苦杏仁粕抑制產腸毒素性大腸埃希菌的作用機制

摘 要：產腸毒素性大腸埃希菌（ETEC）是導致人畜腹瀉的主要病原菌.本文以苦杏仁粕為原料，將其1%的提取液與ETEC H10407共同培養，研究苦杏仁粕對ETEC生長、形態等的影響，并利用轉錄組測序技術，探究苦杏仁粕提取液對ETEC中基因的轉錄表達的作用.結果表明：1%的苦杏仁粕提取液可以顯著抑制ETEC的生長，破壞菌體細胞形態，減少了脂肪酸合成、蛋白質翻譯通路相關基因的表達，增加了細菌趨化性信號通路相關基因cheB、cheR，ABC轉運蛋白途徑中鐵元素轉運相關基因fecB、fecC、fecD等的表達.苦杏仁粕可能引發了ETEC的代謝紊亂，從而抑制了其生長.研究結果將為開發利用苦杏仁，用于ETEC的防治提供參考.

關鍵詞：苦杏仁粕； 產腸毒素性大腸埃希菌； 抑菌； 差異基因表達

中圖分類號：Q93； TS201.3

文獻標志碼： A

Mechanism of the inhibitory effect of bitter almond meal on

Enterohaemorrhagic Escherichia coli

ZHU Ya-nan， WU Wen-ting， Wang Xin-yi， ZHANG Lu， QIU Xue-hui，

WANG Hu-xuan，

YI Jian-hua*

（School of Food Science and Engineering， Shaanxi University of Science amp; Technology， Xi′an 710021， China）

Abstract：In human and farm animals，Enterohaemorrhagic Escherichia coli（ETEC） is the main pathogen causing diarrhea.In this study，bitter almond meal at 1% was co-cultivated with ETEC，to study the effect of bitter almond meal on ETEC in term of bacterial growth and morphology.Transcriptome sequencing technology was also used to explore the effect of bitter almond meal on the transcriptional expressions of genes in ETEC.This research found that 1% bitter almond meal could significantly inhibit the growth of ETEC，destroy bacterial cell morphology，inhibit the expressions of genes related to fatty acid synthesis and protein translation pathways，and promote expressions of genes related to bacterial chemotaxis signaling pathway such as cheB and cheR，and iron ion transport system in the ABC transport protein pathway such as fecB、fecC and fecD.Bitter almond meal probably caused metabolic disorders in ETEC，thereby inhibiting its growth.Results of this study will provide reference for the development and utilization of bitter almond meal to prevent and treat ETEC.

Key words：bitter almond meal；Enterohaemorrhagic Escherichia coli； antibacterial effect； differential gene expression

0 引言

苦杏仁是薔薇科山杏（Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.）、東北杏（Prunus mandshurica（Maxim.） Koehne）等的成熟種子，廣泛分布于我國的北方地區^[1，2].苦杏仁富含功能性成分，含有大量的脂肪酸酸類，且以油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸為主；苦杏仁苷、野黑櫻桃苷等苷類成分，水仙苷、異鼠李素等黃酮類物質，黃烷醇、黃酮醇等酚類化合物，還含有豐富的氨基酸、維生素和礦物質^[2].

苦杏仁是常見的傳統藥食同源中藥，《神農本草經》最早記載描述了苦杏仁的功效和用途^[2，3].中醫認為苦杏仁具有平喘、止咳等功效，可用來治療咳嗽、痰多等^[1-3].此外，已有研究表明苦杏仁或其有效成分具有抗炎、免疫調節、抗氧化、抗腫瘤以及預防心血管疾病等作用^[4-7].

研究表明苦杏仁中的有效成分還具有良好的抑菌作用.在Yigit等^[8]的研究中，苦杏仁的酒精提取物和水提取物均能抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等病原菌的生長.張濤等^[9]最新的實驗結果顯示：苦杏仁經過中性蛋白酶處理后，酶解多肽具有抑制大腸桿菌的作用.杏仁皮類黃酮提取物也可以顯著抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌^[10].柴玉霞^[11]提取了苦杏仁中的苦杏仁苷，抑菌實驗結果顯示苦杏仁苷對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有抑菌作用.

上述研究說明苦杏仁中含有多種抗菌成分，它們的抑菌機制有待闡明.苦杏仁提油后，副產物苦杏仁粕富含蛋白質、苦杏仁苷等物質，大量的苦杏仁粕尚未被開發利用^[12，13].本文以苦杏仁粕為研究對象，研究苦杏仁粕對ETEC的生長、形態等的影響，并利用轉錄組測序技術（RNA-seq），探究苦杏仁粕對于ETEC中基因的轉錄表達的作用，以期為綜合開發利用苦杏仁用于大腸桿菌的防治提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 菌株及原材料

ETEC H10407菌株，購自美國典型培養物保藏中心.實驗所用苦杏仁，購自承德市承德縣.

1.1.2 培養基和PBS溶液

LB液體培養基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L，調整pH 至7.0.

LB固體培養基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂粉15 g/L.

PBS溶液：磷酸氫二鉀0.24 g/L、磷酸氫二鈉1.44 g/L、氯化鈉8 g/L、氯化鉀0.2 g/L.

1.1.3 主要試劑及材料

磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉，德國Merck；氯化鈉、氯化鉀，德國SIGMA；胰蛋白胨、酵母提取物，英國OXOID；瓊脂粉、噻唑藍溴化四唑（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT），北京博奧拓達科技有限公司；無水乙醇，天津市天力化學試劑有限公司；乙酸異戊酯，福晨（天津）化學試劑有限公司；MillexD○R-GP過濾器（無菌），德國Merck；2.5%戊二醛溶液，陜西普羅安蒂生物科技發展有限公司.

1.1.4 主要儀器

KNIRPS升級精研磨機（SD-YM1503），中山市昌昊智能科技有限公司；奧斯達C57榨油機，中山市超巨浪科技有限公司；旋渦混勻儀（Vortex-2），上海滬析實業有限公司；超低溫冷凍儲存箱（DW-HL340），中科美菱低溫科技股份有限公司；真空冷凍干燥機（LGJ-12A），北京四環起航科技有限公司；臺式高速冷凍離心機（HR/T16M），湖南赫西儀器裝備有限公司；電熱式壓力蒸汽滅菌鍋（XFH-50CA），浙江新豐醫療器械有限公司；智能恒溫震蕩器（HNY-100B），天津歐諾儀器股份有限公司；臺式低速離心機（TDZ5-WS），湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；INFINITE 200 PRO酶標儀，瑞士TECAN.

1.2 實驗方法

1.2.1 苦杏仁粕的制備

利用榨油機對苦杏仁進行壓榨提油，獲得苦杏仁粕，并將苦杏仁粕研磨粉碎， -20℃密封保存.

1.2.2 苦杏仁粕粉提取液的制備

將1 g苦杏仁粕粉溶于10 mL PBS中，循環三次震蕩、超聲（100 Hz，2 min）， 1 500 r/min離心5 min，將上清液過濾除菌，得到苦杏仁粕的PBS提取液，并將其稀釋到1%，以Alm表示.

1.2.3 ETEC H10407的培養

挑取ETEC H10407菌落，接種到LB液體培養基，37 ℃恒溫培養24 h后，進行擴大培養，即37 ℃、 100 rpm 搖床恒溫培養16 h.

1.2.4 Alm對于ETEC H10407生長曲線的影響

將ETEC菌液2 500 r/min離心5 min，移去上清液，添加PBS懸浮細菌沉淀，并在650 nm波長處， 將懸浮液的吸光度值（Optical Density， OD值）調至為1，梯度稀釋1 000倍，與Alm樣品按照1∶1混合均勻，添加到96孔板中，每個樣品三個重復，PBS作為對照組，在37 ℃、650 nm條件下，每間隔10分鐘， 連續測量OD值12 h.實驗獨立重復三次.以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制ETEC H10407的生長曲線.

1.2.5 Alm與ETEC H10407共孵育8 h后的菌落數

依照上述方法，將稀釋菌液與Alm樣品37 ℃恒溫孵育8 h，先稀釋1倍，再進行梯度稀釋，并進行涂布實驗，每個涂布梯度三個重復，對照組為PBS， 37 ℃培養8 h，進行菌落計數.實驗獨立重復三次.最后繪制Alm與PBS每毫升所含有的菌落數（log（CFU/mL））的柱狀圖.

1.2.6 MTT檢測

依照上述方法，將稀釋菌液與Alm樣品混合均勻，37 ℃恒溫孵育，每個樣品三個重復，PBS為陰性對照組.4 h、8 h后，將孵育液移入96孔板中，添加10 μL MTT染液，37 ℃孵育15 min，在490 nm測量OD值.實驗獨立重復三次.

1.2.7 Alm對ETEC表觀形態的影響

參考Ambrosio等^[14]方法，并做適當修改，利用掃描電鏡（SEM）觀察ETEC H10407表觀形態的變化.將Alm與稀釋菌液1∶1混合混勻，PBS為對照組，37 ℃、100 rpm 搖床恒溫培養 4 h、8 h后， 4 000 r/min離心10 min， PBS懸浮沉淀兩次， 2.5%戊二醛溶液4 ℃固定過夜，分別以30%、50%、70%、90%、100%的乙醇以及乙酸異戊酯對細胞進行連續脫水，冷凍干燥后，將細菌鋪在粘有導電膠的掃描電鏡載物臺上，并在真空環境濺射鍍金，最后用SEM在10.00 kv條件下進行表觀形態觀察.

1.2.8 基因轉錄的表達變化檢測

將Alm樣品與稀釋菌液依照1∶1混合混勻，以PBS為對照組，37 ℃、100 rpm 搖床恒溫培養8 h后，將培養菌液4 ℃、10 000 g離心20 min，移除上清后，PBS懸浮沉淀， 4 ℃、 10 000 g離心10 min，獲得菌體沉淀.實驗設置四個獨立樣本.轉錄組測序委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成，并完成測序數據質控、表達量分析、表達量差異分析、基因集分析.

1.3 數據處理

利用SPSS 27對實驗數據進行單因素方差分析（ANOVA），以均值±標準差表示，并用“*”表示實驗組與對照組之間有顯著差異，*：P lt; 0.05；**：P lt; 0.01；***：P lt; 0.001.使用Origin 2024軟件繪圖.

2 結果與討論

2.1 Alm對ETEC H10407生長曲線的影響結果分析

ETEC H10407與Alm、PBS共同孵育的生長曲線如圖1所示.從圖中可以看出，PBS組的ETEC H10407的生長呈現“S”型，而Alm組的ETEC H10407的生長較為緩慢，在共同孵育的中后期，兩組的OD值差值逐漸增大，表明Alm對ETEC H10407的生長具有顯著的抑制性.

2.2 Alm與ETEC H10407共孵育8 h后的菌落量

從圖2所示的菌落計數結果可知：在共同孵育8 h后，PBS組log（CFU/mL）值為9.21，Alm組log（CFU/mL）值為8.22，Alm顯著抑制了ETEC的生長（P lt; 0.001）.

2.3 MTT測試

如圖3（a）所示，共同孵育4 h、8 h后，PBS組的顏色分別呈現棕色、紫黑色，Alm組的顏色分別呈現黃色、淺綠色.

OD值的統計結果顯示，在孵育4 h后，PBS組的OD值是0.48，Alm組的OD值是0.17（如圖3（b）所示）；孵育8 h后，PBS組的OD值是1.28，Alm組的OD值是0.41（如圖3（c）所示）；Alm組的OD值均顯著低于PBS組的OD值（Plt;0.01），實驗結果說明Alm具有顯著的抑菌效果.

2.4 Alm對ETEC H10407表觀形態的影響

ETEC與PBS共孵育4 h、8 h后，細菌形態完整，無破損、菌體呈棒桿狀 （圖4）.ETEC與Alm共孵育4 h后（如圖4（a）所示），菌體形態近乎完整，仍呈棒桿狀，但是外表出現了破損；與Alm共孵育8 h后（如圖4（b）所示），菌體出現了不規則破裂.

2.5 總體樣本主成分分析

樣本RNA結果質量顯示（表1）：實驗組、對照組的Clean Q20的百分比均在98%以上，Clean Q30的百分比均在96%以上，所得RNA質量符合要求，可進行后續實驗.

主成分分析結果顯示（圖5），第一主成分（PC1）的貢獻率是61.14%，第二主成分（PC2）的貢獻率是10.13%，Alm組和Neg組（即PBS組）樣本分別集中在PC1軸方向的不同區域，兩組的基因表達主成分存在明顯的差異.

2.6 差異基因表達分析

在基因表達量差異分析中，將基因在兩組樣本間表達量差異的倍數變化值，即FC值，設置為＞2，P-Value＜0.05，進行統計分析，并繪制了基因表達量差異火山圖（圖6）.相對于PBS組（Neg），Alm組顯著上調的基因有446個，顯著下調的基因533個.

2.7 差異表達基因的GO功能富集

對Alm、PBS兩組樣本的差異表達基因進行GO功能富集.差異表達基因主要集中生物過程（biological process）、分子功能（molecular function）以及細胞組分（cellular component）.與PBS組比較，在前20條GO途徑中，Alm組上調基因有19條顯著富集在生物過程，1條顯著富集在分子功能（如表2所示）.Alm組下調基因有12條顯著富集在生物過程，5條顯著富集在細胞組成，3條顯著富集在分子功能（如表3所示）.

2.8 差異基因的KEGG功能富集

Alm VS PBS上調基因有408個，KEGG途徑17條，主要包括ATP結合盒式（ABC）轉運蛋白、鐵載體非核糖體肽的生物合成、半乳糖代謝、雙組分系統、氮素代謝作用等途徑（如圖7所示）. Alm VS PBS下調基因組中的差異基因有515個，KEGG途徑22條，主要包括核糖體，脂肪酸合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸代謝，嘌呤代謝（如圖8所示）.主要差異基因如表4所示.

在大腸桿菌的趨化性信號通路中，CheA、CheB、CheR、CheW、CheY、CheZ等六種細胞質蛋白處理感覺信號，并將信號傳遞給鞭毛馬達，調節細菌的趨化運動^[15]. 其中，CheY控制鞭毛馬達方向的切換，CheB、 CheR控制化學受體的適應.在本研究中，Alm處理組的cheB、cheR基因表達的上調（如表4所示），是否引發了ETEC趨化性的調節或反應，有待后續深入研究.

在ABC轉運蛋白途徑中，fecB、fecC、fecD、fepD、fepG、fepC、fhuB、fhuC、fhuD等基因顯著上調（如表4所示），而Fec、Fep、Fhu等蛋白均參與了大腸桿菌的鐵離子的轉運^[16].檸檬酸介導的鐵離子轉運系統， FecA為外膜蛋白，FecB是周質蛋白，FecC和FecD是細胞質膜蛋白，以及FecE是一種ATP結合蛋白，FecA通過外膜運輸檸檬酸鐵，FecBCDE通過細胞質膜運輸鐵離子^[17]. 此外，FecB還可以結合Al³⁺、Ga³⁺等三價金屬離子，以及低濃度的Mg^2+[18]. 在本研究中，ABC轉運蛋白途徑相關基因的表達上調，可能是Alm的抑制作用引起了細菌金屬元素代謝的紊亂.前人的研究發現柿子單寧抑制金黃色葡萄球菌生長時，也同樣增加了鐵元素轉運相關基因的表達^[19].

Alm 處理組下調的主要基因fabA、fabB、fabD、fabF、rpsB、rpsG、rpsJ、rpsQ、rpmF、rpmJ等（如表4所示）.大腸桿菌中的II型脂肪酸合成酶（FAS），由FAB簇組成，含有FabA、FabB、FabD、FabF等蛋白，負責從頭合成脂肪酸，丙二酰ACP隨后對脂肪酸進行延伸^[20].脂肪酸可為大腸桿菌提供碳源、能源^[21].FabA、FabB等還參與大腸桿菌不飽和脂肪酸的生物合成，細菌膜雙層磷脂中飽和、不和脂肪酸的相對水平調節膜的流動性^[22，23].在本研究中，fabA、fabB、fabD等脂肪酸合成基因顯著下調，提示脂肪酸的合成可能受到了抑制. 在蛋白質的合成中，核糖體是其翻譯的主要場所^[24].rpsB、rpsG、rpsJ、rpsQ等30S核糖體蛋白基因和rpmF、rpmJ等50S核糖體蛋白基因表達的下調，表明與Alm共孵育后，ETEC核糖體的翻譯能力削弱，蛋白質的合成受到阻礙，從而影響了細菌的生長與繁殖.

3 結論

本文探究了苦杏仁粕抑制ETEC生長的作用機制，發現1%的苦杏仁粕提取液能顯著抑制ETEC的生長，破壞菌體細胞形態， 減少了脂肪酸合成、蛋白質翻譯通路相關基因的表達，增加了細菌趨化性信號通路相關基因、ABC轉運蛋白途徑中鐵元素轉運相關基因的表達.苦杏仁粕可能引發了ETEC的代謝紊亂，從而抑制了其生長.研究結果可以為綜合開發利用苦杏仁，用于大腸桿菌的防治提供理論參考和依據.

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【責任編輯：陳 佳】