到無菌管中；于 震蕩1h培養后離心收集菌體，重懸于單純培養基并涂布于LB平血表面。使用目的基因引物對平血表面生長的菌落進行擴增鑒定。

1.5 重組菌株的遺傳與生長穩定性

重組菌株 C5 0 1 （ p Y A-G A P D H ） . C501（pYA-OmP26及 C5 0 1 （ p Y A -G A P D H -O m P 2 6 ） 在無抗性LB液體培養基中連續傳代培養，每25代進行PCR鑒定，測定其遺傳特性。于 條件下培養重組菌株，每隔 測定 ，以菌液培養時間為橫坐標，菌液 為縱坐標繪制重組菌株的生長曲線。

1.6 重組菌株的生化特性與表達特性

將重組菌株C501（pYA-GAPDH）、C501（pYA-OmP26及 C5 0 1 （ p Y A -G A P D H -O m P 2 6 ） 培養于無抗性LB液體培養基中，轉接至以阿拉伯糖、乳糖、棉子糖、山梨醇、淀粉、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、鼠李糖和麥芽糖等為唯一碳源的細菌微量生化鑒定管進行生化試驗。對重組菌株全菌裂解物進行Western-Blot鑒定。

1.7 重組菌株C501（pYA-GAPDH-0mP26）對小 鼠的免疫試驗

選取40只4周齡雌性BALB/c小鼠，分3組：C501（pYA-GAPDH-OmP26）組（20只小鼠）、C501（pYA3493）組（10只小鼠）PBS陰性對照組（10只小鼠），按每只 劑量皮下多點位注射。首次免疫后第14天進行加強免疫，操作程序同首次免疫。加強免疫14d后各組分別按照每只 劑量腹腔攻毒 G parasuis5型強毒株SH0165和每只 劑量灌胃攻毒S.choleraesuis強毒株C78-1，各小組中2種菌株攻毒相同數量小鼠，連續觀察 1 4 d ，記錄發病及死亡情況。

2結果與分析

2.1 重組菌株的構建

目的基因GAPDH和OmP26擴增結果分別為1020、798bp，與預期片段長度一致，測序結果正確（圖1）。重組質粒pYA-GAPDH、pYA-OmP26酶切鑒定均能成功擴增出約3000bp的外源基因片段（圖2）。pYA-GAPDH、pYA-OmP26和pYA-GAPDH-OmP26測序結果均符合預期。重組菌株C501（pYA-GAPDH）、C501（pYA-OmP26）及C501（pYA-GAPDH-OmP26）用GAPDH、OmP26引物擴增，測序結果與目的外源基因一致。

2.2 重組菌株遺傳與生長穩定性

重組菌株C501（pYA-GAPDH）、C501（pYA-

OmP26）及C501（pYA-GAPDH-OmP26）連續傳代100代，每25代進行1次PCR鑒定，結果顯示，不同代次均能擴增出外源基因條帶（圖3），表明重組質粒pYA-GAPDH、pYA-OmP26 和pYA-GAPDH-OmP26均能在宿主菌菌株C501中穩定遺傳。重組菌株的生長曲線與對照菌株C501（pYA3493）非常接近 （圖4），表明外源基因基本不影響宿主菌株生長趨勢。

2.3 重組菌株生化特性

重組菌株C501（pYA-GAPDH）、C501（pYA-OmP26）及C501（pYA-GAPDH-OmP26）與對照菌株C501（pYA3493）均不能利用阿拉伯糖、乳糖、棉子糖、山梨醇、淀粉和半乳糖，但可以利用葡萄糖、甘露醇、果糖、麥芽糖和鼠李糖（表1），表明外源片段引入不影響Salmonella自身的生化特性。

M：DNAMarker;1＼～4：C501（pYA-GAPH）25、5075、10代；6-9：C50（pYA-OmP26）25、50、75、100代;＼～14：C501（pYA-GAPDH-OmP262550、75、100代;5、10：pYA3493。M：DNAMark：，ras;：5，：OmP26）25，50，75，100 generations;5，10：pYA3493.

2.4 重組菌株表達特性

重組菌株C501（pYA-GAPDH）、C501（pYA-OmP26）全菌裂解物Western-Blot結果顯示，與空質粒對照相比，重組疫苗菌株能夠正確表達外源蛋白，蛋白相對分子質量分別為37400、37000（圖5）。

2.5免疫小鼠攻毒保護試驗

C501（pYA-GAPDH-OmP26）組免疫小鼠對S.choleraesuis強毒株C78-1攻毒的保護率為 6 2 . 5 % 對G.parasuis5型強毒株SH0165攻毒的保護率為5 0 . 0 % ;C501（pYA3493）組、PBS對照組對 G parasuis5型強毒株SH0165攻毒的保護率均為0（圖6）。

Fig.5Western-Blotanalysis ofrecombinant strains

3討論與結論

3.1 討論

接種疫苗是預防豬格拉瑟病的有效措施。但現有的商業疫苗對異源菌株的交叉保護作用有限，不能提供廣泛的異源保護[21]。如基于血清型2和5組合、血清型1和6組合的市售疫苗，對其他血清型甚至同一血清型不同菌株的保護力常常無法達到預期[22]。因此，研發對不同血清型具有交叉保護作用的新型疫苗對該病的防治具有重要意義。諸多研究表明，S.choleraesuisC500Aasd缺失株作為活疫苗載體能夠同時表達多種不同病原的抗原，且具有極高的安全性和可行性，作為胞內侵襲細菌，Salmonella能夠有效遞呈抗原，激發機體產生抗Salmonella免疫反應，同時誘導產生針對外源基因的特異性細胞免疫和體液免疫[23-24]。S.choleraesuisC5004asd缺失株導入含asd質粒后才能在無外源二氨基庚二酸條件下存活，這使得質粒攜帶的外源基因不易丟失，同時避免Salmonella過度繁殖[25-26]。本研究選取的外源抗原 是 G parasuis的外膜蛋白，本身具有良好的免疫活性；GAPDH作為G.parasuis多種血清型普遍存在的蛋白，具有免疫調節功能。將二者結合同時克隆，可增加機體可識別的抗原位點，從而提高機體免疫應答的效率。同時，GAPDH和 O mP2 6 二者同時表達可能存在協同刺激免疫系統的效果，產生更強的免疫反應。此外，同時包含GAPDH和OmP26基因的表達載體對于血清型眾多的G.parasuis而言，能夠提供更廣泛的保護。

基于此，本研究從G.parasuis中篩選出具有良好免疫效應的蛋白GAPDH、OmP26，將其同時插入S.choleraesuisC5o0Aasd缺失株，成功構建二聯基因工程弱毒株C501（pYA-GAPDH-OmP26）。試驗結果顯示，C501（pYA-GAPDH-OmP26）能穩定攜帶、表達外源基因，并與對照菌株C501（pYA3493）具有相近的生物學特性，表明外源片段的插入基本不影響宿主菌株的生長與代謝。通過皮下注射C501（pYA-GAPDH-OmP26免疫的小鼠對致死劑量的G.parasuis強毒株表現出 5 0 . 0 % 的保護率，與對照組C501（pYA3493）組、PBS組（保護率為0）均存在明顯差異。同時，C501（pYA-GAPDH-OmP26）、C501（pYA3493）對 S . choleraesuisC78-1的保護率分別為 6 2 . 5 % 7 5 0 . 0 % ，說明外源GAPDH和OmP26抗原的表達沒有降低 缺失株針對Salmonella感染的免疫保護力。但該重組菌株在小鼠與在豬體內引發的免疫反應可能存在差異，目前針對 G ：parasuis重組疫苗菌株的研究也大都在小鼠試驗模型上進行，少有在豬模型上檢驗[27]。在后續研究中，有必要在本體動物仔豬動物模型中進一步評估該重組菌株的免疫效力。

3.2結論

本研究選取G.parasuis的GAPDH和OmP26為外源性抗原并成功研制G.parasuis-S.choleraesuis二聯基因工程弱毒株C501（pYA-GAPDH-OmP26），與空質粒組C501（pYA3493）相比，該重組菌株對G.parasuis5型強毒株SH0165的保護效果更好且存在明顯差異，同時保留了對S.choleraesuisC78-1的高效保護，為進一步研發G.parasuis新型疫苗提供了參考。

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