豫農黑豬生長相關性狀的拷貝數變異全基因組關聯分析研究

摘 要： 旨在檢測豫農黑豬全基因組拷貝數變異（copy number variations，CNVs），鑒定豫農黑豬生長相關性狀候選基因。本研究收集了豫農黑豬2～5世代種群的生長相關性狀數據（包括體長、體高、胸圍、管圍、腿臀圍、背膘厚和眼肌深度），共807頭豬（母豬738頭，公豬69頭），體重范圍為95～105 kg。隨后采集該試驗群體耳組織樣本利用中芯一號50K SNP芯片進行基因分型，并使用PennCNV軟件對基因型數據進行CNV檢測，通過重疊CNV融合法構建拷貝數變異區域（copy number variable regions， CNVRs）圖譜。而后使用Plink軟件對生長相關性狀進行CNV的全基因組關聯分析（genome-wide association study， GWAS）。結果，在18條常染色體上共鑒定到1 432個CNVs，合并為232個CNVRs，其中CNV大小范圍為2.7 kb至2.2 Mb，CNVR大小范圍為4.5 kb至2.2 Mb，共覆蓋56.4 Mb，占常染色體基因組的2.50%。通過GWAS分析，發現1個CNV在全基因組水平上與胸圍性狀顯著相關，7個CNV在染色體水平上分別與胸圍、管圍和背膘厚性狀顯著相關，胸圍性狀中顯著性最高的CNV也與管圍性狀顯著相關。其中，位于17號染色體上的CLDN23基因與背膘厚顯著相關，推測其可能在肌肉發育或脂肪沉積中起重要調控作用。本研究結果為豫農黑豬基因組CNV的功能提供新見解，并為進一步分子標記輔助選擇在豫農黑豬新品種培育中提供了重要的理論支持。

關鍵詞： 豫農黑豬；生長性狀；拷貝數變異；全基因組關聯性分析（GWAS）

中圖分類號：

S828.2"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1110-10

收稿日期：2024-08-26

基金項目：國家重點研發計劃（2021YFD1301201）；河南高等學校重點科研項目（23A230012；25CY014）；河南省農業良種聯合攻關項目（2022020101）

作者簡介：吳嘉浩（2001-），男，河南駐馬店人，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：m17630413022@163.com；吳姿儀（1999-），女，河南駐馬店人，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail： W17746978907@163.com。吳嘉浩和吳姿儀為同等貢獻作者

*通信作者：李秀領，主要從事豬遺傳育種研究，E-mail：xiulingli@henau.edu.cn

Genome-wide Association Study of Copy Number Variation in Growth-Related Traits of

Yunong-Black Pigs

WU" Jiahao "WU" Ziyi "DOU" Tengfei "BAI" Liyao1， ZHANG" Yongqian^2，3， DONG" Lianhe^2，3，

LI Pengfei^2，3， LI Xinjian^1，4， HAN Xuelei1， LI Xiuling^1，2*

（1.College of Animal Science and Technology， Henan Agricultural University，

Zhengzhou 450046，" China;

2.Henan Xun County Swine Science and Technology Courtyard，

Hebi 456285，" China;

3.Henan Yifa Animal Husbandry Co.， Ltd， Hebi 456285，" China;

4.Hainan Academy of Agricultural Sciences， Sanya 572025，" China）

Abstract： This study aimed to detect genome-wide copy number variations （CNVs） in Yunong-black pigs and identify candidate genes associated to growth-related traits in this breed. Growth-related traits were collected from 807 Yunong-black pigs （738 sows and 69 boars） across four generations （2rd-5th generation）， with body weight range of 95 to 105 kg. The measured traits included body length （BL）， body height （BH）， chest circumference （CC）， cannon bone circumference （CBC）， legs buttocks circumference （LBC）， backfat thickness （BF）， and loin muscle depth （LMD）. Ear tissue samples from the experimental population were genotyped using the \"Zhongxin-1\"50K SNP chip， and CNV detection was performed using PennCNV software. The CNV regions （CNVRs） were identified by merging overlapping CNVs and genome-wide association analysis （GWAS） was conducted using Plink software to examine associations between CNVs and growth-related traits. A total of 1 432 CNVs were identified on 18 autosomes and merged into 232 CNVRs. The CNVs ranged in size from 2.7 kb to 2.2 Mb， while CNVRs spanned from 4.5 kb to 2.2 Mb， covering 56.4 Mb or 2.50% of the autosomal genome. GWAS identified one CNV was associated with CC at the genome-wide significance level， and seven CNVs showed suggestive associated with CC， CBC and BF. The CNV most strongly associated with CC also showed a strong association with CBC. Additionally， the CLDN23 gene on SSC17 was significantly associated with BF， suggesting its potential role in regulating muscle development or fat deposition. This study provides new insights into the functional implications of CNVs in the Yunong-black pig， and offering valuable theoretical support for implement molecular marker-assisted selection in Yunong-black pigs breeding programs.

Keywords： Yunong-black pigs; growth traits; copy number variation; genome-wide association study（GWAS）

*Corresponding author：LI Xiuling， E-mail：xiulingli@henau.edu.cn

豬生長性狀能直觀反映豬的生長發育情況，是生豬養殖業的重要經濟性狀。而豬的體尺性狀（如體長、體高、胸圍、管圍等）雖不作為主要目標性狀納入育種目標，但其會間接影響其他重要經濟性狀的選擇。生長性狀和體尺性狀都屬于中高遺傳力性狀，其遺傳機制復雜，由微效多基因調控^［1-4］。因此，研究這些性狀的遺傳機制和挖掘候選基因，可為豬遺傳改良提供新的分子標記，有助于豬生長和體尺性狀的遺傳解析。

近年來，隨著測序技術及分子生物學技術的不斷發展，全基因組拷貝數變異（copy number variations， CNVs）關聯研究在牛^［5］、羊^［6］、豬^［7］等家畜中的得到廣泛應用，并證實一些關聯CNV的基因或基因區域與家畜脂肪代謝^［8］和繁殖^［9］等密切相關。CNV是一種大小介于1 kb至數Mb不等的DNA片段的插入、缺失、重復等多位點變異，在基因組中廣泛分布且具有多態性和可遺傳性等特點，是通過多種機制影響基因表達和表型產生的一種分子標記，如基因結構的改變和調控元件或多態性喪失，可能具有重要生物學意義^［10-11］。CNV所覆蓋的核苷酸總數遠超過單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism， SNP）的總數，極大地豐富了基因組遺傳變異的多樣性^［12-13］。近年來，CNV在不同豬群中的研究逐漸增多且各物種基因組信息不斷完善，對CNV的研究也從最開始的人類疾病到現在的動植物的復雜性狀上。在豬的研究領域中，CNV的研究也有了一定的突破。

豬基因組中關于CNV的第一個記錄是由Fadista等^［14］首次使用定制的aCGH芯片，鑒定到在杜洛克豬染色體（Sus scrofa chromosome，SSC）4、7、14和17上的共37個拷貝數變異區域。Ramayo-Caldas等^［15］利用Porcine SNP 60K BeadChip對55頭伊比利亞豬與長白豬的雜交后代進行基因分型，并運用PennCNV、CnvPartition和GADA三個軟件分析雜交豬常染色體中的CNV，共鑒定到49個CNVR。此外，利用PennCNV軟件，Chen等^［16］對來自18個不同種群的1 693頭豬的常染色體CNV進行鑒定，共發現了565個CNV區域（CNV region， CNVR），占豬基因組的5.84%，并且識別出ANP32B、KIT和BSCL2等7個基因作為豬復雜性狀的潛在候選基因。

而后隨著鑒定到的CNVR數目越來越多，研究人員開始將鑒定到的CNV與特定的性狀結合分析。Wang等^［17］對豬的CNVs與肉質性狀進行全基因組關聯分析9（genome-wide association study， GWAS），最終確定了8個CNVRs與至少一種肉質性狀顯著相關。Qian等^［18］使用CNVnator軟件對安慶六白豬和杜洛克豬的重測序數據進行CNV分析，共發現881個CNVRs，并鑒定出DPF3、LEPR、MAP2K6、PPARA、TRAF6和NLRP4等基因與脂肪代謝、繁殖能力和抗逆性等性狀密切相關。Revilla等^［19］基于二代測序數據對豬的CNVR進行全基因組關聯分析，發現拷貝數變異區域CNVR 112 （GPAT2） 與生長性狀的遺傳變異有關。

豫農黑豬是通過中國優質地方豬南陽黑豬、萊蕪豬、二花臉豬與外來品種杜洛克豬雜交的新品種，兼具繁殖力高、耐粗飼、抗病力強及肉質優良等特性^［20-21］。為探究豫農黑豬生長相關性狀拷貝數變異并篩選相關性候選基因，本研究對807頭豫農黑豬的中芯一號50K SNP芯片進行CNV檢測，并進一步對豫農黑豬生長相關性狀進行CNV的全基因組關聯分析，鑒定與生長性狀相關基因的遺傳變異并確定候選基因，為豫農黑豬的分子標記育種提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究中的試驗動物選自河南省誼發牧業責任有限公司豫農黑豬育種場，共收集并采集了2～5 世代共807頭豫農黑豬的資源種群信息和耳組織樣本，其中母豬738頭，公豬69頭，體重范圍為95～105 kg。

1.2 試驗方法

在早晨時將空腹的豬只趕到電子籠稱重，待其平穩后進行性狀測定。根據Ogawa等^［22］的描述對體長（body length， BL）、體高（body height， BH）、胸圍（chest circumference， CC）、管圍（cannon bone circumference， CBC）、腿臀圍（legs buttocks circumference， LBC）、背膘厚（backfat thickness， BF）和眼肌深度（loin muscle depth， LMD）等7個生長相關性狀的表型進行測量。為了確定100 kg體重的BF，使用以下公式對原始數據進行校正^［23］：

BF=Measured backfat thickness+（100-Measured weight）×Measured backfat thickness（Measured weight+20）

將5 646條表型記錄進行均值、標準差、最小值、最大值、變異系數的統計，分析詳細描述見Wu等^［24］的研究。

1.3 樣本DNA提取及基因分型

使用天根生化科技（北京）有限公司的組織基因組 DNA 試劑盒從 807 頭豫農黑豬的耳組織樣本中提取基因組DNA，提取的DNA使用NanoDrop2000微量紫外分光光度計檢測樣本濃度及質量。保留光吸收比（A260 nm/A280 nm）在1.8和2.0之間，濃度≥50 ng·μL^-1的基因組DNA樣本。使用中芯一號 50K SNP芯片 （北京康普森生物技術有限公司，北京，中國）進行全基因組芯片分型。

1.4 全基因組拷貝數變異檢測

使用PennCNV軟件^［25］進行個體CNV的檢測，該軟件是基因SNP芯片數據開發的Perl程序免費軟件，適用于Illumina arrays、Affymetrix arrays以及其他高密度分型數據的CNV檢測。軟件運用隱馬爾可夫模型（hidden markov model，HMM）算法進行推斷。從Illumina BeadStudio軟件中導出log R比率（log R ratio，LRR）和B等位基因頻率（B allele frequency，BAF）信號強度數據。使用HMM模型的默認參數，通過整合LRR、BAF、群體等位基因頻率和SNP距離進行CNV的檢測。

設置LRR的標準偏差（standard deviation，SD）小于0.30，BAF值小于0.01，基因組波動因子（waviness factor value， WF）值小于0.05，檢測出的CNV必須包含3個或更多連續的SNP，以降低CNV檢測結果的假陽性率，最后在命令行中設置“-qcnumcnv 50”的參數，將任何檢測出大于50個CNV的樣本視為低質量樣本，將其剔除。最終，共641個樣本通過質量控制標準，用于后續的分析。

使用R包“HandyCNV”進行CNV的合并^［26］，根據重疊區域超過1 bp的原則，合并全部有交集的CNV并利用R軟件構建CNVR圖譜。每個CNVR在染色體的起始和終止位置作為圖譜各自染色體的起始和終止位置，分為3種狀態：“Loss”、“Gain”和“Mixed”（Loss：缺失；Gain：重復；Mixed：在CNVR中存在Gain和Loss類型）。

1.5 生長相關性狀拷貝數變異的全基因組關聯分析

使用Plink軟件進行關聯分析，用于檢測所研究性狀的CNV與表型之間的關聯，模型如下：

yc=Xb+e

其中 yc 是校正表型向量， b 是CNV的固定效應， X 是將表型與每一個CNV的固定效應關聯的矩陣， e 是隨機殘差效應向量。使用以下校正表型公式計算生長相關性狀：

yn=μ+CG+en

其中 yn 為第 n 個個體的表型值； μ 為均值； CG 為固定效應（contemporary group），包括：性別、出生年份和季節和日齡（其中BF性狀不考慮日齡）； en 為第 n 個個體的殘差，即校正后的表型值。

使用Bonferroni方法確定全基因組顯著性閾值（0.05/N），其中N代表CNV的數量。鑒于此嚴格的標準，本研究使用更寬松的閾值來檢測染色體水平的顯著性（1/N）^［27］。

利用Ensembl（http：//asia.ensembl.org/index.html）數據庫對顯著CNV區域進行基因注釋，之后通過GeneCards（https：//www.genecards.org/）等數據庫查詢基因功能，使用PigQTLdb在2023年12月27日發布的第52版數據庫（https：//www.animalgenome.org/QTLdb/release/52/），對基因組中先前確定的QTL進行了評估^［28］。

2 結 果

2.1 全基因組拷貝數變異與拷貝數變異區域檢測結果

使用PennCNV檢測了豫農黑豬18個常染色體中的CNV，共發現了1 432個通過質量控制的CNV（1 211個缺失、221個重復）。這些CNV按照重疊區域大于1 bp的原則的方式識別并合并CNVR，共鑒定出232個CNVR，其中21個Gain，179個Loss，32個Mixed類型。本研究檢測的CNV的大小范圍為2.7 kb至2.2 Mb，Gain類型CNV在SSC17上檢測到的最多，為70個，沒有在SSC18上檢測到Gain類型CNV。Loss類型CNV在SSC11上檢測到的最多，為167個，在SSC18上檢測到的最少，為12個。而CNVR的大小范圍為4.5 kb至2.2 Mb（圖1）。

2.2 拷貝數變異區域圖譜

表1和圖2總結了不同染色體上CNVR的分布。其中SSC4上CNVR覆蓋率最高（4.5%），而SSC7中的CNVR覆蓋率最低（1.0%）。CNVR的數量從5個（SSC17）到23個（SSC13）分布不等。本研究檢測到的CNVR總大小為56.4 Mb，約占豬常染色體基因組的2.50%。其中，Loss類型占比77%，Gain類型占比9%，Mixed類型占比14%。

2.3 生長相關性狀拷貝數變異的全基因組關聯分析

為進一步分析CNV在豫農黑豬中的功能，本研究對7個生長相關性狀進行了GWAS。其中，共確定了與生長相關性狀有關的1個全基因組（4.73×10^-5）CNV和7個染色體水平（9.47×10^-4）CNV（圖3）。其中，鑒定到的1個全基因組CNV與CC性狀相關，另外7個染色體水平顯著的CNV分別與CC、CBC和BF性狀相關。候選區域在SSC1、3、11、15和17上。其中，在CC性狀中檢測到位于SSC1上1∶157232630-157498487的區域內強相關的CNV，值得注意的是該CNV在CBC性狀中也表現顯著（表2）。而后對顯著CNV進行基因注釋，僅在與BF相關的SSC17上0.32 Mb～0.69 Mb定位到一個編碼蛋白基因CLDN23，并在PigGTEx^［29］平臺（https：//piggtex.farmgtex.org/）上發現該基因與BF性狀顯著相關（圖4）。

3 討 論

GWAS在揭示影響復雜性狀的常見SNP方面取得了顯著的進展^［30］，然而，大多數變異只能解釋小部分遺傳力，這種現象被稱為“遺傳力缺失”^［31］。為此，CNV作為遺傳多樣性的重要來源，可能為解釋GWAS無法檢測到的遺傳變異提供新的途徑，增加了與復雜經濟性狀相關的遺傳變異的識別，并闡明了不同畜禽中這些性狀的遺傳基礎^［32-35］。

3.1 全基因組拷貝數變異檢測

本研究使用嚴格的篩選標準來減少假陽性結果，最終在豫農黑豬的常染色體上鑒定到1 432個CNV。結果表明，CNV中Loss的數量遠多于Gain的數量（1 211個Loss、221個Gain）。這與Chen等^［16］使用Porcine SNP60 BeadChip進行CNV檢測到大約1 149個Loss和964個Gain。同樣Shi等^［36］利用Oula羊和Panou羊的重測序數據并通過CNVnator軟件在常染色體上檢測到1 788個Loss和1 232個Gain。而后本研究將所有的CNV合并，得到232個CNVR，約占豬常染色體基因組的2.50%。其中包括21個Gain、179個Loss、32個Mixed類型，這些CNVR的大小在4.5 kb至2.2 Mb之間。這個大小范圍與CGH陣列檢測的大小范圍（1.74～61.92 kb）有所不同，可能是由于豬的50K芯片中SNP的覆蓋率相對較低且分布不均勻所導致的^［10］。

3.2 拷貝數變異基因功能注釋

為進一步探究CNV與生長相關性狀之間的關系，本研究對豫農黑豬進行了基于CNV的GWAS，共確定了8個顯著CNV。在這些CNV中，發現了一些以前報道的與生長相關性狀有關的QTL（表2）。如在SSC1上與CBC和CC性狀顯著相關的CNV區域內，Ding等^［37］在158.31～162.19 Mb范圍內發現與BF性狀顯著相關的QTL。此外，Lee等^［38］基于大白豬和梅山豬的雜交后代，分析并使用111個遺傳標記進行基因分型，發現在SSC1上142.36～168.36 Mb區域存在兩個QTL與豬后腿構造密切相關，會對CBC性狀發育產生影響。在SS11上，Cassady等^［39］曾發現與乳頭數顯著相關的QTL，推測其可能在豬生長發育過程中對體長和體高起到調控作用，間接影響后代的生長性狀。在本研究中與CBC性狀相關的CNV區域內，Howard等^［40］曾在SSC3的104.93～106.74 Mb區域內發現與采食量顯著相關的QTL，而采食量又會影響諸如體高、體長等生長性狀。此外，在該顯著CNV區域Tribout等^［41］和Cherel等^［42］先后有研究表明，在96.79～113.64 Mb范圍內存在與皮下脂肪沉積相關的QTL，可能對BF性狀產生影響。在SSC15上，與BF性狀顯著相關的CNV區域（99.97～135.44 Mb）內，Liu等^［43］曾報道過與日增重有密切相關的QTL，而日增重會影響豬的脂肪沉積，進而對豬體重產生影響。而在SSC17上，Won等^［44］在該染色體0.44～13.25 Mb范圍內報道過與肌內脂肪含量高度相關的QTL，這可能影響BF性狀。

本研究對顯著CNV進行基因注釋，并定位到與BF相關的編碼蛋白基因CLDN23。CLDN23通過不依賴鈣的細胞黏附活性，在細胞間隙的緊密連接特異性閉塞中起主要作用。通過PigGTEx^［29］平臺對比基因在各組織中的表達量數據，本研究觀察到該基因在脂肪組織中的表達量較低，這可能影響它對BF的調控。截至目前，在豬上對CLDN23的研究較少，主要集中在人類疾病上，例如結腸癌和皮膚屏障修復^［45-47］。本研究對脂肪沉積的影響提供了新的見解，為進一步的遺傳改良和育種提供了新的思路。

4 結 論

本研究對豫農黑豬的生長相關性狀進行基因組CNV檢測、繪制CNVR圖譜和基于CNV的GWAS。本研究檢測了18個常染色體中的CNV，共發現1 432個CNV，大小范圍在2.7 kb至2.2 Mb，共合并為232個CNVR，大小范圍為4.5 kb至2.2 Mb，約占豬常染色體基因組的2.50%，其中，Loss類型占比77%，Gain類型占比9%，Mixed類型占比14%。GWAS共發現8個顯著CNV，其中在SSC1上1∶157232630-157498487的區域內檢測到與CC性狀極顯著相關的CNV，該CNV與CBC性狀也具有顯著相關性。在顯著CNV區域中，SSC17上0.32～0.69 Mb的區間定位到僅與BF相關的編碼蛋白基因CLDN23。本研究對于進一步研究CNV與豫農黑豬重要經濟性狀的關聯性有重要參考價值。

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（編輯 郭云雁）