HE基因受體結合域變異對牛冠狀病毒感染的影響

摘 要： 為研究HE基因受體結合域變異對牛冠狀病毒（BCoV）感染的影響，構建了pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428重組質粒。三種重組質粒分別轉染至HCT-8細胞，然后感染NX-2021-B2-HE424分離株通過RT-qPCR檢測病毒mRNA在吸附、內化和復制階段的表達水平以及通過TCID50檢測胞內和胞外的病毒滴度。結果顯示，pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428三種重組質粒均能在HCT-8細胞中表達。與pEGFP-HE424相比，HE基因受體結合域缺失或插入不影響病毒的吸附、內化、復制及胞內病毒滴度；HE基因受體結合域缺失降低了BCoV胞外病毒滴度；HE基因受體結合域插入不影響BCoV胞外病毒滴度。本研究通過構建僅受體結合域變異的三種HE基因的重組質粒在HCT-8細胞上探究了其對牛冠狀病毒感染的影響，為研究牛冠狀病毒的感染機制提供了數據支撐。

關鍵詞： 牛冠狀病毒；HE基因；受體結合域變異；病毒感染

中圖分類號：

S852.659.6"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1336-08

收稿日期：2024-05-07

基金項目：寧夏回族自治區重點研發計劃（2021BEF03005）；青海省科技計劃項目（2022-NK-118）；西藏自治區科技計劃項目（XZ202101YD0001C）

作者簡介：姜慧華（1997-），女，壯族，廣西貴港人，碩士生，主要從事分子病原學與免疫研究，E-mail：3462350283@qq.com

*通信作者：郭抗抗，主要從事分子病原學與免疫學研究，E-mail：guokk2007@nwsuaf.edu.cn

Effect of HE Gene Receptor Binding Domain Variation on Bovine Coronavirus Infection

JIANG" Huihua， ZHAO" Long， GUO" Kangkang^*

（College of Veterinary Medicine， Northwest Aamp;F University， Yangling 712100，" China）

Abstract： To study the effect of HE gene receptor binding domain variation on bovine coronavirus （BCoV） infection， recombinant plasmids pEGFP-HE420， pEGFP-HE424 and pEGFP-HE428 were constructed. Three recombinant plasmids were transfected into HCT-8 cells respectively and then infected with NX-2021-B2-HE424 to detect viral mRNA expression levels at adsorption， internalization and replication stages by RT-qPCR， and to detect viral intracellular and extracellular titers by TCID50. The results showed that pEGFP-HE420， pEGFP-HE424 and pEGFP-HE428 could be expressed in HCT-8 cells. Compared with pEGFP-HE424， deletion or insertion of HE gene receptor binding domain did not affect the adsorption， internalization， replication and intracellular virus titer. Deletion of HE gene receptor binding domain decreased extracellular titers of BCoV. HE gene receptor binding domain insertion did not affect the BCoV extracellular virus titer. In this study， three recombinant plasmids of HE genes with only receptor binding domain variation was constructed to explore its effect on bovine coronavirus infection in HCT-8 cells， providing data support for the study of the infection mechanism of BCoV.

Keywords： bovine coronavirus; HE gene; receptor binding domain vibration; viral infection

*Corresponding author：" GUO Kangkang， E-mail：guokk2007@nwsuaf.edu.cn

牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCoV）是造成犢牛腹瀉、成年牛冬季痢疾以及各年齡段牛呼吸道疾病的重要病原體，給養牛業的發展造成了重大的經濟損失^［1］。BCoV屬于冠狀病毒科β冠狀病毒屬A系，單股正鏈RNA病毒，其基因組長度為27 kb～32 kb，是目前已知的最大的RNA病毒^［2］。根據致病特點，可將BCoV分為腸道型和呼吸道型^［3］。

BCoV有5種結構蛋白：核衣殼蛋白、跨膜蛋白、纖突蛋白（spike protein，S蛋白）、小衣殼蛋白和血凝素酯酶蛋白（hemagglutinin-esterase，HE蛋白）^［4］。冠狀病毒屬成員的結構蛋白大多數由除HE蛋白外的其他4種構成，但β冠狀病毒屬A系成員都具有HE蛋白。HE蛋白單體具有雙模塊結構，主要由兩端的膜近端結構域和酯酶結構域以及中間的凝集素結構域構成^［5-6］。凝集素結構域和酯酶結構域對病毒進入和釋放有重要作用^［7］。凝集素結構域具有血凝活性和受體結合活性，可以凝集小鼠紅細胞，也可以結合宿主細胞上的唾液酸受體，因此HE蛋白被視作除S蛋白外的第二個起始感染的第二附著蛋白^［8-9］。酯酶結構域具有乙酰酯酶活性，可以破壞受體的酶活性，移除細胞表面受體，利于病毒的釋放，從而更快地生成子代病毒^［7］。

凝集素結構域凝集素結構域由6個表面環組成，R1、R2、R3、R4和RBS枝接在凝集素結構域的β-三明治核心上，另一個環則來自酯酶結構域，受體結合域就位于R3環上^［10］。424 aa的HE基因其R3環為207～219位氨基酸，“FLSN”為其受體結合域，420 aa的HE基因在208～211位缺失了“NGKF”，428 aa的HE基因在212～215位插入了“KATV”（圖1）。目前研究報道的BCoV毒株其HE蛋白由424個氨基酸編碼^［11-12］，但近年來發現HE基因受體結合域發生了缺失或插入，這使得HE蛋白由420或428個氨基酸編碼。2020年，中國報道了一種新的BCoV變體，在其HE基因中插入了12個核苷酸，導致HE基因的受體結合域增加了4個氨基酸，即“KATV”^［13］。美國2022年發表的文獻報道了BCoV的HE基因受體結合域“KATV”的插入以及“NGKF”的缺失，但試驗表明HE蛋白仍然具有酯酶活性以及受體結合能力^［14］。

本實驗室在寧夏回族自治區某養牛場的鼻拭子樣本中檢測到BCoV，通過蝕斑純化分離純化得到BCoV分離株。經全基因組測序發現，其中兩株BCoV的HE基因的受體結合域也發生了如上所述的變異，即以NX-2021-B2-HE424為對照，NX-2021-B1-HE420的HE基因受體結合域發生了“NGKF”的缺失，NX-2021-B3-HE428的HE基因受體結合域發生了“KATV”的插入。HE基因受體結合域變異對病毒感染性的影響在BCoV中尚未見報道。因此，根據本實驗室保存的NX-2021-B2-HE424的HE基因序列及受體結合域發生的變異，分別構建了pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428重組質粒，并將三種重組質粒分別轉染至HCT-8細胞然后感染病毒以探究HE基因受體結合域變異對病毒吸附、內化、復制和釋放過程的影響。

1 材料與方法

1.1 病毒株、細胞、質粒

BCoV毒株NX-2021-B1-HE420、NX-2021-B2-HE424和NX-2021-B3-HE428分離自2021年寧夏地區發生腹瀉牛的鼻拭子樣本；HCT-8細胞、真核表達載體pEGFP-N1由西北農林科技大學動物醫學院獸醫公共衛生實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器

DNA Marker，艾科瑞公司產品; 2×Prime STAR Max DNA Polymerase、限制性核酸內切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ，TaKaRa公司產品；T4 DNA連接酶、TurboFect transfection reagent，賽默飛公司產品；RIPA強裂解液、超敏ECL化學發光試劑盒，Biosharp公司產品；預染蛋白Marker（10～180 ku），Dining公司產品；HRP標記山羊抗鼠IgG（H+L）、GAPDH Antibody， ImmunoWay公司產品；蛋白質凝膠電泳儀，Bio-Rad公司產品。

1.3 引物設計和合成

利用Primer 5軟件設計上、下游引物，并在合適位置加入酶切位點，送西安擎科生物公司合成。內參GAPDH基因（GenBank登錄號：NM_002046.7），N基因（GenBank登錄號：NW711287.1）。引物序列見表1。

1.4 總RNA的提取、反轉錄及PCR擴增

將培養至24 h的病毒液NX-2021-B1-HE420和NX-2021-B2-HE424分別收集0.2 mL至離心管中，采用Trizol法提取總RNA，立即反轉錄合成cDNA。HE-F和HE-R為上下游引物擴增HE420和HE424基因全長；利用HE-F、HE-R、Lig-HE-F、Lig-HE-R引物進行融合PCR擴增HE428基因全長。PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，對陽性產物進行膠回收純化。

1.5 重組質粒的構建及鑒定

將真核表達載體pEGFP-N1 和“1.4”中的膠回收產物進行雙酶切，經電泳后再次膠回收純化。利用T4 DNA連接酶將回收片段與線性化的pEGFP-N1載體進行連接。連接產物用大腸桿菌DH5α感受態細胞進行轉化。挑取單克隆進行菌液PCR鑒定。將陽性菌液擴大培養提取質粒，并對重組質粒進行雙酶切鑒定，重組質粒送至西安擎科生物公司測序。

1.6 重組質粒表達的Western blot鑒定

HCT-8細胞鋪至12孔板中，待細胞密度生長至60%～70%，用Turbofect分別將重組質粒pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428轉染至HCT-8細胞，同時以pEGFP-N1為陰性對照，未轉染細胞為空白對照，置于細胞培養箱中培養。轉染24 h后收取細胞樣品冰上裂解后并煮沸制備蛋白樣。進行100 g·L^-1 SDS-PAGE電泳；濕轉法轉至PVDF膜；用50 g·L^-1脫脂奶粉室溫膜孵育3 h；用GFP標簽抗體（1∶8 000）及鼠抗GAPDH抗體（1∶12 000）為一抗分別孵育1 h；用HRP標記的山羊抗鼠IgG（1∶12 000）為二抗室溫孵育1 h；用ECL化學發光顯色試劑盒顯色，每次孵育結束用TBST清洗10 min，清洗3遍。

1.7 檢測HE基因受體結合域變異對病毒感染的影響

1.7.1 檢測HE基因受體結合域變異對病毒吸附的影響

1.7.1.1 用TurboFect Transfection Reagent轉染質粒pEGFP-N1、pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428至HCT-8細胞。轉染24 h后，感染NX-2021-B2-HE424（MOI=1）。

1.7.1.2 置于4 ℃吸附1 h，然后用預冷的PBS清洗未吸附的病毒粒子，加入Trizol收取細胞樣品用RT-qPCR檢測病毒mRNA的表達水平。

1.7.1.3 熒光定量PCR反應體系為2×Fast qPCR Master Mixture（Green） 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，dd H2O 7 μL，模板2 μL。反應條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環；熔解曲線為機器默認。N基因和GAPDH基因引物見表1。

1.7.2 檢測HE基因受體結合域變異對病毒內化的影響

轉染及感染病毒步驟同“1.7.1.1”，病毒感染劑量為MOI=1，4 ℃吸附1 h，用預冷的PBS清洗3次，加入2% FBS DMEM，置于37 ℃培養1 h，用檸檬酸鹽緩沖溶液（pH3.0）和PBS交替清洗3次，加入Trizol收取樣品用RT-qPCR檢測病毒mRNA的表達水平。

1.7.3 檢測HE基因受體結合域變異對病毒復制的影響

轉染及感染病毒步驟同“1.7.1.1”，病毒感染劑量為MOI=1，37 ℃吸附1 h，然后用PBS清洗，加入2% FBS DMEM，置于37 ℃培養7 h，PBS清洗3次，加入Trizol收取樣品檢測病毒mRNA的表達水平。

1.7.4 檢測HE基因受體結合域變異對病毒釋放的影響

1.7.4.1 轉染及感染病毒步驟同“1.7.1.1”，病毒感染劑量為MOI=1，37 ℃吸附1 h，然后用PBS清洗，加入2% FBS DMEM，置于37 ℃細胞培養箱培養至24 h。

收集24 h的培養液，然后PBS清洗細胞3次，用胰酶消化后加入與收集的培養液等體積的2% FBS DMEM吹打細胞，收集細胞混合液。培養液和細胞混合液經一次凍融后，離心除去細胞碎片，分別收集胞外上清和胞內上清。將胞外上清和胞內上清按梯度稀釋接至96孔板，測定其TCID50。

1.7.4.2 通過間接免疫熒光法測定TCID50，即4%多聚甲醛孵育細胞10 min；

1% Triton X-100孵育10 min；50 g·L^-1脫脂奶粉室溫孵育1 h；用自制的兔源BCoV N蛋白多克隆抗體（1∶100）為一抗室溫孵育1 h；Coralite488-conjugated goat anti-rabbit IgG（H+L）（1∶800）為二抗室溫避光孵育1 h；用DAPI進行染核10 min，每次孵育完成后均用PBS清洗3遍。置于倒置熒光顯微鏡下記錄發熒光孔數，按Reed-Muench法計算TCID50。

2 結 果

2.1 重組質粒的構建

由于本研究中的NX-2021-B3-HE428毒株其HE基因序列除受體結合域不同于NX-2021-B1-HE420和NX-2021-B2-HE424，還存在個別氨基酸突變，不能以之為模板，故采用融合PCR法擴增本研究的HE428基因全長。用普通PCR法成功擴增出基因HE428的前段630 bp和后段647 bp（圖2A）。用普通PCR法及融合PCR法成功擴增出約1 263 bp的HE420全長、約1 275 bp的HE424全長和約1 287 bp的HE428全長（圖2B）。對重組質粒pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428以及空質粒pEGFP-N1進行雙酶切鑒定，結果顯示重組質粒均出現了符合預期大小的目的條帶和線性化載體（圖2C）。對重組質粒進行雙向測序驗證，顯示插入序列除受體結合域有所變異外其余序列與NX-2021-B2-HE424分離株的HE基因序列一致，無堿基突變，說明重組質粒pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428構建成功。

2.2 HE基因表達的Western blot結果

將重組質粒轉染HCT-8細胞24 h后，用Western blot檢測HE基因的表達，如圖3所示，重組質粒pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428均在約75 ku處出現與預期相符的目的條帶，表明HE420、HE424和HE428蛋白在HCT-8細胞中成功表達。

2.3 HE基因受體結合域變異對病毒吸附的影響

與對照組pEGFP-N1相比，pEGFP-HE420、pEGFP-HE424和pEGFP-HE428組的病毒mRNA水平無顯著差異（Pgt;0.05）。與pEGFP-HE424相比，pEGFP-HE420和pEGFP-HE428組的病毒mRNA水平無顯著差異（Pgt;0.05）。表明HE基因受體結合域缺失或插入對病毒吸附不產生影響（圖4）。

2.4 HE基因受體結合域變異對病毒內化的影響

如圖5所示，與對照組pEGFP-N1相比，pEGFP-HE420和pEGFP-HE428對病毒的mRNA表達水平顯著下降（Plt;0.01）；pEGFP-HE424對病毒的mRNA表達水平極顯著下降（Plt;0.001）。與pEGFP-HE424相比，pEGFP-HE420和pEGFP-HE428組的病毒mRNA水平無顯著差異（Pgt;0.05）。表明HE基因受體結合域缺失或插入不影響病毒內化。

2.5 HE基因受體結合域變異對病毒復制的影響

與對照組pEGFP-N1相比，pEGFP-HE420、pEGFP-HE424、pEGFP-HE428對病毒的mRNA表達水平無顯著差異（Pgt;0.05）。與pEGFP-HE424相比，pEGFP-HE420和pEGFP-HE428組的病毒mRNA水平無顯著差異（Pgt;0.05）。這表明HE基因受體結合域缺失或插入對病毒復制不產生影響（圖6）。

2.6 HE基因受體結合域變異對病毒釋放的影響

結果如圖7a所示，與對照組pEGFP-N1相比，pEGFP-HE420、pEGFP-HE424、pEGFP-HE428對病毒的胞內病毒滴度無顯著差異（Pgt;0.05）。與pEGFP-HE424相比，pEGFP-HE420和pEGFP-"" HE428組的胞內病毒滴度無顯著差異（Pgt;0.05）。表明了HE基因受體結合域缺失或插入對BCoV胞內病毒滴度不產生影響。

結果如圖7b所示，與對照組pEGFP-N1相比，pEGFP-HE420對病毒的胞外病毒滴度無顯著差異（Pgt;0.05）；pEGFP-HE424和pEGFP-HE428對病毒的胞外病毒滴度有顯著差異（Plt;0.05）。與pEGFP-HE424相比，pEGFP-HE420組的胞外病毒滴度有極顯著差異（Plt;0.01），表明HE基因受體結合域缺失可降低胞外病毒滴度；pEGFP-HE428組的胞外病毒滴度無顯著差異（Pgt;0.05），表明HE基因受體結合域插入不影響胞外病毒滴度。

3 討 論

BCoV主要感染牛，但也存在跨物種感染的可能性^［15-17］，還與人類冠狀病毒密切相關。從一名兒童腹瀉樣本中分離得到的冠狀病毒其S基因和HE基因與BCoV的核苷酸同源性高達99%，甚至比人類冠狀病毒OC43的相關性更密切，因此推測人類樣本中分離的冠狀病毒可能來源于BCoV^［18］，提示BCoV對人類公共衛生安全具有重要意義。

重組事件對病毒基因組擴大和病毒進化具有重要意義^［19］，不少研究表明BCoV的HE基因常常發生重組事件，可能對病毒感染和混合感染產生影響，導致更復雜的冠狀病毒譜系出現^［20-22］。Keha等^［11］認為HE基因重組BCoV毒株已經在中國奶牛中廣泛傳播，因為從犢牛腹瀉糞便樣本中分離到10株HE基因重組BCoV毒株，且分離的樣本地理距離較遠。

盡管HE基因在BCoV發病機制中的確切作用尚不清楚，但在其他冠狀病毒中研究表明HE基因會影響病毒感染。人冠狀病毒OC43中，HE蛋白缺失或HE蛋白乙酰酯酶活性失活會抑制感染性病毒顆粒的產生^［23］。Bakkers等^［10］報道人冠狀病毒OC43為適應在人呼吸道中的復制，HE蛋白凝集素結構域突變的漸進累積導致病毒喪失了受體結合功能，從而導致病毒粒子對基于唾液聚糖的簇狀受體決定因子的受體破壞活性降低。因此，我們猜測BCoV HE基因受體結合域變異不僅影響病毒的吸附，也可能影響病毒釋放。盡管我們在NX-2021-B2-HE424分離株上的吸附試驗結果表明HE基因受體結合域缺失或插入都不影響病毒的吸附，但在試驗中無法排除S蛋白作為病毒感染起始階段的第一個病毒黏附蛋白的作用，因此仍需更深入的研究確定HE基因受體結合域變異在病毒吸附中的作用。本研究中僅采用NX-2021-B2-HE424分離株（HE基因氨基酸長度為424）進行研究仍不足夠，需以最早報道的Mebus毒株（HE基因氨基酸長度為424）作為標準株從而使結論更準確和更具有說服力。

牛冠狀病毒HE蛋白包含凝集素結構域和酯酶結構域兩個重要的功能結構域，這兩個結構域對病毒進入和釋放有重要的作用^［7］。蛋白結構軟件預測表明HE基因受體結合域的插入和缺失導致其結構發生了變化，但并未使其喪失受體結合功能和酯酶活性，而這種變異是否引起其功能和活性上的差異目前未有研究能具體探清^［14］。本研究構建了三種僅受體結合域變異的HE基因真核表達載體，測定吸附、內化、復制和釋放階段的病毒mRNA表達水平和病毒滴度來初步研究HE基因受體結合域變異對病毒感染的影響，結果表明HE基因受體結合域缺失或插入對病毒吸附、復制、內化以及胞內病毒滴度不產生影響，但HE基因受體結合域缺失降低了胞外病毒滴度。本研究初步探索到HE基因受體結合域缺失對胞外病毒滴度產生影響，為BCoV的感染機制提供了數據支持。

4 結 論

通過構建三種僅受體結合域變異的牛冠狀病毒HE基因真核表達載體，測定吸附、內化、復制和釋放階段的病毒mRNA表達水平和病毒滴度，表明HE基因受體結合域缺失或插入對病毒吸附、復制、內化以及胞內病毒滴度不產生影響，但HE基因受體結合域缺失降低了胞外病毒滴度。

參考文獻（References）：

［1］ 沈思思， 陳 亮， 馮萬宇， 等. 牛冠狀病毒研究進展［J］. 動物醫學進展， 2022， 43（1）：112-116.

SHEN S S， CHEN L， FENG W Y， et al. Progress on bovine coronaviruse［J］. Progress in Veterinary Medicine， 2022， 43（1）：112-116. （in Chinese）

［2］ THOMAS C J， HOET A E， SREEVATSAN S， et al. Transmission of bovine coronavirus and serologic responses in feedlot calves under field conditions［J］. Am J Vet Res， 2006， 67（8）：1412-1420.

［3］ 羅鵬飛， 夏 俊， 張 凌， 等. 犢牛腹瀉病因分析及診斷防控綜述［J］. 草食家畜， 2023（5）：30-38.

LUO P F， XIA J， ZHANG L， et al. Analysis of the etiology of infectious calf diarrhea and its diagnosis， prevention and control［J］. Grass-feeding Livestock， 2023（5）：30-38. （in Chinese）

［4］ CHOULJENKO V N， LIN X Q， STORZ J， et al. Comparison of genomic and predicted amino acid sequences of respiratory and enteric bovine coronaviruses isolated from the same animal with fatal shipping pneumonia［J］. J Gen Virol， 2001， 82（Pt 12）：2927-2933.

［5］ ROSENTHAL P B， ZHANG X D， FORMANOWSKI F， et al. Structure of the haemagglutinin-esterase-fusion glycoprotein of influenza C virus［J］. Nature， 1998， 396（6706）：92-96.

［6］ ZENG Q H， LANGEREIS M A， VAN VLIET A L W， et al. Structure of coronavirus hemagglutinin-esterase offers insight into corona and influenza virus evolution［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2008， 105（26）：9065-9069.

［7］ SCHULTZE B， WAHN K， KLENK H D， et al. Isolated HE-protein from hemagglutinating encephalomyelitis virus and bovine coronavirus has receptor- destroying and receptor-binding activity［J］. Virology， 1991， 180（1）：221-228.

［8］ DE GROOT R J. Structure， function and evolution of the hemagglutinin-esterase proteins of corona- and toroviruses［J］. Glycoconj J， 2006， 23（1-2）：59-72.

［9］ G LINAS A M， BOUTIN M， SASSEVILLE A M J， et al. Bovine coronaviruses associated with enteric and respiratory diseases in Canadian dairy cattle display different reactivities to anti-HE monoclonal antibodies and distinct amino acid changes in their HE， S and ns4. 9 protein［J］. Virus Res， 2001， 76（1）：43-57.

［10］ BAKKERS M J G， LANG Y F， FEITSMA L J， et al. Betacoronavirus adaptation to humans involved progressive loss of hemagglutinin-esterase lectin activity［J］. Cell Host Microbe， 2017， 21（3）：356-366.

［11］ KEHA A， XUE L， YAN S， et al. Prevalence of a novel bovine coronavirus strain with a recombinant hemagglutinin/esterase gene in dairy calves in China［J］. Transbound Emerg Dis， 2019， 66（5）：1971-1981.

［12］ KO C K， KANG M I， LIM G K， et al. Molecular characterization of HE， M， and E genes of winter dysentery bovine coronavirus circulated in Korea during 2002-2003［J］. Virus Genes， 2006， 32（2）：129-136.

［13］ ABI K M， ZHANG Q， ZHANG B， et al. An emerging novel bovine coronavirus with a 4-amino-acid insertion in the receptor-binding domain of the hemagglutinin-esterase gene［J］. Arch Virol， 2020， 165（12）：3011-3015.

［14］ WORKMAN A M， MCDANELD T G， HARHAY G P， et al. Recent emergence of bovine coronavirus variants with mutations in the hemagglutinin-esterase receptor binding domain in U. S." cattle［J］. Viruses， 2022， 14（10）：2125.

［15］ HASOKSUZ M， ALEKSEEV K， VLASOVA A， et al. Biologic， antigenic， and full-length genomic characterization of a bovine-like coronavirus isolated from a giraffe［J］. J Virol， 2007， 81（10）：4981-4990.

［16］ ALEKSEEV K P， VLASOVA A N， JUNG K， et al. Bovine-like coronaviruses isolated from four species of captive wild ruminants are homologous to bovine coronaviruses， based on complete genomic sequences［J］. J Virol， 2008， 82（24）：12422-12431.

［17］ CHUNG J Y， KIM H R， BAE Y C， et al. Detection and characterization of bovine-like coronaviruses from four species of zoo ruminants［J］. Vet Microbiol， 2011， 148（2-4）：396-401.

［18］ ZHANG X M， HERBST W， KOUSOULAS K G， et al. Biological and genetic characterization of a hemagglutinating coronavirus isolated from a diarrhoeic child［J］. J Med Virol， 1994， 44（2）：152-161.

［19］ SIMON-LORIERE E， HOLMES E C. Why do RNA viruses recombine？［J］. Nat Rev Microbiol， 2011， 9（8）：617-626.

［20］ HE Q F， GUO Z J， ZHANG B， et al. First detection of bovine coronavirus in Yak （Bos grunniens） and a bovine coronavirus genome with a recombinant HE gene［J］. J Gen Virol， 2019， 100（5）：793-803.

［21］ BAHOUSSI A N， SHAH P T， GUO Y Y， et al. Evolutionary adaptation of bovine coronavirus （BCoV）：screening of natural recombinations across the complete genomes［J］. J Basic Microbiol， 2023， 63（5）：519-529.

［22］ 孫飛雁， 葉京飛， 魏 宇， 等. 吉林省肉牛冠狀病毒感染狀況調查及分析［J］. 畜牧獸醫學報， 2023， 54（2）： 673-682.

SUN F Y， YE J F， WEI Y， et al. Epidemiological investigation and analysis of bovine coronavirus in beef cattle in Jilin Province［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2023， 54（2）： 673-682. （in Chinese）

［23］ DESFORGES M， DESJARDINS J， ZHANG C S， et al. The acetyl-esterase activity of the hemagglutinin-esterase protein of human coronavirus OC43 strongly enhances the production of infectious virus［J］. J Virol， 2013， 87（6）：3097-3107.

（編輯 白永平）