鳶尾素調(diào)控EBF3/ALOX15通路影響肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移

摘要：目的 探討鳶尾素對(duì)早期B細(xì)胞因子3（EBF3）/花生四烯酸-15-脂加氧酶（ALOX15）通路的調(diào)控作用及肺腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。方法 將A549細(xì)胞分為鳶尾素溶劑組、鳶尾素組、sh-NC組、EBF3抑制劑（sh-EBF3）組、鳶尾素+sh-NC組、鳶尾素+sh-EBF3組。5-溴-2-脫氧尿嘧啶（EdU）染色、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞劃痕愈合率；2′，7′-二氯熒光二乙酸酯（DCFH-DA）染色檢測(cè)細(xì)胞中活性氧（ROS）水平；比色法檢測(cè)細(xì)胞中谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、細(xì)胞亞鐵（Fe2+）水平；透射電鏡觀察A549細(xì)胞中線粒體形態(tài)；qRT-PCR檢測(cè)A549細(xì)胞中增殖性細(xì)胞核抗原（PCNA）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、谷胱甘肽過氧化酶4（GPX4）mRNA水平；Western blot檢測(cè)細(xì)胞中EBF3、ALOX15蛋白。結(jié)果 與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組A549細(xì)胞線粒體呈現(xiàn)出鐵死亡特征，EdU陽性率、OD450值、劃痕愈合率、GSH水平、PCNA、MMP-2、GPX4 mRNA水平降低，ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度、MDA、Fe2+水平及EBF3、ALOX15蛋白升高（P＜0.05）；與sh-NC組比較，sh-EBF3組A549細(xì)胞線粒體呈現(xiàn)出鐵死亡現(xiàn)象有所減弱，EdU陽性率、OD450值、劃痕愈合率、GSH水平、PCNA、MMP-2、GPX4 mRNA水平升高，ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度、MDA、Fe2+水平及EBF3、ALOX15蛋白降低（P＜0.05）；sh-EBF3逆轉(zhuǎn)了鳶尾素對(duì)A549細(xì)胞鐵死亡、增殖與遷移的影響。結(jié)論 鳶尾素可能通過激活EBF3/ALOX15通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞鐵死亡，抑制細(xì)胞增殖與遷移。

關(guān)鍵詞：肺腺癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；鐵死亡；鳶尾素；早期B細(xì)胞因子3/花生四烯酸-15-脂加氧酶通路

中圖分類號(hào)：R734.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20242182

肺腺癌約占所有肺癌的50%，晚期肺腺癌患者預(yù)后較差，平均5年生存率僅為15%［1-2］。目前肺腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方式包括手術(shù)切除、放療、化療、靶向治療和免疫治療［3］。雖然這些治療方式能夠在一定程度上緩解肺腺癌的進(jìn)展，但復(fù)發(fā)、化療耐藥性以及不良反應(yīng)的發(fā)生影響了肺腺癌的療效［4-6］。因此，尋找有效的肺腺癌治療策略勢(shì)在必行。鳶尾素是運(yùn)動(dòng)過程中骨骼肌分泌的一種激素，具有降低快速分裂細(xì)胞的活力和抑制遷移的作用［7-8］。但具體機(jī)制尚不完全明確。激活早期B細(xì)胞因子3（EBF3）/花生四烯酸-15-脂加氧酶（ALOX15）通路介導(dǎo)的鐵死亡可抑制急性髓系白血病細(xì)胞生長(zhǎng)［9］；ALOX15過表達(dá)可誘導(dǎo)鐵死亡，進(jìn)而降低非小細(xì)胞肺癌的順鉑耐藥性［10］。但鳶尾素能否通過調(diào)控EBF3/ALOX15通路影響肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和鐵死亡尚不清楚。基于此，本實(shí)驗(yàn)主要探究鳶尾素對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和鐵死亡的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞購(gòu)自通派生物公司。鳶尾素（溶于PBS中，上海源葉生物公司）；EBF3抑制劑EBF3小干擾RNA（sh-EBF3，序列5′-GGUUGACAAGGUCUA GCUA-3′ ） 及其陰性對(duì)照sh-NC（ 序列5′-UGGAGAUUGAAAGGACCGCU-3′）、Lipofectamine? 3000 轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑（賽默飛世爾科技公司）；5-溴-2-脫氧尿嘧啶（EdU）染色試劑盒（上海東寰生物科技有限公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；2′，7′-二氯熒光二乙酸酯（DCFH-DA，美國(guó)MCE 公司）；谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、細(xì)胞亞鐵（Fe2+）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物有限公司）；TOYOBO逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海松雷生物科技有限公司）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊生物科技股份有限公司）；RIPA裂解緩沖液（北京百奧萊博科技有限公司）；BCA 試劑盒、ECL 試劑盒（翌圣生物科技股份有限公司）；兔源一抗EBF3、GAPDH、ALOX15及羊抗兔二抗（英國(guó)Abcam公司）。BX41-32P02熒光顯微鏡、CX53光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；ST-360酶標(biāo)儀（上海科華儀器廠）；TalosF200S透射電子顯微鏡（上海瓦克儀器有限公司）；Q5熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；DYCZ-24B蛋白電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及處理 A549細(xì)胞分為鳶尾素溶劑組、鳶尾素組、sh-NC 組、sh-EBF3 組、鳶尾素+sh-NC 組、鳶尾素+sh-EBF3組。鳶尾素溶劑組A549細(xì)胞用PBS溶液處理24 h；鳶尾素組［8］A549細(xì)胞用20 nmol/L鳶尾素處理24 h；sh-NC組、sh-EBF3組A549細(xì)胞分別利用Lipofectamine? 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染sh-NC、sh-EBF3 24 h；鳶尾素+sh-NC組A549細(xì)胞用20 nmol/L鳶尾素處理24 h的同時(shí)轉(zhuǎn)染sh-NC 24 h；鳶尾素+ sh-EBF3組A549細(xì)胞用20 nmol/L鳶尾素處理24 h的同時(shí)轉(zhuǎn)染sh-EBF3 24 h。處理結(jié)束后用于各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 EdU染色檢測(cè)A549細(xì)胞增殖 將各組A549細(xì)胞以相同的密度接種于12孔板，次日向各孔加EdU工作液并孵育2 h。細(xì)胞經(jīng)固定和DAPI染色后觀察并統(tǒng)計(jì)EdU陽性率。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)A549細(xì)胞增殖 將A549細(xì)胞接種在96孔板中，每孔3 000個(gè)細(xì)胞，按照1.2.1 所述進(jìn)行對(duì)應(yīng)處理后，向各孔加入10 μL CCK-8 試劑并培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的光密度（OD）值。

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞遷移 將各組A549細(xì)胞（1×105個(gè)細(xì)胞）接種在12孔板中，并在含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至達(dá)到95%融合度。再將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓6 h。使用無菌的200 μL移液器吸頭在細(xì)胞層上劃痕，在0、24 h拍攝細(xì)胞劃痕愈合的照片，并計(jì)算劃痕愈合率［（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%］。

1.2.5 A549細(xì)胞中活性氧（ROS）水平檢測(cè) 將各組A549細(xì)胞在PBS中勻漿，然后與10 μmol/L DCFH-DA在37 ℃下孵育30 min。使用激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為488/525 nm的熒光光譜儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.2.6 比色法檢測(cè)A549細(xì)胞中MDA、GSH、Fe2+水平 根據(jù)試劑盒說明檢測(cè)各組A549細(xì)胞中MDA、GSH、Fe2+水平。

1.2.7 透射電鏡觀察A549細(xì)胞中線粒體形態(tài) 將各組A549細(xì)胞用含有2.5%戊二醛的PBS溶液固定在6 cm培養(yǎng)皿中24 h。PBS洗滌后，用含有1%鋨酸的PBS固定細(xì)胞，PBS洗滌后，細(xì)胞脫水包埋，60 ℃烤箱孵育48 h。制備超薄切片，用檸檬酸鉛和醋酸鈾酰染色。干燥過夜后，用透射電鏡獲取切片圖像。

1.2.8 A549細(xì)胞中增殖性細(xì)胞核抗原（PCNA）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、谷胱甘肽過氧化酶4（GPX4）mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 使用TRIzol試劑提取A549細(xì)胞的總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCR預(yù)混液在Q5熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量檢測(cè)，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火/延伸40 s，共42個(gè)循環(huán)。通過將PCNA、MMP-2、GPX4的表達(dá)歸一化為GAPDH來確定基因相對(duì)表達(dá)水平。引物序列： PCNA 正向5′-TTACCATAGAGATGAATGAACCA-3′， 反向5′-AGTGTCACCGTTGAAGAG-3′；MMP-2正向5′?CTAATCAGCATTCTCACT-3′，反向5′－AGTCAGC ATCTATTCTTG－3′；GPX4正向5′-TTCAGCATAAGACAAAGCTCCA-3′， 反向5′-GAGGCAAGACCGAAGTAAACTAC-3′； GAPDH 正向5′?ATGGGTGTGAACCACGAGA-3′，反向：5′?CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3′。

1.2.9 A549細(xì)胞中EBF3、ALOX15蛋白的檢測(cè) RIPA裂解緩沖液用于從各組A549細(xì)胞中提取總蛋白。BCA法用于定量樣品中的蛋白質(zhì)濃度。通過10% SDS-PAGE分離40 μg蛋白質(zhì)樣品，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜1 h后，將膜與一抗EBF3（1∶3 000）、GAPDH（1∶6 000）、ALOX15（1∶5 000）在4 ℃下孵育過夜。次日，再與二抗（1∶4 000）在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑對(duì)蛋白信號(hào)進(jìn)行可視化。Image J軟件用于蛋白質(zhì)的定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad prism 9進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鳶尾素對(duì)A549 細(xì)胞增殖的影響 與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組A549 細(xì)胞EdU 陽性率、OD450值降低（P＜0.05）；與sh-NC組比較，sh-EBF3組A549細(xì)胞EdU陽性率、OD450 值升高（P＜0.05）；與鳶尾素+sh-NC 組比較，鳶尾素+sh-EBF3 組A549 細(xì)胞EdU 陽性率、OD450 值升高（P＜0.05），見圖1、表1。

2.2 鳶尾素對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響 與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組A549細(xì)胞劃痕愈合率降低（P＜0.05）；與sh-NC組比較，sh-EBF3組A549細(xì)胞劃痕愈合率升高（P＜0.05）；與鳶尾素+sh-NC組比較，鳶尾素+sh-EBF3 組A549 細(xì)胞劃痕愈合率升高（P＜0.05），見表1、圖2。

2.3 鳶尾素對(duì)A549細(xì)胞氧化應(yīng)激及Fe2+水平的影響 與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組A549細(xì)胞中ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度、MDA、Fe2+水平升高，GSH水平降低（P＜0.05）；與sh-NC組比較，sh-EBF3組A549細(xì)胞中ROS 相對(duì)熒光強(qiáng)度、MDA、Fe2+水平降低，GSH水平升高（P＜0.05）；與鳶尾素+sh-NC組比較，鳶尾素+sh-EBF3 組A549 細(xì)胞中ROS 相對(duì)熒光強(qiáng)度、MDA、Fe2+水平降低，GSH水平升高（P＜0.05），見圖3、表2。

2.4 鳶尾素對(duì)A549細(xì)胞中線粒體形態(tài)的影響 鳶尾素溶劑組A549細(xì)胞線粒體形態(tài)無明顯變化；與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組A549細(xì)胞線粒體呈現(xiàn)出鐵死亡特征，表現(xiàn)為線粒體體積變小，膜密度升高，嵴減少以及外膜破裂；與sh-NC組比較，sh-EBF3組A549細(xì)胞線粒體呈現(xiàn)出鐵死亡現(xiàn)象有所減弱；與鳶尾素+sh-NC組比較，鳶尾素+sh-EBF3組A549細(xì)胞線粒體呈現(xiàn)出鐵死亡程度有所減輕，見圖4。

2.5 鳶尾素對(duì)A549細(xì)胞增殖、遷移、鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)水平的影響 與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組A549細(xì)胞中PCNA、MMP-2、GPX4 mRNA水平降低（P＜0.05）；與sh-NC組比較，sh-EBF3組A549細(xì)胞中PCNA、MMP-2、GPX4 mRNA 水平升高（P＜0.05）；與鳶尾素+sh-NC組比較，鳶尾素+sh-EBF3組A549細(xì)胞中PCNA、MMP-2、GPX4 mRNA水平升高（P＜0.05），見表3。

2.6 鳶尾素對(duì)A549細(xì)胞中EBF3/ALOX15通路蛋白表達(dá)的影響 與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組A549細(xì)胞中EBF3、ALOX15 蛋白升高（P＜0.05）；與sh-NC組比較，sh-EBF3組A549細(xì)胞中EBF3、ALOX15蛋白降低（P＜0.05）；與鳶尾素+sh-NC組比較，鳶尾素+sh-EBF3組A549細(xì)胞中EBF3、ALOX15蛋白降低（P＜0.05），見圖5、表4。

3 討論

肺腺癌在所有肺癌中死亡率最高［11］。肺腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移仍然是有效治療肺腺癌的障礙［12］。鳶尾素是一種新型肌因子，在包括腫瘤等多種疾病的治療中發(fā)揮著重要的作用［13］。據(jù)報(bào)道，結(jié)直腸癌患者的血清鳶尾素平均水平顯著低于健康志愿者［14］；高水平的鳶尾素有助于抑制胃癌細(xì)胞的遷移［15］；鳶尾素可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)［16］。本研究顯示，與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組EdU陽性率、OD450 值、劃痕愈合率降低，表明鳶尾素可抑制A549細(xì)胞增殖與遷移。PCNA是人體DNA代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可有效促進(jìn)細(xì)胞增殖［17］；MMP-2可引起細(xì)胞外基質(zhì)的降解，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力［18］。本研究鳶尾素組A549細(xì)胞中PCNA、MMP-2mRNA水平低于鳶尾素溶劑組，再次從分子水平上證明了鳶尾素對(duì)A549細(xì)胞增殖與遷移的抑制作用。研究表明，誘導(dǎo)鐵死亡是一種新的抗肺腺癌策略，而鐵死亡的抑制可以驅(qū)動(dòng)肺腺癌發(fā)生并促進(jìn)肺腺癌進(jìn)展［19］。細(xì)胞內(nèi)ROS和鐵積累、脂質(zhì)過氧化以及GSH消耗是鐵死亡的關(guān)鍵過程［20］。MDA是ROS誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化損傷的間接指標(biāo)。GPX4是一種谷胱甘肽過氧化物酶，在調(diào)控鐵死亡中起著重要作用，其以谷胱甘肽依賴方式特異性催化脂質(zhì)過氧化物的氧化活性，從而保護(hù)細(xì)胞免受鐵死亡的威脅［21］。本研究中，與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組A549 細(xì)胞中ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度、MDA、Fe2+水平升高，GSH水平及GPX4 mRNA水平降低，且透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)粒體呈現(xiàn)出典型的鐵死亡特征，表現(xiàn)為線粒體體積變小，膜密度升高，嵴減少以及外膜破裂，表明鳶尾素可誘導(dǎo)A549細(xì)胞鐵死亡。以上研究表明鳶尾素可抑制細(xì)胞增殖與遷移，誘導(dǎo)A549細(xì)胞鐵死亡，提示鳶尾素可能成為治療肺腺癌的有效藥物之一，但具體機(jī)制尚不完全清楚。

EBF3是一種控制靶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其可通過靶向下游因子ALOX15增加脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞ROS來促進(jìn)鐵死亡，進(jìn)而抑制腫瘤進(jìn)展［9］。而抑制EBF3表達(dá)可促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖與遷移行為［22］；過表達(dá)ALOX15 促進(jìn)了肺癌小鼠模型的癌細(xì)胞凋亡，并抑制了腫瘤轉(zhuǎn)移［23］。本研究中，與sh-NC組比較，sh-EBF3組EBF3、ALOX15蛋白水平降低，增殖、遷移能力增強(qiáng)，鐵死亡被抑制，提示抑制EBF3/ALOX15通路可促進(jìn)肺腺癌進(jìn)展，并抑制了鐵死亡的發(fā)生。此外，鳶尾素可上調(diào)A549 細(xì)胞中EBF3、ALOX15 蛋白，推測(cè)鳶尾素可能通過激活EBF3/ALOX15通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞鐵死亡，并抑制細(xì)胞增殖與遷移。本實(shí)驗(yàn)用sh-EBF3聯(lián)合鳶尾素同時(shí)干預(yù)A549細(xì)胞，結(jié)果顯示鳶尾素誘導(dǎo)A549細(xì)胞鐵死亡、抑制細(xì)胞增殖與遷移的生物學(xué)效應(yīng)在sh-NC中明顯，但在sh-EBF3中減弱，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述推測(cè)。

綜上所述，鳶尾素誘導(dǎo)A549細(xì)胞鐵死亡、抑制細(xì)胞增殖與遷移的機(jī)制可能與激活EBF3/ALOX15通路有關(guān)。但本研究未設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論，后期有待深入探究。

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（2024-12-10收稿 2025-01-15修回）

（本文編輯 李國(guó)琪）