廣西豬流產胎兒溶血葡萄球菌的分離鑒定及其16S rDNA基因系統進化分析

盧冰霞，周英寧，段群棚，何 穎，陳忠偉，梁家幸，秦毅斌，許心婷，全琛宇，趙 碩，趙 武

（廣西壯族自治區獸醫研究所/廣西獸醫生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530001）

葡萄球菌是革蘭氏陽性菌，分布于自然界、人及動物的體表。人體和動物體表面的葡萄球菌絕大數是沒有致病性的常在菌，少部分則對人或動物有不同程度的致病性，是一種具有重要公共衛生學意義的人畜共患病病原[1]。自發現葡萄球菌以來，凝固酶陽性葡萄球菌（Coagulase positive staphylococci, CPS）被認為是致病菌，而凝固酶陰性葡萄球菌（Coagulase negative staphylococci,CNS）一直被認為是動物和人體內、皮膚的共棲菌，沒有致病性。而直至20世紀70年代，研究明確CNS能夠引發人及牛、豬等多種動物的各種感染，如敗血癥、心內膜炎、乳腺炎、尿路炎癥、子宮內膜炎、骨關節疾病等[2]。

臨床常見CNS就有溶血葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌等[3]。趙華等[4]對醫院新生兒科2016—2018年發生的315例新生兒多重耐藥菌感染的細菌監測結果進行分析，革蘭氏陽性菌占22.2%，其中溶血葡萄球菌占到5.1%。尚翠玲等[5]從病豬的腎臟中分離鑒定出1株豬源γ-溶血葡萄球菌，將分離到的豬源γ-溶血葡萄球菌純培養后接種小鼠，小鼠出現行動遲緩、群聚扎堆等臨床癥狀，并從小鼠體內分離出相同形態特征和菌體特征的菌株，證明了豬源溶血葡萄球菌的存在及其致病性。

本研究從豬流產胎兒體內分離到一株革蘭氏陽性球菌，鏡檢疑似為葡萄球菌，純培養后通過PCR的方法擴增其16S rDNA并測序，通過序列分析和構建系統進化樹最終從分子水平上證實該菌株為CNS溶血葡萄球菌，同時進行了藥敏試驗，研究結果為病例診斷及臨床用藥提供了參考。

1 材料

1.1 試驗時間與地點

試驗于2020年7月6日至10月28日在廣西壯族自治區獸醫研究所進行。

1.2 病料

豬流產胎兒1頭，由廣西某豬場送往廣西壯族自治區獸醫研究所/廣西獸醫生物技術重點實驗室進行病原檢測。

1.3 主要試劑

細菌DNA快速抽提試劑盒為Axygen生物科技有限公司產品；2xF8 Fastlong PCR MasterMix為北京艾德萊生物科技公司產品；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）為北京陸橋公司產品；DL 2 000 DNA Marker為Takala公司產品。

1.4 引物

16S rDNA引物為細菌性檢測通用引物27F和1492R，詳細引物序列信息見表1。以上引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.5 試驗動物

6只20 g左右BALB/c小鼠購自廣西醫科大學實驗動物中心。

2 方法

2.1 細菌分離及藥敏試驗

用無菌接種環從豬流產胎兒腦、腎臟、脾臟、肺臟和腸系膜淋巴結取樣無菌接種到TSA平板，放在37 ℃恒溫箱中培養24 h后，觀察細菌生長情況。用接種環挑取菌落進行涂片，革蘭氏染色，在顯微鏡油鏡下觀察細菌形態。純化后的細菌再接種到鮮血瓊脂平板培養基上觀察是否有溶血現象產生。

采用K-B涂布法測定分離菌株對常見藥物的敏感性。

2.2 分離菌生化試驗

將純化后的分離菌做蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、木糖、果糖、硫化氫（H2S）、甘露糖、脲酶、硝酸鹽還原、精氨酸雙水解酶、V-P和堿性磷酸酶等生化試驗。

2.3 分離菌16S rDNA擴增

以分離菌的DNA作為模板，用通用引物27F和1492R擴增分離菌的16S rDNA基因片段，擴增目的片段長度。采用25 μL PCR反應體系：2xF8 Fastlong PCR MasterMix 12.5 μL，25 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，滅菌水8.5 μL，模板3.0 μL。反應程序為：94 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，30 個循環；72 ℃ 10 min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察結果。對檢測出目的條帶的PCR產物進行純化，然后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

2.4 分離菌同源性分析及系統進化樹的構建

分離菌16S rDNA測序結果拼接后，通過NCBI/BLAST進行序列比。利用MegAlign軟件進行序列同源性分析，并運用MEGA-X軟件采用Maximum Likelihood法構建系統進化樹，確定其屬種。

2.5 分離菌致病性試驗

將6只BALB/c小鼠隨機分成試驗組與對照組，每組3只。將分離菌接種于TSB液體培養基中，37 ℃ 培養24 h后調節菌液濃度與0.5麥氏比濁管相當。試驗組小鼠腹腔注射調節好濃度的菌液100 μL/只，對照組小鼠腹腔注射等體積滅菌生理鹽水，觀察分離菌對小鼠的致病性。

3 結果

3.1 細菌分離培養、鏡檢和藥敏試驗結果

從豬流產胎兒的腦、肝臟、肺臟、腎臟和脾臟中均分離培養出濕潤、表面光滑、隆起的檸檬黃色圓形小菌落（圖1），在血平板上不溶血。挑取單個菌落涂片革蘭氏染色鏡檢，結果均呈革蘭氏染色陽性，顯微鏡下可見菌體呈藍紫色、單個、成對、短鏈狀或者不規則排列聚集呈葡萄串狀分布的革蘭氏陽性球菌（圖2）。藥敏試驗結果顯示，分離培養出的菌株僅對新生霉素、利福平和米諾環素敏感，對青霉素類、頭孢類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類藥物嚴重耐藥（表2）。

圖1 分離菌在TSA平板上的菌落形態

圖2 分離菌在油鏡下的菌體形態

表2 分離菌藥敏試驗結果

3.2 分離菌生化試驗結果

該分離菌株能發酵蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、果糖，不能發酵木糖、甘露糖；不產生H2S和脲酶；硝酸鹽還原、精氨酸雙水解酶、V-P反應呈陽性，堿性磷酸酶反應呈陰性。鑒定結果基本符合《常見細菌系統鑒定手冊》中溶血葡萄球菌的生化特性。

3.3 分離菌16S rDNA擴增結果

分離菌16S rDNA擴增結果顯示，該豬流產胎兒內臟組織分離培養出的細菌能擴增出大小約1 500 bp的目的片段（圖3）。

圖3 分離菌16S rDNA擴增結果

3.4 分離菌同源性分析及系統進化樹的構建

將該分離菌16S rDNA測序結果在NCBI里進行BLAST，并利用MegAlign軟件進行序列同源性分析，結果顯示該分離菌16S rDNA擴增產物測序所得的核苷酸序列與NCBI上登錄的不同來源的12株溶血葡萄球菌同源性在99.8%～99.9%之間（圖4）。利用MEGA-X軟件構建遺傳進化樹，結果顯示，該分離菌與12株溶血葡萄球菌親緣關系最近，在同一大分支上（圖5）。從分子水平上證明該分離菌為溶血葡萄球菌，并將其命名為2925。

圖4 分離菌同源性分析結果

圖5 分離菌系統進化樹的構建

3.5 分離菌致病性試驗結果

試驗組3只BALB/c小鼠接種分離菌菌液24 h后出現行動遲緩、扎堆和被毛燥亂等癥狀。剖檢后可觀察到腹腔積液，組織器官未見明顯的可見病變。用TSA平板對試驗組BALB/c小鼠內臟（包括肝臟、腎臟、脾臟、肺臟和腦）進行細菌分離，結果在腎臟中分離培養出濕潤、表面光滑、隆起的檸檬黃色圓形小菌落，呈革蘭氏染色陽性球菌，在顯微油鏡下其菌落形態和菌體特征與豬流產胎兒分離到的菌株一致。對照組BALB/c小鼠無明顯可見臨床癥狀，未能從其組織器官中分離到任何細菌。

4 討論與小結

本試驗從送檢母豬流產胎兒體內分離出一株無溶血活性的革蘭氏陽性球菌，擴增分離菌株的16S rDNA基因后，經同源性分析發現分離菌株與12株不同來源的溶血葡萄球菌的同源性在99.8%～99.9%之間；與葡萄球菌屬中的巴氏葡萄球菌同源性為98.6%，與腐生葡萄球菌同源性為98.7%，與沃氏葡萄球菌同源性為98.2%，與金黃色葡萄球菌同源性為98.2%，與表皮溶血葡萄球菌同源性為98.2%，與海豚葡萄球菌同源性最低為97.6%。構建的系統進化樹結果顯示，該分離菌株與溶血葡萄球菌在同一大分支上，其中與溶血葡萄球菌菌株MER TA39（KT719446.1）遺傳進化距離最近，因此從分子水平上證實該分離菌株為溶血葡萄球菌。綜合分離菌菌株生物學特性、同源性分析和構建的系統進化樹結果，最終鑒定該分離菌菌株為CNS γ-溶血葡萄球菌。

豬葡萄球菌較易產生耐藥性，傳統養豬生產中濫用抗生素的現象十分普遍，長期在飼料中添加抗生素或者首選廣譜抗生素等都易使病原菌產生耐藥性[6-7]。藥敏試驗結果顯示，分離的豬源溶血葡萄球菌對27種檢測藥物中的青霉素類、頭孢類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類藥物嚴重耐藥，且呈多重耐藥，僅對新生霉素、利福霉素和米諾環素敏感。臨床病例治療應根據藥敏試驗結果給藥，交替使用敏感藥物或者聯合用藥，防止或減少病原耐藥性的產生以達到理想的治療效果。

CNS絕大數是沒有致病性的常在菌，一般很少引起組織感染。這些病原菌的潛在致病力取決于它們的毒力、逃避宿主免疫系統的能力和耐藥機制。近年來，引起感染的CNS一般普遍具有多重耐藥性[4-5]。現有研究鮮有報道從豬流產胎兒中分離到溶血葡萄球菌，本研究從豬流產胎兒的多個內臟器官中菌分離到CNS γ-溶血葡萄球菌，其是否為引起母豬流產的主要因素還需進一步研究。總之，本研究分離到的CNS γ-溶血葡萄球菌具有較嚴重的多重耐藥性，提示臨床治療合理地使用藥物進行治療是防控這類疾病的重要手段。