不同除菌方式對(duì)豬小腸肝素效價(jià)、廢水蛋白含量及微生物菌群的影響

摘 要：為減少豬小腸肝素提取過(guò)程中的微生物污染，采用微酸性電解水（slightly acidic electrolyzed water，SAEW）對(duì)豬小腸進(jìn)行除菌處理，比較直接浸泡、超聲浸泡及噴霧3 種除菌方式對(duì)豬小腸減菌率、肝素效價(jià)及肝素廢水蛋白含量的影響，以篩選最佳除菌方式，利用16S rRNA高通量測(cè)序分析最佳除菌方式處理后豬小腸微生物菌群的組成和變化。結(jié)果表明，在最佳除菌條件下，3 種除菌方式的除菌效果差異不明顯。其中，噴霧除菌對(duì)肝素效價(jià)和廢水蛋白含量影響較小，故選作豬小腸肝素提取前的除菌方式。16S rRNA高通量測(cè)序結(jié)果表明，有效氯質(zhì)量濃度達(dá)到75 mg/L后，SAEW噴霧除菌能有效殺滅乳球菌屬（Lactococcus）、漫游球菌屬（Vagococcus）和嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）等豬小腸優(yōu)勢(shì)菌屬，減少豬小腸肝素微生物污染。

關(guān)鍵詞：微酸性電解水；肝素；噴霧除菌；微生物菌群

Effect of Different Sterilization Treatments on Heparin Titer， Protein Content in Wastewater and Microflora in Porcine Small Intestine

QUAN Run1， WU Xiaolong1， CHONG Zhengchen1， LIU Rongxu2， ZHANG Junjie3， WANG Yucong1，

XIE Zhixin1， HAN Jianchun1，2，*， LIU Danyi2，*

（1. College of Food Science， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China; 2. Heilongjiang Institute of Green Food Science， Harbin" "150028， China; 3. Heilongjiang Hanheng Environmental Protection Technology Co. Ltd.， Harbin 150000， China）

Abstract： To reduce microbial contamination during heparin extraction from porcine small intestines， this study employed slightly acidic electrolyzed water （SAEW）. The sterilization effects of three SAEW treatments： direct immersion， ultrasonic-assisted immersion and spraying were evaluated as well as their influences on the bacterial reduction rate，" heparin titer and the protein content of wastewater to screen the best sterilization treatment. 16S rRNA high-throughput sequencing was used to analyze the composition and changes of microflora in porcine small intestine after the best sterilization treatment. The results showed that under optimal conditions， there was no significant difference in the sterilization effect of the three methods. Of these， spray treatment had the least effect on the heparin titer and the protein content of wastewater， and was thus selected for sterilization before heparin extraction. High-throughput 16S rRNA gene sequencing revealed that spraying SAEW to an available chlorine concentration of 75 mg/L killed the dominant genera in the porcine small intestine， such as Lactococcus， Vagococcus and Psychrobacter， reducing the microbial contamination of porcine small intestinal heparin.

Keywords： slightly acidic electrolyzed water; heparin; spray sterilization; microbial flora

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240926-254

中圖分類(lèi)號(hào)：TS251.9" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2025）03-0018-11

引文格式：

全潤(rùn)， 吳曉龍， 種正晨， 等. 不同除菌方式對(duì)豬小腸肝素效價(jià)、廢水蛋白含量及微生物菌群的影響[J]. 肉類(lèi)研究， 2025， 39（3）： 18-28. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240926-254." " http：//www.rlyj.net.cn

QUAN Run， WU Xiaolong， CHONG Zhengchen， et al. Effect of different sterilization treatments on heparin titer， protein content in wastewater and microflora in porcine small intestine[J]. Meat Research， 2025， 39（3）： 18-28. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240926-254." " http：//www.rlyj.net.cn

豬小腸是消化與吸收的主要器官，同時(shí)也是非特異性免疫反應(yīng)的重要場(chǎng)所，這決定了小腸黏膜含有特殊的生理活性成分，如堿性磷酸酶、硫酸皮膚素、肝素和小腸黏膜蛋白（肽）等[1-2]。其中，肝素是由動(dòng)物結(jié)締組織肥大細(xì)胞產(chǎn)生的黏多糖，具有抗凝血性，作為抗凝劑應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)[3]。肝素多以新鮮豬小腸為原料進(jìn)行生產(chǎn)，然而豬小腸內(nèi)含有大量微生物，若保存不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致小腸中肝素組分被微生物及其代謝產(chǎn)物（酶）分解，進(jìn)而造成得率下降，微生物代謝產(chǎn)生的毒素也會(huì)污染肝素廢水蛋白，造成不必要的損失。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于豬小腸除菌技術(shù)研究甚少。因此，開(kāi)發(fā)合理的除菌方法對(duì)提升肝素品質(zhì)和回收肝素廢水蛋白具有重要意義。

微酸性電解水（slightly acidic electrolyzed water，SAEW）是使用無(wú)隔膜技術(shù)，通過(guò)微弱的直流電壓電解氯化鈉溶液生成的pH值在5.0～6.5之間且具有強(qiáng)氧化特性的功能水[4]。SAEW能夠通過(guò)破壞微生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)境導(dǎo)致其死亡[5-6]。與其他消毒劑相比，SAEW具有殺菌高效、貯藏穩(wěn)定、無(wú)毒且無(wú)殘留等優(yōu)勢(shì)[7-8]。

趙莉等[9]研究SAEW、臭氧化水、次氯酸鈉溶液和超聲處理對(duì)鮮食花生保鮮效果的影響，結(jié)果表明，SAEW和次氯酸鈉溶液能夠有效控制微生物生長(zhǎng)，以SAEW更安全。姜曉東等[10]研究SAEW和冷鹽水預(yù)處理對(duì)虹鱒魚(yú)肉貯藏品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)SAEW抑制魚(yú)肉微生物數(shù)量增長(zhǎng)、維持魚(yú)肉品質(zhì)的效果優(yōu)于冷鹽水。

在實(shí)際應(yīng)用中，除采用SAEW直接浸泡、清洗處理外，還常將其與超聲和噴霧等技術(shù)聯(lián)用，以提高除菌效果。超聲在液體介質(zhì)中傳播時(shí)形成縱波，其周期性壓力變化易引起空化效應(yīng)。空化氣泡坍塌瞬間產(chǎn)生的局部高溫高壓可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有效殺滅液體中的部分微生物[11]。超聲處理能夠加速SAEW的有效氯進(jìn)入微生物細(xì)胞膜，達(dá)到更好的除菌效果。Feng Yabin等[12]比較單獨(dú)使用超聲、SAEW和2 種方式聯(lián)合使用清洗葡萄的除菌效果，發(fā)現(xiàn)超聲與SAEW聯(lián)用的除菌效果最好。此外，噴霧SAEW已經(jīng)被證明是一種有效的微生物殺滅技術(shù)。與直接浸泡相比，噴霧處理可避免污染物直接污染SAEW，從而避免其除菌效果減弱，這種處理方式已經(jīng)被用于溫室除菌[13]。

本研究以SAEW為殺菌劑，分別對(duì)豬小腸進(jìn)行直接浸泡、超聲浸泡及噴霧處理，探究不同除菌方式的除菌效果以及對(duì)豬小腸肝素效價(jià)、廢水蛋白的影響，確定最佳除菌方式，并分析最佳除菌方式下豬小腸微生物菌群變化，以期為豬小腸肝素提取前的除菌處理提供理論與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬小腸源自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)三花豬。

胰蛋白酶（250 U/mg） 浙江福軒生物科技有限公司；肝素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98.5%） 上海哈靈生物科技有限公司；牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%） 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；肝素試劑盒 上海瑞番生物科技有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂 上海力辰儀器科技有限公司；氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T15-100STD酸性電解水（acidic electrolyzed water，AEW）設(shè)備 丹麥Danish Clean Water公司；HI83224余氯測(cè)試儀 青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；RWP微納米氣泡發(fā)生器 江蘇如克環(huán)保設(shè)備有限公司；JC-100電熱恒溫培養(yǎng)箱 青島精誠(chéng)儀器儀表有限公司；LDZX-30KBS高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；JD-CJ-2S單人雙面垂直凈化工作臺(tái) 蘇州金大凈化工程設(shè)備有限公司；FE28 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SAEW制備

以氯化鈉和水為原料，使用AEW設(shè)備制備AEW（有效氯質(zhì)量濃度（available chlorine concentration，ACC）為700 mg/L、pH 2.15），在1 h內(nèi)使用以保持其活性。使用余氯測(cè)試儀測(cè)定其ACC，使用pH計(jì)測(cè)定其pH值。通過(guò)稀釋AEW制備SAEW（pH 6）。

1.3.2 豬小腸肝素提取

參考王忠民[14]的方法，采用酶解法提取豬小腸肝素。首先，將除菌處理前后的豬小腸以1∶1 100（g/mL）

溶于20 mmol/L Tris-HCl（含1%（m/m）吐溫-20，pH 8.5）中，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，收集上清液，即得肝素廢水。將沉淀凍干后與適量去離子水混合，料液比為1∶10（g/mL），調(diào)節(jié)pH值為8.1，加入4 g/100 mL氯化鈉，轉(zhuǎn)入恒溫水浴鍋，溫度達(dá)到40 ℃時(shí)加入2 g/100 mL胰蛋白酶，隨后在37 ℃保溫2 h。提取結(jié)束后，將溫度升至86 ℃，滅活胰蛋白酶10 min，然后在4 ℃、10 000 r/min離心15 min，收集上清液，即得豬小腸肝素溶液。

1.3.3 除菌方式篩選

豬小腸清洗干凈后，采用SAEW按照料液比

1∶6（g/mL）浸泡豬小腸，或采用SAEW對(duì)豬小腸進(jìn)行均勻噴霧，以豬小腸菌落總數(shù)與所提取肝素效價(jià)為指標(biāo)篩選除菌條件與方式。

1.3.3.1 直接浸泡

豬小腸分別在A(yíng)CC為0、25、50、75、100 mg/L的SAEW中浸泡120 s，確定最佳除菌ACC。豬小腸在A(yíng)CC為75 mg/L的SAEW中分別浸泡0、60、120、180、240 s，確定最佳浸泡時(shí)間。

1.3.3.2 超聲浸泡

豬小腸分別在A(yíng)CC為0、25、50、75、100 mg/L的SAEW中超聲浸泡120 s，超聲功率50 W，確定最佳除菌ACC。豬小腸在A(yíng)CC為50 mg/L的SAEW中分別超聲浸泡0、60、120、180、240 s，超聲功率50 W，確定最佳超聲浸泡時(shí)間。在0、25、50、75、100 W超聲功率下，豬小腸在A(yíng)CC為50 mg/L的SAEW中超聲浸泡120 s，確定最佳超聲功率。

1.3.3.3 噴霧處理

采用ACC為0、25、50、75、100 mg/L的SAEW對(duì)豬小腸均勻噴霧180 s，噴霧壓力100 MPa，確定最佳除菌ACC。采用ACC為75 mg/L的SAEW噴霧0、90、180、270、360 s，噴霧壓力100 MPa，確定最佳噴霧時(shí)間。在噴霧壓力80、90、100、110、120 MPa下，采用ACC為75 mg/L的SAEW噴霧180 s，確定最佳噴霧壓力。

1.3.4 菌落總數(shù)測(cè)定

根據(jù)GB 4789.2—2022《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》測(cè)定豬小腸菌落總數(shù)。減菌率按下式計(jì)算：

式中：N1為處理前的豬小腸菌落總數(shù)/（CFU/g）；N2為處理后豬小腸菌落總數(shù)/（CFU/g）。

1.3.5 肝素效價(jià)測(cè)定

參考郭明珠[15]的天青A比色法測(cè)定豬小腸肝素效價(jià)，采用肝素試劑盒測(cè)定3 種除菌方式處理后豬小腸肝素效價(jià)。取肝素標(biāo)準(zhǔn)品（2 500 U）配制肝素標(biāo)準(zhǔn)溶液

（2 U/mL），取肝素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制一系列濃度梯度（0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4 U/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入0.5 mL天青顯色工作液（天青顯色液中加入5 倍體積的蒸餾水），在505 nm處測(cè)定吸光度并計(jì)算肝素效價(jià)，以吸光度為縱坐標(biāo)，肝素效價(jià)（U/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y＝0.099 6x＋0.015 4

（R2＝0.992）。將豬小腸肝素溶液按照一定比例稀釋后，在505 nm處測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算肝素效價(jià)。

1.3.6 肝素廢水蛋白含量與組成測(cè)定

采用雙縮脲法[16]測(cè)定肝素廢水蛋白含量。準(zhǔn)確配制10 mg/mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，并稀釋為一系列質(zhì)量濃度梯度（0、2、4、6、8、10 mg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別向1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入4 mL雙縮脲試劑混勻靜置20 min，在540 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y＝0.047 3x＋0.006 5（R2＝0.999 3）。將除菌處理前后的肝素廢水按照一定比例稀釋后，向1 mL樣品中加入4 mL雙縮脲試劑，并混勻靜置20 min。在540 nm處測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算蛋白含量。

參照唐嘉誠(chéng)等[17]的方法并略作調(diào)整，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）測(cè)定肝素廢水蛋白組成。首先，將豬小腸清洗、翻面，刮取豬腸內(nèi)表面黏膜，真空冷凍干燥后精細(xì)研磨，作為未經(jīng)肝素提取的腸黏膜樣品。采用12%分離膠和6%濃縮膠將樣品蛋白和上樣緩沖液混合后，95 ℃加熱5 min使蛋白質(zhì)完全變性。每個(gè)樣品取10 μL進(jìn)行凝膠電泳。電泳在恒壓120 V下進(jìn)行，直至指示劑到達(dá)凝膠底1～2 cm處停止電泳。采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色2 h，用脫色液脫色，直至蛋白條帶清晰可見(jiàn)。使用凝膠成像儀拍攝蛋白條帶，然后使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3.7 微生物組學(xué)分析

分別采用ACC 0、25、50、75、100 mg/L的SAEW在110 MPa噴霧壓力下處理豬小腸270 s，收集豬小腸樣品并提取DNA，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增技術(shù)對(duì)微生物16S rDNA V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物：338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’，下游引物：806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。

委托北京奧維森基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，得到原始數(shù)據(jù)后利用Pear軟件進(jìn)行質(zhì)控、去除錯(cuò)位堿基和引物、過(guò)濾拼接。對(duì)相似度≥97%的有效片段進(jìn)行操作分類(lèi)單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類(lèi)，與已建立的數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比并進(jìn)行分類(lèi)注釋?zhuān)瑥亩鴮?shí)現(xiàn)基于OTU的多樣性分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有指標(biāo)均進(jìn)行3 次重復(fù)測(cè)定，使用SPSS 2019軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，采用最小顯著差異（least significant difference，LSD）法對(duì)各處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，

P＜0.05為差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Origin 2021軟件繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 直接浸泡對(duì)豬小腸除菌效果及肝素效價(jià)的影響

2.1.1 直接浸泡ACC對(duì)豬小腸除菌效果及肝素效價(jià)的影響

由圖1a可知，直接浸泡可有效地除去豬小腸中的細(xì)菌，隨著SAEW ACC的增加，豬小腸菌落總數(shù)顯著降低（P＜0.05），除菌效果顯著增強(qiáng)。Tantratian等[18]使用不同ACC SAEW清洗新鮮牡蠣，除菌效果也隨著ACC的增加逐漸增強(qiáng)，與本研究結(jié)果一致。這是由于SAEW主要通過(guò)有效氯成分破壞細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、影響細(xì)胞的代謝過(guò)程導(dǎo)致細(xì)菌死亡[19]，ACC越高，SAEW的除菌效果越強(qiáng)。與ACC 0 mg/L相比，ACC達(dá)到75 mg/L時(shí)，菌落總數(shù)減少2.61（lg（CFU/g）），減菌率達(dá)（99.75±0.06）%，繼續(xù)增加ACC，減菌率增加不顯著（P＞0.05）。因此，ACC達(dá)到一定水平時(shí)，即可取得較為理想的除菌效果，考慮到實(shí)際生產(chǎn)成本，選擇ACC 75 mg/L的SAEW進(jìn)行直接浸泡除菌處理。

如圖1b所示，隨著SAEW ACC的增加，肝素效價(jià)顯著降低（P＜0.05）。SAEW的有效氯成分能夠破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性成分釋放[20]，導(dǎo)致更多肝素溶解于SAEW，進(jìn)而降低肝素提取率。當(dāng)ACC達(dá)到75 mg/L時(shí)，肝素效價(jià)為（9.26±0.18）U/mL，與0 mg/L相比，降低1.74 U/mL。

2.1.2 直接浸泡時(shí)間對(duì)豬小腸除菌效果及肝素效價(jià)的影響

由圖2a可知，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，豬小腸菌落總數(shù)顯著減少（P＜0.05），除菌效果顯著增強(qiáng)，但減菌率在浸泡時(shí)間達(dá)到120 s后增加不顯著（P＞0.05），減菌率達(dá)到（99.77±0.04）%。與浸泡0 s相比，浸泡180、240 s時(shí)菌落總數(shù)分別減少2.89、3.03（lg（CFU/g）），減菌率分別為（99.87±0.04）%和（99.90±0.03）%，除菌效果好且減菌率相當(dāng)。浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，SAEW會(huì)與豬小腸中的其他污染物發(fā)生相互作用，消耗SAEW中的有效氯成分[21]，但殺菌效果已不顯著。因此，直接浸泡120 s即可實(shí)現(xiàn)豬小腸充分除菌。

由圖2b可知，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，肝素效價(jià)顯著降低（P＜0.05）。一方面，SAEW能破壞細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)容物釋放[22]。另一方面，SAEW作為一種pH 5.0～6.5的功能水，其微酸性對(duì)肝素活性結(jié)構(gòu)影響較小，可能導(dǎo)致少部分肝素-蛋白結(jié)合物溶解于SAEW[23-24]。

浸泡時(shí)間越長(zhǎng)，豬小腸與SAEW接觸時(shí)間越長(zhǎng)，這將促進(jìn)更多肝素溶解于SAEW。直接浸泡120 s的肝素效價(jià)為（9.57±0.09）U/mL，與浸泡0 s相比（未經(jīng)除菌處理），肝素效價(jià)減少1.98 U/mL。繼續(xù)延長(zhǎng)浸泡時(shí)間，肝素效價(jià)降低不顯著（P＞0.05），表明SAEW浸泡處理對(duì)肝素提取的影響有限，但處理時(shí)間延長(zhǎng)可導(dǎo)致SAEW有效氯成分減少[25]，SAEW對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的破壞作用也隨之降低。

2.2 超聲浸泡對(duì)豬小腸除菌效果及肝素效價(jià)的影響

2.2.1 超聲浸泡ACC對(duì)豬小腸除菌效果及肝素效價(jià)的影響

由圖3a可知，隨著SAEW ACC的增加，豬小腸菌落總數(shù)顯著減少（P＜0.05），除菌效果顯著提高。Liu Xiaofang等[26]使用SAEW聯(lián)用超聲處理金槍魚(yú)，也發(fā)現(xiàn)ACC越高，除菌效果越好，與本研究結(jié)果一致。與ACC 0 mg/L相比，ACC 50 mg/L時(shí)菌落總數(shù)減少2.74（lg（CFU/g）），減菌率為（99.71±0.06）%，除菌效果優(yōu)于直接浸泡方式。這可能是由于超聲的空化效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破裂，有效氯成分可加快通過(guò)細(xì)菌細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，發(fā)揮殺菌作用[27-28]。繼續(xù)增加ACC，減菌率增加不顯著（P＞0.05）。綜上，選擇ACC 50 mg/L的SAEW進(jìn)行超聲浸泡除菌處理。

由圖3b可知，ACC為0 mg/L時(shí)，超聲浸泡豬小腸肝素效價(jià)為（10.88±0.19）U/mL，而直接浸泡豬小腸肝素效價(jià)為（11.00±0.07）U/mL，2 種除菌處理方式對(duì)肝素效價(jià)影響差異不明顯。隨著ACC的增加，SAEW對(duì)豬小腸細(xì)胞的破壞作用增強(qiáng)，肝素效價(jià)顯著降低（P＜0.05）。當(dāng)ACC達(dá)到50 mg/L時(shí)，肝素效價(jià)為（9.37±0.15）U/mL，而直接浸泡肝素效價(jià)為（9.64±0.06）U/mL，超聲浸泡除菌會(huì)損耗更多的肝素。

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)豬小腸除菌效果及肝素效價(jià)的影響

超聲波能夠增加微生物細(xì)胞膜通透性，甚至破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而促進(jìn)SAEW的有效氯成分滲透到微生物細(xì)胞內(nèi)部，導(dǎo)致微生物死亡，而超聲時(shí)間和超聲功率是影響超聲波破壞細(xì)胞膜程度的關(guān)鍵因素[29]。由圖4a可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，豬小腸菌落總數(shù)顯著減少（P＜0.05），超聲時(shí)間120 s時(shí)，豬小腸菌落總數(shù)減少2.76（lg（CFU/g）），減菌率為（99.82±0.03）%。繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間至180、240 s時(shí)菌落總數(shù)分別減少2.96、3.09（lg（CFU/g）），菌落總數(shù)減少量高于直接浸泡處理，除菌效果更好，但是減菌率增加不顯著（P＞0.05）。綜上，選擇超聲時(shí)間為120 s。

由圖4b可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，肝素效價(jià)顯著降低（P＜0.05）。與超聲0 s相比，超聲浸泡120 s時(shí)，肝素效價(jià)為（9.24±0.07）U/mL，減少2.69 U/mL，減少量高于直接浸泡（1.98 U/mL），這可能是由于超聲可破壞細(xì)胞膜，超聲時(shí)間延長(zhǎng)可增加細(xì)胞膜破壞程度[30]，進(jìn)而促進(jìn)SAEW的有效氯成分滲透，導(dǎo)致更多肝素-蛋白結(jié)合物溶解于SAEW。

2.2.3 超聲功率對(duì)豬小腸除菌效果及肝素效價(jià)的影響

超聲波主要通過(guò)空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)及自由基效應(yīng)改變細(xì)胞膜通透性和破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[31]。由圖5a可知，與超聲功率0 W相比，超聲功率25、50 W時(shí)菌落總數(shù)分別減少0.02、0.04（lg（CFU/g））（P＞0.05），超聲功率達(dá)到75 W后，菌落總數(shù)減少0.31（lg（CFU/g））且減菌率達(dá)到（99.77%±0.04）%（P＜0.05）。超聲功率越高，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞程度越高，進(jìn)而促進(jìn)SAEW的有效氯成分進(jìn)入細(xì)胞，核酸和蛋白質(zhì)等細(xì)胞膜內(nèi)成分釋放[32]。因此，選擇超聲功率為75 W。

超聲功率增加會(huì)導(dǎo)致空化氣泡數(shù)量增多，空化作用增強(qiáng)，細(xì)胞破壞程度增加[33]，進(jìn)而導(dǎo)致更多肝素-蛋白結(jié)合物溶出。由圖5b可知，超聲功率75 W時(shí)，肝素效價(jià)為（9.23±0.10）U/mL，與超聲功率0 W相比減少0.33 U/mL，與未經(jīng)除菌處理相比減少2.80 U/mL，表明超聲能促進(jìn)肝素溶解于SAEW。Zhang Liping等[34]研究發(fā)現(xiàn)，300 W超聲處理2 h對(duì)豬小腸肝素提取效果較好。超聲處理產(chǎn)生的局部高壓與高溫能夠破壞豬小腸細(xì)胞膜，增加肝素提取得率，因此，超聲浸泡處理可能導(dǎo)致更多肝素溶于SAEW而損耗，進(jìn)而降低肝素效價(jià)。但總體上，0～100 W超聲處理對(duì)肝素效價(jià)影響較小，可能是由于低超聲功率對(duì)豬小腸的破壞程度較小。

2.3 噴霧處理對(duì)豬小腸除菌效果及肝素效價(jià)的影響

2.3.1 噴霧ACC對(duì)豬小腸除菌效果及肝素效價(jià)的影響

由圖6a可知，隨著SAEW ACC的增加，豬小腸菌落總數(shù)顯著減少（P＜0.05）。但是，相同ACC下噴霧的除菌效果不及直接浸泡和超聲浸泡除菌方式。這可能是因?yàn)榻莘绞娇墒筍AEW與豬小腸充分接觸，有效氯成分能夠充分發(fā)揮殺菌作用。這與Liu Chang等[35]的研究結(jié)果相似，浸泡比噴霧具有更大的接觸面積，浸泡除菌效果更好。但當(dāng)ACC達(dá)到75 mg/L后，3 種除菌方式的除菌效果相差不大，噴霧、直接浸泡和超聲浸泡減菌率分別達(dá)到（99.55±0.04）%、（99.75±0.06）%和（99.82±0.03）%。繼續(xù)增加噴霧ACC，減菌率無(wú)顯著變化（P＞0.05）。因此，選擇ACC為75 mg/L的SAEW進(jìn)行噴霧處理。

由圖6b可知，隨著噴霧ACC的增加，肝素效價(jià)逐漸降低。與ACC為0 mg/L相比，噴霧ACC為75 mg/L時(shí)，肝素效價(jià)為（11.41±0.01）U/mL，降低0.07 U/mL。噴霧處理的肝素效價(jià)遠(yuǎn)高于直接浸泡的（9.26±0.18）U/mL和超聲浸泡的（9.11±0.48）U/mL，表明噴霧除菌方式的肝素?fù)p耗最小。與浸泡相比，噴霧能夠減少SAEW與豬小腸接觸，進(jìn)而避免肝素溶于SAEW而損耗。

2.3.2 噴霧時(shí)間對(duì)豬小腸除菌效果及肝素效價(jià)的影響

由圖7a可知，與噴霧時(shí)間0 s相比，其余噴霧時(shí)間的菌落總數(shù)均顯著減少（P＜0.05），減菌率顯著升高（P＜0.05），除菌效果顯著增加。Yuan Xingyun等[36]在不同噴霧時(shí)間，采用不同ACC的SAEW處理雞蛋，發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌等細(xì)菌的減少量與噴霧時(shí)間成正比，與本研究結(jié)果一致。延長(zhǎng)噴霧時(shí)間有助于SAEW與豬小腸充分接觸，其有效氯成分可充分作用于豬小腸中的細(xì)菌，達(dá)到更好的除菌效果。但當(dāng)處理時(shí)間大于270 s后，減菌率升高不顯著（P＞0.05）。噴霧時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，SAEW可能與豬小腸污染物繼續(xù)反應(yīng)，消耗有效氯成分，導(dǎo)致除菌效果減弱。因此，選擇噴霧時(shí)間為270 s。

由圖7b可知，隨著噴霧時(shí)間的延長(zhǎng)，肝素效價(jià)顯著降低（P＜0.05）。與噴霧時(shí)間0 s相比，噴霧時(shí)間270 s時(shí)，肝素效價(jià)為（11.23±0.10）U/mL，減少0.34 U/mL。噴霧除菌過(guò)程中，噴霧時(shí)間是決定SAEW噴灑量、SAEW與豬小腸接觸時(shí)間的關(guān)鍵因素，增加噴灑量和接觸時(shí)間可加強(qiáng)SAEW對(duì)豬小腸的殺菌作用，但可導(dǎo)致肝素效價(jià)降低。然而，與浸泡相比，噴霧時(shí)間對(duì)肝素效價(jià)的影響較小，這可能是由于浸泡處理使SAEW與豬小腸的接觸更充分，肝素-蛋白結(jié)合物因溶于浸泡液而導(dǎo)致肝素?fù)p耗更多。

2.3.3 噴霧壓力對(duì)豬小腸除菌效果及肝素效價(jià)的影響

噴霧壓力影響SAEW噴灑量及與豬小腸的接觸面積，噴霧壓力越大，噴灑出的SAEW粒徑越小[37]，在相同面積下，豬小腸能夠接觸更多SAEW，有效氯成分能夠更充分作用于豬小腸中的細(xì)菌，達(dá)到更好的除菌效果。由圖8a可知，隨著噴霧壓力的增大，菌落總數(shù)顯著減少（P＜0.05），當(dāng)噴霧壓力為110 MPa時(shí)，減菌率為（99.76±0.03）%，繼續(xù)升高噴霧壓力，減菌率升高不顯著（P＞0.05）。所以，選擇噴霧壓力為110 MPa。

由圖8b可知，噴霧壓力大于90 MPa后，肝素效價(jià)顯著減少（P＜0.05），表明噴霧壓力能夠顯著影響肝素提取。噴霧壓力110 MPa時(shí)，肝素效價(jià)為（11.09±0.11）U/mL，與噴霧壓力80 MPa相比減少0.48 U/mL，與未經(jīng)除菌處理相比減少0.84 U/mL。Zheng Weichao等[38]研究發(fā)現(xiàn)，噴霧壓力越大，SAEW噴霧粒徑越小，這導(dǎo)致SAEW單位面積接觸量增加。另外，有效氯損耗也與粒徑有關(guān)，粒徑越小，損耗越小。所以，噴霧壓力越大，豬小腸接觸SAEW越多，肝素?fù)p失越多。

2.4 不同除菌方式對(duì)豬小腸肝素廢水蛋白含量與組成的影響

2.4.1 不同除菌方式對(duì)豬小腸肝素廢水蛋白含量的影響

由圖9可知，不同除菌方式對(duì)于肝素廢水蛋白含量存在顯著影響（P＜0.05）。與未經(jīng)除菌處理組對(duì)比，直接浸泡和超聲浸泡對(duì)廢水蛋白含量影響較大，蛋白質(zhì)量濃度分別降低4.09、4.13 mg/mL；噴霧對(duì)廢水蛋白含量影響相對(duì)較小，蛋白質(zhì)量濃度降低0.38 mg/mL。豬小腸肝素廢水蛋白主要是一類(lèi)水溶性糖蛋白[39]，與噴霧對(duì)比，浸泡能夠使豬小腸與SAEW充分接觸，使更多蛋白溶于浸泡液，導(dǎo)致肝素廢水蛋白含量顯著減少（P＜0.05）。因此，噴霧方式更利于肝素廢水蛋白回收。

2.4.2 不同除菌方式對(duì)豬小腸肝素廢水蛋白組成的影響

由圖10可知，未經(jīng)肝素提取處理的豬小腸黏膜原始樣條帶較為豐富，背景深，呈現(xiàn)彌散狀態(tài)，但經(jīng)酶解提取肝素后，條帶數(shù)量明顯減少或消失。未經(jīng)除菌處理與經(jīng)3 種除菌方式處理后的肝素廢水樣品在分子質(zhì)量70 kDa處均有清晰條帶，說(shuō)明3 種除菌方式對(duì)廢水蛋白組成無(wú)明顯影響，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中可能不會(huì)對(duì)酶解廢水中特定蛋白回收產(chǎn)生影響。綜上，在最佳除菌條件下，3 種除菌方式的除菌效果相當(dāng)。但是，噴霧處理對(duì)肝素效價(jià)和肝素廢水蛋白含量影響相對(duì)較小。因此，豬小腸肝素提取前除菌處理采用噴霧除菌方式。

2.5 噴霧處理對(duì)豬小腸菌群的影響

采用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)從不同ACC噴霧處理豬小腸微生物中共獲得1 065 506 條有效序列，平均每個(gè)樣品的序列數(shù)為71 034 條，測(cè)序深度在5 000～20 000之間。對(duì)測(cè)出的2 599 個(gè)OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，獲得不同ACC噴霧處理豬小腸菌群組成。

α-多樣性可衡量樣品中物種的多少、豐度和均勻度，其中，Chao1指數(shù)是衡量微生物豐度的關(guān)鍵指標(biāo)之一，Shannon指數(shù)表示微生物多樣性。由圖11可知，與ACC 0 mg/L相比，ACC 25、50、75、100 mg/L處理豬小腸樣品的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著降低（P＜0.05），表明SAEW噴霧處理對(duì)豬小腸菌群豐富度和多樣性存在顯著影響，增加ACC可有效降低豬小腸菌群多樣性和豐富度。但ACC 75 mg/L處理豬小腸樣品的Shannon指數(shù)高于A(yíng)CC 50 mg/L處理豬小腸樣品，Shannon指數(shù)對(duì)豐度低的物種權(quán)重大，這可能導(dǎo)致ACC為75 mg/L時(shí)計(jì)算出的Shannon指數(shù)偏大。

β-多樣性分析是了解不同群落物種組成差異的重要方法，用于研究群落之間的種多度關(guān)系。基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）是β-多樣性分析的非限制性排序。由圖12可知，ACC 0 mg/L處理豬小腸與ACC 25、50、75、100 mg/L處理豬小腸菌群組成存在顯著差異（P＜0.05），與ACC 100 mg/L處理豬小腸菌群組成差異最大，說(shuō)明ACC 100 mg/L處理對(duì)豬小腸菌群組成影響最大。

目前，16S rRNA測(cè)序的片段通常只有300～500 bp，大多只在科水平和屬水平得到較高可信度的注釋?zhuān)狙芯吭陂T(mén)水平和屬水平展示不同ACC SAEW噴霧處理豬小腸微生物群落的物種組成豐度。由圖13可知，ACC 0 mg/L時(shí)，豬小腸菌群主要由厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）構(gòu)成，兩者為豬小腸中常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)[40-41]。此外，Li Chao等[42]發(fā)現(xiàn)，中國(guó)萊蕪豬和市售三元雜交豬的腸道優(yōu)勢(shì)菌門(mén)也是厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)。當(dāng)ACC達(dá)到25 mg/L時(shí)，變形菌門(mén)相對(duì)豐度明顯下降，而厚壁菌門(mén)和疣微菌門(mén)（Verrucomicrobiota）相對(duì)豐度升高，說(shuō)明ACC 25 mg/L的SAEW能夠有效殺滅變形菌門(mén)細(xì)菌，但其對(duì)厚壁菌門(mén)的殺菌效果不如變形菌門(mén)；當(dāng)ACC大于25 mg/L后，厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度隨ACC的增加而減小，疣微菌門(mén)則大幅增加。這表明，適當(dāng)ACC的SAEW能夠有效殺滅豬小腸中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，但對(duì)疣微菌門(mén)的殺菌效果相對(duì)較差。

不同ACC SAEW噴霧處理豬小腸微生物屬水平變化如圖14所示，ACC 0 mg/L時(shí)，豬小腸菌群主要為乳球菌屬（Lactococcus）、漫游球菌屬（Vagococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）。Crespo-Piazuelo[43]和Gryaznova[44]等的研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬（Lactobacillus）和梭菌屬（Clostridium）為豬小腸優(yōu)勢(shì)菌屬。這與本研究結(jié)果存在差異。ACC 0 mg/L時(shí)，豬小腸中的嗜冷桿菌屬是肉類(lèi)冷凍貯藏過(guò)程中常見(jiàn)的菌屬[45]，可能由于樣品冷凍時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致其相對(duì)豐度增加。ACC達(dá)到25 mg/L時(shí)，SAEW對(duì)漫游球菌屬、不動(dòng)桿菌屬和嗜冷桿菌屬均具有較好的殺菌效果，其中不動(dòng)桿菌屬和嗜冷桿菌屬屬于變形菌門(mén)；而乳球菌屬和衣原體屬（Chlamydia）相對(duì)豐度明顯升高。

當(dāng)ACC達(dá)到50 mg/L后，乳球菌屬和鏈球菌屬相對(duì)豐度降低，說(shuō)明此時(shí)SAEW能夠有效殺滅豬小腸部分優(yōu)勢(shì)菌屬。ACC達(dá)到100 mg/L后，衣原體菌屬相對(duì)豐度達(dá)到75%左右，表明此時(shí)SAEW對(duì)衣原體菌屬的殺滅效果較弱。

3 結(jié) 論

本研究首先確定了直接浸泡、超聲浸泡和噴霧3 種除菌方式的最佳除菌條件。其中，直接浸泡（ACC 75 mg/L）120 s，減菌率為（99.75±0.06）%，與未經(jīng)除菌處理相比，肝素效價(jià)和廢水蛋白質(zhì)量濃度分別減少1.98 U/mL和4.09 mg/mL；超聲浸泡（ACC 50 mg/L、超聲功率75 W）120 s，減菌率為（99.77±0.04）%，與未經(jīng)除菌處理相比，肝素效價(jià)和蛋白質(zhì)量濃度分別減少2.80 U/mL和4.13 mg/mL；噴霧（AAC 75 mg/L、噴霧壓力110 MPa）270 s，減菌率為（99.76±0.03）%，與未經(jīng)除菌處理相比，肝素效價(jià)和蛋白質(zhì)量濃度分別減少0.84 U/mL和0.38 mg/mL。噴霧除菌效果好且對(duì)肝素效價(jià)和廢液蛋白含量影響小，選作豬小腸肝素提取前的除菌方式。

對(duì)不同ACC SAEW噴霧處理的豬小腸微生物進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，噴霧處理后豬小腸初始菌群組成改變，其中厚壁菌門(mén)（乳球菌屬、漫游球菌屬、鏈球菌屬）和變形菌門(mén)（不動(dòng)桿菌屬、嗜冷桿菌屬）相對(duì)豐度明顯降低，但衣原體屬相對(duì)豐度明顯增加。其中，乳球菌屬、鏈球菌屬、不動(dòng)桿菌屬和嗜冷桿菌屬中的部分菌種具有致病性，噴霧除菌可有效減少這些細(xì)菌對(duì)肝素的感染，提高豬小腸肝素安全性。鏈球菌屬、不動(dòng)桿菌屬和嗜冷桿菌屬在感染過(guò)程中能夠分泌蛋白酶，降解宿主組織蛋白，噴霧除菌處理能夠有效殺滅這幾種細(xì)菌，進(jìn)而有效減少微生物對(duì)豬小腸肝素廢水中蛋白質(zhì)的降解。本研究可為SAEW在豬小腸除菌與肝素提取中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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收稿日期：2024-09-26

基金項(xiàng)目：黑龍江省省屬科研院所科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（CZKYF2024-1-C010）；馬鈴薯淀粉加工副產(chǎn)物資源化技術(shù)研發(fā)項(xiàng)目（SKY20210601）；家畜小腸高值化加工關(guān)鍵技術(shù)開(kāi)發(fā)及產(chǎn)業(yè)化示范項(xiàng)目（GA21B015）

第一作者簡(jiǎn)介：全潤(rùn)（1999—）（ORCID： 0009-0002-6568-1559），男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail： quanrun321@126.com

*通信作者簡(jiǎn)介：韓建春（1973—）（ORCID： 0000-0002-3805-6793），男，教授，博士，研究方向?yàn)楦碑a(chǎn)物綜合利用。E-mail： hanjianchun@hotmail.com

劉丹怡（1990—）（ORCID： 0000-0001-7576-7634），女，講師，博士，研究方向?yàn)楦碑a(chǎn)物綜合利用。E-mail： liudanyi@126.com