銅和乙烯處理對花生白藜蘆醇合成酶基因及相關基因的影響

摘要 為了確定銅和乙烯處理下花生白藜蘆醇合成酶基因以及轉錄因子，采用高效液相色譜法測定白藜蘆醇含量，對應處理組進行轉錄組學測定和生物信息學分析。結果表明，0.1 mmol/L銅處理可促進花生產生白藜蘆醇，5 mmol/L乙烯處理下花生白藜蘆醇含量十分微量，銅和乙烯組合處理下花生白藜蘆醇含量較少，比銅處理組下的含量少92.2%，比乙烯處理下的含量多8.4倍。銅和乙烯處理對白藜蘆醇合成酶基因STS1、STS2、STS3的啟動起到正調控作用，轉錄因子MYB4、MYB73與白藜蘆醇合成酶基因有良好的結合位點。

關鍵詞 花生；白藜蘆醇；銅和乙烯處理；轉錄因子；白藜蘆醇合成酶基因

中圖分類號 S565.2 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2025）06-0001-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.06.001

Effects of Copper and Ethylene Treatment on Peanut Resveratrol Synthase Genes and Related Genes

BAO Xue-feng JIANG Chun-ji DONG Xuan1 et al

（1.Shenyang Agricultural University，Shenyang，Liaoning 110000; 2.Xichang College，Xichang，Sichuan 615000）

Abstract In order to determine the resveratrol synthase gene and transcription factors of peanut under copper and ethylene treatment，the resveratrol content was determined by high-performance liquid chromatography（HPLC），and transcriptomics and bioinformatics analysis were performed on the corresponding treatment groups.The results showed that 0.1 mmol/L copper treatment could promote the production of resveratrol in peanuts.Under 5 mmol/L ethylene treatment，the resveratrol content in peanuts was very ting.Under the combination of copper and ethylene treatment，the resveratrol content in peanuts was lower，92.2% lower than that under copper treatment and 8.4 times higher than that under ethylene treatment.Copper and ethylene treatment have a positive regulatory effect on the activation of resveratrol synthase genes STS1，STS2 and STS3，and transcription factors MYB4 and MYB73 have good binding sites with resveratrol synthase genes.

Key words Peanut;Resveratrol;Copper and ethylene treatment;Transcription factor;Resveratrol synthase gene

白藜蘆醇是一種酚類化合物，從植物中第一次被提取至今已有80年之久，因其具有良好的抗氧化、抗炎、抗腫瘤作用被學界廣泛關注［1-2］。植物產生一定量的白藜蘆醇可以有效緩解氧化產物過量積累的問題［3］。有效濃度的金屬離子刺激能促使植物產生一定濃度的白藜蘆醇［4-6］；激素類物質的外源誘導也可促使植物合成并積累白藜蘆醇［7-8］。植物體內白藜蘆醇的合成是通過苯丙氨酸代謝途徑來完成。白藜蘆醇的生成需要4-香豆酰輔酶A、丙二酰輔酶A 2種底物，生成4-香豆酰輔酶A的關鍵酶是苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羥基酶（C4H）、香豆酸輔酶A連接酶（4CL），丙二酰輔酶A由乙酰輔酶A和生物素羧化酶兩者合成，除此之外2種反應底物還得需要白藜蘆醇合成酶的參與才能有效合成白藜蘆醇［3］。

白藜蘆醇合成酶的合成需要白藜蘆醇合成酶基因（STS）的啟動，研究表明葡萄中STS的啟動被轉錄因子MYB14、MYB15所調控［9］。銅和乙烯不同處理促使花生合成白藜蘆醇［10］。在花生合成白藜蘆醇的過程中轉錄因子MYB14、MYB15的調控作用鮮有報道，為了探究這一問題，該試驗試圖通過對轉錄組數據進行聚類分析，確定銅和乙烯處理促使花生幼芽合成白藜蘆醇的關鍵基因及其轉錄因子，以期為銅、乙烯處理促使花生幼芽合成白藜蘆醇的轉錄調控分子機制研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 種子萌發與培養 選取源自中國山東省的優質花生品種海花1號，精心挑選出100粒外形飽滿、尺寸統一的花生種子作為試驗對象。將這些經過篩選的種子用蒸餾水徹底清洗后，放入35 ℃的恒溫水浴設備中，浸泡于蒸餾水中持續8 h［11］，將浸泡完成的種子平整地擺放于規格為35 cm×27 cm的專用培養托盤內，其上覆蓋經過消毒處理的毛巾，并適量噴灑蒸餾水，以維持種子的濕潤度。在29 ℃且無光照的環境下對種子進行為期3 d的培育，使其順利發芽，芽長達到2～3 cm時，繼續保持上述培養條件，延長培育時間至7 d。選取具有發達纖維狀根的花生芽以及長度在4～5 cm、質量在 4～5 g的花生芽作為后續試驗的研究樣本［10］。

1.2 處理試驗 該研究所使用的化學試劑為CuSO4和乙烯利。針對銅與乙烯的協同處理試驗，借助量筒準確量取225 mL 的雙倍濃度處理溶液。該試驗共設有4種不同的處理方式，具體為對照組（CK），CuSO4和乙烯利的濃度均為0 mmol/L；銅處理組（Cu），僅添加了0.1 mmol/L的CuSO4；乙烯處理組（ET），僅添加了5 mmol/L乙烯利；銅與乙烯的復合處理組（Cu_ET），同時添加了0.1 mmol/L的CuSO4和5 mmol/L的乙烯利。每種處理均安排了3個生物學重復，每個重復包含6株花生幼苗。在處理過程中，將花生幼苗的根部置于500 mL的透明塑料容器中，用450 mL的相應處理溶液進行浸泡，浸泡時間為48 h。處理期間，實驗室內保持25 ℃，并且全程處于黑暗無光照的狀態。

1.3 樣品提取 將液氮處理過的花生根放入研磨機中，在1 700 r/min下研磨15 s，將所得的研磨漿轉移至離心管中稱重，加入10 mL的80%甲醇萃取液。在280 r/min、40 ℃條件下，恒溫搖床中振蕩60 min，用超聲儀在50 ℃超聲180 min，再用離心機在4 000 r/min條件下離心15 min。離心樣品緩慢過濾到50 mL燒杯中，使用有機過濾器（孔徑0.22 μm）將濾液進一步過濾到2 mL棕色小瓶中，濾液在-40 ℃下保存，待用高效液相色譜（HPLC）測定。

1.4 高效液相色譜分析 該試驗借助安捷倫1100系列的高效液相色譜設備來檢測白藜蘆醇含量。該設備裝配了型號為DE11115754的四元泵、型號為DE11113430的DAD檢測器（采用光電二極管陣列檢測技術，檢測波長為306 nm）、Spursil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。采用等度洗脫法，在15 min內實現完全洗脫，洗脫溶劑由去離子水、高純度甲醇（純度≥99.9%，Sigma-Aldrich公司生產）、高純度乙腈（純度≥99.9%，上海安培爾科學儀器有限公司）組成，三者的體積配比為去離子水50%、甲醇20%、乙腈30%。在每個檢測時間點，進樣體積為20 μL，色譜柱的溫度維持在30 ℃，流動相的流速控制在0.8 mL/min。通過對標準樣品的保留時間和吸光度進行分析，實現對白藜蘆醇的定性和定量檢測，標準樣品的保留時間在6.76～6.78 min，吸光度在306 nm下進行測定（圖1）。白藜蘆醇的標準曲線是基于購自中國上海遠野生物科技有限公司的白藜蘆醇標準品制作而成。使用電子天平精確稱量5 mg樣品，以甲醇作為溶劑，將其溶解并定容至50 mL容量瓶中，制備成100 μg/mL的母液，按照試驗要求，將母液稀釋成0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL標準品溶液，隨后采用高效液相色譜法對這些不同濃度的標準品溶液進行檢測，依據白藜蘆醇標準品濃度與相應峰面積積分值之間的對應關系，繪制出標準曲線［12］。

1.5 處理后花生幼芽白藜蘆醇含量的統計方法 對經過48 h處理的新鮮花生根樣本，利用高效液相色譜法進行分析檢測，并借助預先構建的標準曲線來精準計算各樣本中白藜蘆醇的含量。對于獲取的所有試驗數據，統一采用Microsoft Excel 2016軟件進行初步的數據整理與分析。進一步的統計分析則借助SPSS 22.0軟件，采用單因素方差分析法、Duncan多重比較法來評估不同處理組之間的差異顯著性。利用Origin 2019軟件將分析結果以直觀的直方圖形式呈現出來。

1.6 轉錄組樣品提取 在完成48 h的處理程序之后，將花生幼苗取出，首先使用蒸餾水對其根部進行徹底沖洗，清除根部表面殘留的處理溶液。隨后，利用定性濾紙輕柔地擦拭根部，以吸干殘留的蒸餾水。接著，用剪刀小心地剪下幼苗的根部，并將其迅速轉移至50 mL離心管內。最后，迅速向離心管中加入液氮，使根部組織迅速冷凍，以便后續的試驗操作和保存。

1.7 RNA提取、cDNA準備和RNA-seq 依據試劑盒生產商提供的指南，采用植物總RNA提取試劑盒從100～200 mg的冷凍樣本中單獨提取總RNA。通過1%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳以及在260、280 nm下的分光光度計測量，評估總RNA的完整性和品質。挑選出260 nm/280 nm吸光度比為1.8～2.0的RNA樣本，用于后續的試驗分析。將每個樣本中10 μg（500 ng/μL）的高質量總RNA送往上海派森諾生物技術有限公司進行深度測序和數據集構建。具體操作：利用低聚磁珠從大約5 μg的總RNA中分離出mRNA，將分離得到的mRNA分解為約200個核苷酸長度的短片段，并借助隨機六聚物引物將其轉錄為第一鏈cDNA。接著，運用RNase H和DNA聚合酶I合成第二鏈cDNA，再利用QIAquick PCR純化試劑盒進行純化，并在3′末端添加堿基a進行末端修飾，將測序接頭連接至雙鏈cDNA的兩端（長度為200±25個堿基對），以進行PCR擴增。最終，雙鏈cDNA的測序工作在HiSeqTM 2000測序儀上，采用雙端測序技術一次性完成。利用Illumina GA Pipeline（1.6版）對原始圖像數據進行序列處理和堿基質量值計算，從而獲得125個堿基對的雙端讀取序列。

2 結果與分析

2.1 銅、乙烯處理下花生幼芽根重的比較 從圖2可以看出，對海花1號進行銅和乙烯不同處理48 h后，CK處理組的6個幼苗根重平均值為4.93 g，與交互處理組（Cu_ET）差異不顯著（Pgt;0.05），與銅處理組（Cu）和乙烯處理組（ET）差異顯著（Plt;0.05）。銅處理、乙烯處理以及銅和乙烯的交互處理均會使花生幼芽的根重降低，乙烯處理（ET）下根均值為3.26 g，對根重影響最大；銅處理（Cu）影響次之，交互處理（Cu_ET）影響最小。

2.2 銅、乙烯處理下花生幼芽根中白藜蘆醇含量的比較 從圖3可以看出，銅處理（Cu）下花生幼芽根部白藜蘆醇含量最多，為668.4 ng/g，與其他3組差異顯著（Plt;0.05）。此外，銅處理（Cu）分別高于交互處理（Cu_ET）、乙烯處理（ET）白藜蘆醇含量的11.8和120.1倍；而CK處理下，花生幼芽根部白藜蘆醇含量并未檢出。

2.3 銅和乙烯不同處理下花生幼芽轉錄組分析

2.3.1 花生幼芽差異基因分析。對海花1號花生10 d苗銅和乙烯4種處理下的發芽花生根部進行了轉錄組檢測，分別將銅處理、乙烯處理以及銅和乙烯的交互處理下基因reads count數與CK處理下的基因reads count數兩兩比較，以q=0.05為閾值，篩選差異表達基因，結果見圖4。轉錄組基因測序共計測到了68 107條基因，其中，CK處理與銅處理（Cu）轉錄組數據基因reads count數比較發現上調了1 019條基因，下調了356條基因；CK處理和乙烯處理（ET）轉錄組數據基因reads count數比較發現上調了4 011條基因，下調了6 017條基因；CK處理和交互處理（Cu_ET）轉錄組數據基因reads count數比較發現上調了6 727條基因，下調了8 765條基因；銅處理（Cu）和交互處理（Cu_ET）轉錄組數據基因reads count數比較發現上調了751條基因，下調了1 966條基因；銅處理（Cu）和乙烯處理（ET）轉錄組數據基因reads count數比較發現上調了950條基因，下調了1 275條基因。銅和乙烯交互處理下上調和下調的基因數目最多，乙烯處理下上調和下調的基因數目次之，銅處理下上調和下調的基因是最少的。

2.3.2 花生白藜蘆醇合成酶基因序列比對。銅和乙烯處理花生幼芽48 h轉錄組測序得到68 107條基因，從中共篩選出白藜蘆醇合成酶基因20條，在歐洲生物信息研究所網站（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/services/web_clustalo）進行同源序列比對（圖5），并繪制進化樹（圖6）。再對數據進行低表達基因剔除，獲得15條基因，通過TBtools v1.075軟件進行標準化并進行單向聚類分析，白藜蘆醇合成酶基因被分成3類，其中被分成第2個類別的基因表達量與銅和乙烯4種不同處理下白藜蘆醇含量變化趨勢一致（圖7），包括Ad STS2-L（LOC112796262）、Ad STS1（LOC112796261）、Ad STS1-L（LOC112796258）、Ad STS3-L（LOC112796275）、Ad STS3-L（LOC112796278），不同處理下白藜蘆醇合成酶基因（STS）的表達模式分為STS1、STS2、STS3。

2.3.3 花生幼芽根苯丙氨酸代謝路徑基因分析。苯丙氨酸代謝途徑是重要的次生代謝物產生路徑。白藜蘆醇合成途徑是苯丙氨酸次生代謝路徑中一個重要分支，合成白藜蘆醇需要一些重要酶基因（PAL、C4H、4CL、MAT、STS等）的參與。

該研究從68 107條基因轉錄組數據中，查詢了PAL、CYP、4CL、MAT、STS、MYB的基因表達量，根據gene symbol對所查詢到的所有觀測數據進行FPKM匯總，得到了813條數據信息，FPKM平均值小于1.5的數據被剔除，共得到了238條觀測數據。再對238條觀測數據，按銅處理表達量最大、交互處理表達量第二、乙烯處理表達量第三、CK處理表達量第四的順序，篩選并獲得了19條基因數據信息。其中，PAL包括2條觀測數據，CYP包括5條觀測數據，4CL包括3條觀測數據，MAT包括2條觀測數據，STS包括2條觀測數據，MYB包括5條觀測數據。利用銅和乙烯不同處理下白藜蘆醇含量變化表達模式作為參照標準，篩選了與合成白藜蘆醇的次生代謝路徑相關的PAL、CYP、4CL、MAT、STS、MYB等基因，并對這些基因的FPKM均值進行標準化后利用均值繪制了熱圖（圖8）。

從圖9可以看出，苯丙氨酸代謝路徑上PAL17.1、CYP710A11、CYP71AN24、CYP81E8、CYP84A1、4CLL5、5MAT1、PMAT1等基因表達量在4種不同處理下表達模式一致。另外，MYB家族中MYB2、MYB4、MYB14、MYB44、MYB73、MYBS3等基因表達量與白藜蘆醇含量的變化模式一致。

2.3.4 花生幼芽根苯丙氨酸代謝路徑MYB轉錄因子分析。白藜蘆醇合成酶基因的啟動受到MYB類轉錄因子的調控。

該研究選取了轉錄組數據中gene symbol中包含MYB的觀測，將它們的FPKM均值進行標準化后繪制了單向聚類熱圖（圖10）。銅處理（Cu）下顯著上調的MYB轉錄因子為MYB2、MYB4、MYB14、MYB44，乙烯處理（ET）下顯著上調的MYB轉錄因子為MYB2、MYB73，銅和乙烯交互處理（Cu_ET）下顯著上調的MYB轉錄因子為MYB4、MYB73。4種處理下與白藜蘆醇含量表達模式最為接近的是轉錄因子MYB4。

2.3.5 白藜蘆醇合成酶基因（STS）與MYB轉錄因子結合位點預測。對銅和乙烯處理下花生幼芽根部測序獲得的68 107條基因進行白藜蘆醇基因（STS）篩選，選取了銅和乙烯不同處理下與白藜蘆醇含量變化模式一致性較高的5條白藜蘆醇合成酶基因［Ad STS2-L（LOC112796262）、Ad STS1（LOC112796261）、Ad STS3-L（LOC112796275）、Ad STS1-L（LOC112796258）、Ad STS3-L（LOC112796278）］。

取目標基因上游2 kb序列作為啟動子區域，選取銅和乙烯不同處理下與白藜蘆醇含量變化模式一致性最接近的MYB2-LOC_112747221、MYB4-LOC_112789723、MYB14-LOC_112769746、MYB44-LOC_112702359、MYB73-LOC_112697787、MYBS3-LOC_112703095等MYB類轉錄因子進行結合位點預測。

據JASPAR網站中植物庫轉錄因子中所包含的motif提取目標轉錄因子，并采用MEME軟件的fimo插件預測啟動子序列和motif的結合位點，結果表明，白藜蘆醇合成酶基因STS2-LOC_112796262、STS3-LOC_112796278與MYB2、MYB4、MYB14、MYB44、MYB73、MYBS3等MYB類轉錄因子沒有結合位點，白藜蘆醇合成酶基因STS1-L（LOC112796258）、STS3-L（LOC112796275）與MYB4、MYB73有結合位點（表1）。

3 討論

生物和非生物因素都可以促使花生產生白藜蘆醇。在以往的報道中，金屬誘導子和激素誘導子交互誘導促使花生產生白藜蘆醇的研究鮮有報道。

Bao等［10］研究表明，對于單因素處理，當銅濃度在0.1～0.5 mmol/L時，白藜蘆醇含量與處理液中銅濃度線性相關；當乙烯濃度在4～9 mmol/L時，白藜蘆醇含量隨著乙烯濃度先上升再下降；而二者的交互呈現出波浪變化趨勢，0.1 mmol/L銅與5 mmol/L乙烯交互時白藜蘆醇含量大于二者分別單獨處理下的含量。該研究中0.1 mmol/L銅處理下白藜蘆醇含量與Bao等［10］的研究結果一致；5 mmol/L乙烯處理以及0.1 mmol/L銅和5 mmol/L乙烯交互處理下的白藜蘆醇含量與Bao等［10］的研究結果相差很大，這可能是此次研究花生培養環節缺少光照導致的。

白藜蘆醇的生物合成通過苯丙氨酸次生代謝途徑實現。合成白藜蘆醇的底物為4-香豆酸輔酶A和丙二酰輔酶A，以上2種底物在白藜蘆醇合成酶的參與下才能順利合成白藜蘆醇［13］。4-香豆酸輔酶A是由苯丙氨酸解氨酶（PAL）轉化成肉桂酸4-羥基酶（C4H）之后在4-香豆酸輔酶A連接酶的作用下形成的。而丙二酰輔酶A是經過脂肪酸合成路徑多步反應生成［14-15］。對銅和乙烯4種處理下丙氨酸代謝路徑進行了聚類分析，結果發現PAL17.1、CYP710A11、CYP71AN24、CYP81E8、CYP84A1、4CLL5、5MAT1、PMAT1基因具有同步表達現象。

銅和乙烯交互處理下的4-香豆酸輔酶A基因（4CLL5）上調數量高于銅處理組和乙烯處理組，表明4CLL5積極響應銅和乙烯的組合處理。白藜蘆醇合成酶基因STS1、STS2、STS3與銅和乙烯4種處理下白藜蘆醇含量變化模式一致，具有同步性。其中Ad STS2-L（LOC112796262）、Ad STS1（LOC112796261）、Ad STS3-L（LOC112796275）、Ad STS1-L（LOC112796258）、Ad STS3-L（LOC112796278）基因與白藜蘆醇含量變化模式的同步性最接近。

該試驗基于gene symbol對苯丙氨酸代謝路徑酶基因、白藜蘆醇合成酶基因進行聚類分析，結果發現，PAL17.1、CYP710A11、CYP71AN24、CYP81E8、CYP84A1、4CLL5、5MAT1、PMAT1以及STS1、STS2、STS3的表達模式與白藜蘆醇在不同處理下含量的變化趨勢一致，具有同步性。推斷這些基因同步參與白藜蘆醇合成的概率很高。

該研究試圖通過對轉錄組數據聚類的方法，找出花生白藜蘆醇代謝路徑控制白藜蘆醇合成的基因的具體名稱，并參考前人的研究［3，16］，勾勒出銅、乙烯誘導下花生白藜蘆醇生物合成的大致框架。在白藜蘆醇合成酶基因轉錄調控的研究中，轉錄因子MYB14、MYB15與白藜蘆醇合成酶基因（STS）表達模式一致，并進一步證實了MYB14、MYB15是葡萄中調控白藜蘆醇合成酶基因的轉錄因子［9，17-18］。該試驗對白藜蘆醇合成酶基因（STS）與轉錄因子MYB家族成員表達量進行聚類分析，結果發現，轉錄因子MYB2、MYB4、MYB14、MYB44與STS1、STS2、STS3的表達模式最為接近。

通過白藜蘆醇合成酶基因與轉錄因子結合位點的預測，發現STS1、STS3和MYB4、MYB73有結合位點，分別是GGTTGGTA、GGTTGGTG、TAACTGTATAA。故推斷MYB4和MYB73是Ad STS1-L（LOC112796258）、Ad STS3-L（LOC2796275）的轉錄因子，它們是對銅、乙烯處理響應的基因。雖然此推斷有待進一步研究和證實，但這也是進一步深入研究花生白藜蘆醇合成酶基因轉錄調控分子機制的新嘗試。

4 結論

0.1 mmol/L銅脅迫可增加花生芽白藜蘆醇的合成。花生芽在銅和乙烯的相互作用脅迫下合成的白藜蘆醇含量較少。5 mmol/L乙烯脅迫對花生芽中白藜蘆醇合成的促進作用在4個處理組中微弱。轉錄因子MYB4、MYB73，白藜蘆醇合成酶基因STS1、STS2、STS3，苯丙氨酸代謝路徑基因PAL17.1、CYP710A11、CYP71AN24、CYP81E8、CYP84A1、4CLL5以及丙二酰輔酶A基因5MAT1、PMAT1共表達并積極響應了花生幼芽白藜蘆醇的生物合成，這些基因起到了正調控作用。MYB4、MYB73是Ad STS1-L（LOC112796258）、Ad STS3-L（LOC2796275）的轉錄因子。

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基金項目 國家重點研發計劃項目（2018YFD1000900）。

作者簡介 包學鋒（1977—），男，蒙古族，內蒙古通遼人，講師，博士，從事植物次生代謝物合成通路研究。*通信作者，教授，博士，博士生導師，從事植物營養學方面的研究。

收稿日期 2024-01-02