豬流行性腹瀉疫苗研究進展

摘 要： 豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種傳染性腸道疾病，可造成豬群暴發腹瀉和初生仔豬大量死亡。2010年，高致病性的PEDV變異毒株出現并在全球范圍內傳播，已成為當前豬腹瀉病的主要病原之一，對全球養豬業造成巨大損失。疫苗免疫是防控PED的最主要措施。現有PED商品化疫苗以傳統滅活疫苗和弱毒疫苗為主。近年來，隨著基因工程技術的發展，亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗、重組活載體疫苗、轉基因植物疫苗和核酸疫苗等的研究也都取得了突破性進展。由于PEDV變異頻繁，不斷給疫苗研發帶來新的挑戰，高效的疫苗研發平臺及基因工程疫苗對未來PED防控至關重要。本文對PEDV的病原學特征和最新的疫苗研究進展進行了系統綜述，并展望未來的疫苗發展方向，以期為有效防控PED提供參考依據。

關鍵詞： 豬流行性腹瀉；豬流行性腹瀉病毒；滅活疫苗；弱毒疫苗；基因工程疫苗；核酸疫苗

中圖分類號：S8285.3;S852.659.6

文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1042-17

收稿日期：2024-05-27

基金項目：國家自然科學基金優秀青年科學基金（32122086）；國家自然科學基金青年科學基金（32402921）

作者簡介：鄔沛伶（2001-），女，湖南衡陽人，博士生，主要從事動物新型疫苗的研究，E-mail：p_p@webmail.hzau.edu.cn

*通信作者：劉青蕓，主要從事動物重大疫病流行病學與病原學、致病機制、疫苗研制等研究，E-mail：LIUQY@mail.hzau.edu.cn；王湘如，主要從事動物源性人獸共患病和動物重大疫病的病原學、致病機制、診斷和防控研究，E-mail：wangxr228@mail.hzau.edu.cn

Research Progress of Porcine Epidemic Diarrhea Vaccine for Pigs

WU" Peiling1， LI" Yixuan1， WANG" Haojie1， LI" Yafei1， LIU" Shaomeng1， LIU" Qingyun^1*， WANG

Xiangru^1，2*

（1.The Cooperative lmnovation Center for Sustainable Pig Production， College of Veterinary

Medicine， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070，" China; 2.State Key

Laboratory of Agricultural Microbiology， College of Veterinary Medicine， Huazhong

Agricultural University， Wuhan 430070，" China）

Abstract：" The porcine epidemic diarrhea （PED） is an infectious intestinal disease caused by porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）， which results in an outbreak of diarrhea in pigs and high mortality in newborn piglet. In 2010， a highly pathogenic mutant strain of PEDV emerged and spread globally， which has presently been one of the main pathogens of porcine diarrhea and caused large losses for the global swine industry. Vaccination is the primary measure for preventing and controlling PED. Currently， available commercial PED vaccines mainly consist of traditional inactivated and attenuated vaccines. With the development of genetic engineering technologies in recent years， significant advancements have been made in the study of subunit vaccines， virus-like particle vaccines， recombinant vector vaccines， transgenic plant vaccines， and nucleic acid vaccines. The frequent variations of PEDV continues to bring new challenges to the vaccine development. Therefore， efficient vaccine development platforms and engineering vaccines are crucial for future prevention and control of PED. This article provides a systematic review of the pathogenic characteristics of PEDV and the latest advancements in vaccine research， as well as prospects for future vaccine development， aiming to provide a reference for effective prevention and control of PED.

Keywords： porcine epidemic diarrhea （PED）; porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）; inactivated vaccine; attenuated vaccine; engineering vaccine; nucleic acid vaccines

*Corresponding authors：" LIU Qingyun，E-mail： LIUQY@mail.hzau.edu.cn; WANG Xiangru， E-mail： wangxr228@mail.hzau.edu.cn

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種急性、高度接觸性的傳染性腸道疾病。PEDV可感染各個年齡階段的豬，病豬臨床癥狀表現為腹瀉、嘔吐、脫水乃至死亡。其中，新生仔豬的感染情況最為嚴重，死亡率可達90%～100%^［1］。PEDV于1971年首次在英國發現，1978年在比利時分離出PEDV毒株，并將其命名為“CV777”，隨后疫情席卷歐洲。20世紀80年代，PEDV傳入中國，特別是自2010年以來，高致病性PEDV變異毒株引起了國內疫情大暴發，并表現出發病率高、死亡率高和大范圍傳播的新趨勢。2018—2021年，PEDV在我國規模化豬場的陽性檢出率基本在50%以上，給生豬養殖帶來巨大經濟損失^［2］。

目前尚無針對PEDV的有效藥物，生物安全措施結合疫苗接種是最主要的防控手段。現有商品化PED疫苗以傳統滅活疫苗和弱毒疫苗為主，但由于PEDV基因型多且變異頻率高，疫苗對變異毒株的免疫保護效果有待加強。近年來，基因工程疫苗因其良好的安全性和免疫效果而備受關注，目前已開發出亞單位疫苗、重組活載體疫苗、病毒樣顆粒疫苗、轉基因植物疫苗和核酸疫苗等。本文綜述了PEDV病原學特征和PED疫苗的最新研究進展，并對未來疫苗的發展進行展望，旨在為生產實踐中有效防控PED提供參考。

1 PEDV基因組與S蛋白特征

PEDV屬于冠狀病毒科α冠狀病毒屬，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒。病毒粒子近似球形，粒子直徑為130～170 nm，表面由棒狀突起覆蓋。基因組全長約為28 kb，包含5′帽子結構、3′poly （A）尾和7個開放閱讀框（open reading frame，ORF）。其中ORF1a和ORF1b占據基因組的2/3，編碼非結構多聚蛋白1a和1ab，這兩種多聚蛋白在3C樣蛋白酶和類木瓜蛋白酶的作用下裂解為16種非結構蛋白（nonstructural protein，nsp）；另1/3基因組主要編碼4種結構蛋白，分別為棘突蛋白S、包膜蛋白E、囊膜蛋白M和核衣殼蛋白N^［3］。

S蛋白是一種位于病毒表面的糖蛋白，通過與宿主細胞上的特異性受體結合介導病毒的入侵，并與病毒的組織或宿主嗜性相關^［4］。S蛋白由兩個亞基組成，分別是外部的S1亞基和內部的S2亞基。S1亞基由N端信號肽、N末端結構域和C末端結構域組成，負責與宿主細胞受體的結合。S2亞基由胞外結構域、跨膜結構域和胞內結構域組成，負責介導病毒與宿主細胞膜的融合；其中，S2亞基的胞外域包括蛋白酶切割位點、融合肽和兩個七肽重復區。S蛋白是PEDV重要的免疫原性蛋白，目前已經發現六個中和表位S10（aa 19—220）、S1A（aa 435—485），COE（aa 499—638）、SS2（aa 748—755）、SS6（aa 764—771）和2C10（aa 1368—1374）^［5-9］。因此，S蛋白常被作為PEDV疫苗設計的關鍵靶點。根據對PEDV S基因的遺傳進化研究，PEDV毒株可分為GⅠ型和GⅡ型，其中GⅠ型又分為GⅠa和GⅠb亞型，GⅡ型又分為GⅡa和GⅡb亞型。當前我國優勢流行毒株為GⅡ變異型^［10］。2014年，美國首次分離到一株低致病性PEDV-OH851株，與其它PEDV流行毒株的S基因相比，OH851株的S基因有3個缺失（167位1 nt缺失，176位11 nt缺失，416位3 nt缺失），1個插入位點（474—475位之間6 nt插入），S1區前1 170 nt有多個突變^［11］，這種新出現的毒株被命名為“S-INDEL”毒株。

2 PED商品疫苗概況

2.1 PED國內商品疫苗概況

2015年3月24日，由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所研制的豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒（porcine rotavirus，PoRV）三聯活疫苗正式發布，這是中國大陸第一個豬腹瀉病毒三聯疫苗，能夠同時預防三種主要的豬病毒性腹瀉疾病。目前，國內已有30余家生產企業獲得PED疫苗的生產批準文號，其中以生產TGEV、PEDV二聯疫苗居多，毒株以經典毒株CV777為主，但使用GⅠ群經典毒株CV777研制的疫苗可能無法針對當前流行的GⅡ群毒株提供很好的免疫保護力，因此，近幾年也陸續發布了針對AJ1102株（2017年首次批簽發）、SCSZ-1株（2018年首次批簽發）、LW/L株（2018年首次批簽發）、XJ-DB2株（2021年首次批簽發）和CHYJ株（2023年首次批簽發）等變異流行毒株的PED商品疫苗。PEDV主要感染腸道上皮細胞，通過胃腸道免疫激發乳腺分泌sIgA抗體，仔豬通過初乳攝取sIgA抗體后可以獲得針對PEDV的被動免疫保護，因此誘發有效的黏膜免疫是預防仔豬感染PEDV的關鍵。2023年，由海大集團發布的海瀉康-豬流行性腹瀉滅活疫苗（CHYJ株）成為國內首個獲批的腹瀉類黏膜免疫疫苗，其推薦免疫方式為滴鼻免疫，突破了以往的注射免疫方式，為未來的PEDV疫苗研究提供了新的方向。2024年國內批簽發的PED商品疫苗種類包括豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗；豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯弱毒疫苗；豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒三聯弱毒活疫苗和豬流行性腹瀉滅活疫苗，采用的毒株包括PEDV經典毒株（CV777株、ZJ-08株）和變異毒株（AJ1102-R株、SCZ-1株、LW/L株、XJ-DB2株、CHYJ株）（表1）。

2018—2023年已獲臨床批件的疫苗數據表明（表2），相比過去主要圍繞豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯疫苗進行研發與生產，目前關于PEDV商品疫苗則主要圍繞豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬丁型冠狀病毒三聯滅活疫苗和豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒二聯滅活疫苗進行研發，所采用毒株已全部為PEDV流行變異毒株，這與當前臨床病毒性腹瀉的流行現狀高度契合。亞單位疫苗具有便于規模化生產、安全性高、穩定性好的優點，首個由CHO細胞表達的PEDV S蛋白亞單位疫苗CHO-3G12株也已進入臨床審批階段。近幾年獲臨床批件的PEDV相關疫苗類型代表了未來商品化豬腹瀉疫苗的主要趨勢，相信在未來能夠為防控豬病毒性腹瀉疾病提供更有力的保障。

2.2 國外商品疫苗概況

韓國于1992年首次報道PEDV^［12］，此后PED在其許多省份流行，成為韓國最重要的豬病毒性腹瀉疾病之一，并造成重大的經濟損失。為了防控PED，韓國第一種基于GⅠa型PEDV毒株SM98-1的滅活疫苗在2004年上市。該毒株還通過在細胞中連續傳代培養致弱，用于制作弱毒疫苗。此外，韓國研究人員通過將分離得到的PEDV毒株在Vero細胞中連續傳代獲得GⅠa型PEDV減毒株KPEDV-9和DR-13并制成弱毒疫苗，兩種疫苗的免疫途徑分別為肌肉接種免疫和口服免疫^［13-14］。而在日本，研究人員將GⅠa型PEDV毒株83P-5在Vero細胞中傳代100次后制成弱毒疫苗（P-5 V）^［15］，該疫苗在日本和韓國被廣泛使用。2013年春季，美國確認了一種PEDV GⅡb變異株，該毒株導致的疫情暴發在一年內導致新生仔豬大量死亡^［16］。隨后，該毒株迅速傳播到美洲、歐洲和亞洲國家，在世界范圍內引發了第二波PED流行^［17］。由于使用PEDV GⅠa型經典毒株生產的疫苗無法對GⅡb型變異毒株感染提供良好的保護效果，因此，GⅡb型PEDV毒株被認為是開發下一代疫苗的關鍵。2014年6月，美國批準了一款用于緊急接種的PEDV mRNA疫苗（PED-RP）^［18］。同年9月，由碩騰公司開發的PEDV全病毒滅活疫苗上市。同時，韓國還開發了由韓國分離株KNU-141113 S-DEL5/ORF3生產的GⅡb口服活疫苗^［19］，并于2020年起投入豬場使用，該疫苗也是全球首個PEDV GⅡb口服弱毒疫苗。

3 PED傳統疫苗研究現狀

3.1 滅活疫苗

早期的PED滅活疫苗是將病豬的小腸組織處理并滅活后加入佐劑制成，也稱為組織滅活疫苗。中國最早報道的PED滅活疫苗就是1993年由王明等^［20］ 用PEDV滬毒株攻毒后取發病仔豬的腸組織懸液制成的氫氧化鋁組織滅活疫苗。PED組織滅活疫苗的制備方法較為簡易，且具有較強的病原針對性；但通常難以確定組織中的病原含量，并含有很多異源物質和不確定因素，不易于大規模生產。相比之下，以病毒的細胞培養物制成的細胞滅活疫苗質量可控，還能基于細胞懸浮培養技術實現大規模生產，發展前景更為廣闊^［21］。近五年在豬體內進行過動物試驗的豬流行性腹瀉滅活疫苗研究如表3所示。常小云等^［22］利用懸浮培養技術將PEDV GF10變異株制備成滅活苗，并免疫妊娠母豬，結果表明該疫苗對于仔豬的保護率高達90%，且仔豬獲得的母源抗體可持續至35日齡以上。郭振剛等^［23］用PEDV GS毒株細胞滅活苗免疫妊娠母豬，所產7日齡仔豬的母源抗體中和效價為（1∶128）～（1∶256），并且可持續至28日齡左右。為簡化疫苗開發工藝，Singh等^［24］將PEDV CO2013毒株在44℃熱處理10 min以展開結構蛋白，隨后用RNAse使基因組片段化，最后在25℃下重新折疊衣殼蛋白以制備PED滅活苗，免疫3周齡仔豬可以提供針對PEDV強毒株的保護作用。使用胰蛋白酶依賴性的PEDV毒株作為疫苗毒株會使疫苗制備過程更復雜，并增加疫苗生產的成本。Li等^［25］利用相應的PEDV JS2008毒株（非胰蛋白酶依賴型PEDV GⅠ毒株）序列替換PEDV AJ1102毒株（胰蛋白酶依賴型PEDV GⅡ毒株）的S2結構域（aa 894—1386），生成重組毒株rAJ1102-S2′JS2008。rAJ1102-S2′JS2008可以獨立于胰蛋白酶進行穩定傳代，滅活后對4周齡仔豬進行三次肌肉注射可以誘導仔豬同時產生針對AJ1102和JS2008毒株的中和抗體。

滅活疫苗具有安全性高、便于貯存和運輸及生產工藝成熟等優點，但其免疫效果較差，無法誘導細胞免疫，需要多次接種才能達到持久的免疫效果。因此，滅活疫苗通常需要適當的免疫增強劑。Xu等^［26］將PEDV AH2012/12毒株滅活后添加Flic佐劑制成滅活疫苗，對妊娠母豬間隔14 d進行兩次滴鼻免疫后，母豬血清和初乳中均產生了高水平的IgG、IgA和中和抗體，仔豬存活率提升了73.34%。Hsueh等^［27］使用PEDV PT-5毒株制成滅活疫苗后對5周齡仔豬進行肌肉注射，與未添加佐劑的滅活疫苗相比，使用CCL蛋白作為佐劑的滅活疫苗可誘導更高水平的特異性IgG和sIgA抗體。Choe等^［28］用PEDV SGP-M1毒株混合Carbopol 940 NF聚合物制成滅活疫苗，在妊娠母豬分娩前5周和2周各皮下接種1次，可保護所產仔豬免受強毒株的攻擊，仔豬存活率為70%。建立腸黏膜免疫反應包括病毒特異性IgA的分泌，是預防PEDV感染的關鍵。Zhang等^［29］研究發現，與口服免疫相比，滴鼻免疫PED滅活疫苗后仔豬腸道內中和抗體水平更高，表明滴鼻免疫在誘導腸黏膜免疫反應方面更有效，是一種很有潛力的滅活疫苗接種方式。

3.2 弱毒疫苗

PED弱毒疫苗是指將PEDV強毒株的毒力和致病性降低后制備而成的疫苗，如何將強毒株在致弱的同時保留其免疫原性是弱毒疫苗研究的關鍵。傳統的致弱手段是通過在細胞中連續傳代而獲得PEDV弱毒株。近五年在豬體內進行過動物試驗的豬流行性腹瀉弱毒疫苗研究如表4所示。Jang等^［30］將強毒株KNU-141112在Vero細胞中連續傳代，獲得了弱毒株S DEL5/ORF3作為疫苗候選毒株。妊娠母豬口服弱毒活苗并在分娩前加強免疫兩次市售滅活疫苗后，所產仔豬的存活率從0%提高到100%，腹瀉程度顯著減輕。Schumacher等^［31］將PEDV IL20697毒株在Vero細胞中連續傳代并純化后得到減毒株，母豬妊娠79 d時口服免疫，100 d時加強免疫，結果母豬與新生仔豬均產生了高水平的特異性IgG和sIgA抗體；與對照組相比，仔豬存活率顯著提高，但在仔豬糞便排毒方面沒有明顯差異。為了降低細胞連續傳代而帶來的時間和經濟成本，Won等^［32］通過降低Vero細胞的生長溫度，對PEDV Aram-P5強毒株進行短期傳代，從而獲得了一種冷適應的低傳代弱毒株Aram-P29-CA。臨床試驗表明，給仔豬接種該毒株后并沒有出現腹瀉、嘔吐等癥狀，表明該毒株在正常體溫下不會返強；將Aram-P29-CA免疫妊娠母豬后，在母豬的初乳中檢測到較高的抗體水平，并顯著提高了仔豬存活率。Kim等^［33］將分離的GⅡb型PEDV毒株在各種培養條件下連續傳代，包括在培養基中補充L-1-甲苯磺酰胺-2-苯基乙基氯甲基酮（TPCK）處理的胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）和糖去氧膽酸（GCDCA），最終產生了六種弱毒株：CKT-7 T15（含TPCK處理的胰蛋白酶）、CKT-7 T15N（含TPCK處理的胰蛋白酶和GCDCA）、CKT-7 N（含GCDCA）、CKT-7 NF（含GCDCA和FBS）、CKT-7 F（含FBS）和 CKT-7 X（無補充劑），并基于此來制備弱毒疫苗。動物試驗結果顯示CKT-7 N毒株的病毒滴度最高，峰值約為（8.67±0.29）lg TCID50·mL^-1，且在5日齡仔豬中未觀察到死亡或腹瀉癥狀，表明CKT-7 N株為最適合的候選疫苗毒株。

隨著PEDV基因組信息增多，利用基因工程技術敲減或敲除毒力基因獲得弱毒株正成為PEDV弱毒疫苗的研究熱點。與傳統方法相比，該技術的安全性更高、研發過程更高效、生產工藝更簡便。Hou等^［34］通過抑制nsp16的2′-O甲基轉移酶的活性并同時敲除S蛋白胞內域的內吞信號序列，設計了PEDV KDKE4A-SYA重組弱毒株，該毒株感染細胞可以誘導更強的I型和III型干擾素反應，免疫妊娠母豬后對新生仔豬的保護率可達100%，表明nsp16蛋白可以作為開發PED弱毒疫苗的通用靶標。Deng等^［35］通過使PEDV中的干擾素拮抗蛋白nsp1、nsp15和nsp16失活得到了弱毒株icPEDV-mute4，仔豬感染該毒株后未表現相關癥狀，并且誘發了針對PEDV的IgG中和抗體反應，為研制PED弱毒疫苗提供了新的方向。冠狀病毒S蛋白的N-糖基化位點突變是影響哺乳動物冠狀病毒感染，傳播，致病性和免疫原性的關鍵因素。Zhang等^［36］通過用天冬酰胺氨基酸替換aa 514和aa 556位點的絲氨酸，生成了三種重組PEDV，分別命名為r12-N514G、r12-N556G和r12-N514+556G。與親本病毒相比，重組病毒可以誘導5日齡仔豬產生高水平的sIgA和IgG抗體，抗體滴度在12 dpi時達到峰值水平，其原因可能是去除糖基化位點會暴露S蛋白的抗原表位，以削弱病毒對宿主免疫反應的逃逸能力，但重組PEDV仍會引起組織病變，其安全性還有待考量。

與PED滅活疫苗相比，弱毒活疫苗具有更好的免疫原性，能夠有效刺激腸道黏膜而產生黏膜免疫，并可以長期保持免疫效果，減少多次接種帶來的豬群應激。但弱毒活疫苗的保存和運輸條件較為嚴格，并具有返強風險。針對2010年后出現的PEDV變異毒株，基于經典毒株制備的商品化疫苗可能無法提供理想的保護效果。因此，基于基因工程的PED新型疫苗研究正成為熱點。

4 PED基因工程疫苗研究現狀

4.1 亞單位疫苗

PED亞單位疫苗是指將PEDV的結構/非結構蛋白克隆于特定的表達系統，實現體外高效表達和純化，以獲得的重組蛋白作為免疫原制備的疫苗。S蛋白在PEDV入侵宿主和病毒-宿主膜融合中發揮重要作用，并且具有多個B淋巴細胞抗原表位，能夠誘導機體產生中和抗體，因此S蛋白被認為是開發PED亞單位疫苗的重要靶標。近五年在豬體內進行過動物試驗的豬流行性腹瀉亞單位疫苗研究如表5所示。

原核表達系統、真核表達系統及昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統（baculovirus expression vector system，BEVs）是制備亞單位疫苗常用的表達系統。原核表達系統可在短時間獲得大量目標蛋白，具有大規模生產的能力，但不能對病毒蛋白進行正確折疊和翻譯后修飾，不利于保持蛋白的抗原活性。郭濤^［37］使用大腸桿菌pET-32a原核表達系統表達重組PEDV CH/PDS/2015株COE蛋白并制備亞單位疫苗，通過肌肉注射和口服免疫后，3月齡仔豬血清特異性IgG和唾液中的sIgA均有所升高。Choe等^［38］使用大腸桿菌pG5-S1D原核表達系統表達了PEDV S1亞基的可溶性aP2蛋白，并用HPMCP微球包裹蛋白，配合使用口服疫苗佐劑LLRANKL。妊娠母豬在分娩前4周和前2周進行兩次口服免疫后，初乳中sIgA抗體、中和抗體均顯著增加，所產仔豬的存活率與商品滅活疫苗免疫組相似。真核表達系統可表達結構復雜的目標蛋白，維持蛋白的天然空間構像，有利于誘導產生中和抗體，但存在成本較高、培養效率較低等問題。武旺盛等^［39］用慢病毒表達系統成功制備穩定表達PEDV KM242131株S1蛋白的重組HEK-293T細胞，與佐劑結合后制備亞單位疫苗，肌肉注射斷奶仔豬，兩次加強免疫后能刺激仔豬機體產生特異性sIgA抗體，唾液sIgA的S/P值最高可達0.59。Guo等^［40］成功制備穩定表達PEDV AH2012/12株全長S蛋白、S1亞基和S蛋白多表位串聯的三聚體蛋白的重組HEK-293T細胞，并使用氫氧化鋁佐劑M401和水基佐劑M103分別制成亞單位疫苗S/M401、S1/M401、COEs/M401和S/M103、S1/M103、COEs/M103。小鼠試驗表明S/M103免疫組小鼠的中和抗體滴度最高，為1∶96，故選擇S/M103亞單位疫苗在仔豬中進一步評估。3日齡仔豬肌肉接種免疫后，S/M103誘導的IgG、IgA、IFN-γ和中和抗體水平相對較高，保護效果優于商品滅活疫苗，并對GⅡa型毒株具有一定的交叉保護作用，表明S/M103 具有作為臨床候選亞單位疫苗的潛力。

BEVs可對目標蛋白進行恰當的折疊和翻譯后修飾，從而使表達的蛋白接近天然蛋白，并且昆蟲細胞可大規模懸浮培養，有利于規模化生產。吳松^［41］利用BEVs表達了的PEDV CT株的S1蛋白并制備亞單位疫苗，免疫妊娠75 d的母豬后，在母豬的血清和乳汁中分別能檢測到高水平的IgG和sIgA抗體，對仔豬的保護率為75.32%。Chang等^［42］用家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori NPV，BmNPV）表達PEDV PT株的S蛋白后制成亞單位疫苗，對4周齡仔豬間隔2周口服免疫3次后，不能檢測到針對PEDV的特異性體液免疫反應和黏膜免疫反應，研究人員認為這可能是由于豬胃腸道的低pH環境和消化酶酶解能力導致疫苗失活，以及疫苗未添加佐劑來克服口服耐受性，需要探究更好的策略來使口服疫苗在胃腸道遞送并保留其免疫原性。Yu等^［43］用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統表達PEDV CO株的S蛋白后制成亞單位疫苗，新生仔豬每兩周肌肉注射兩劑疫苗后可在血清檢測到高滴度的中和抗體，但仔豬在5周齡受到PEDV強毒株攻擊后表現出嚴重的腹瀉癥狀。結果表明該亞單位疫苗可能會誘導宿主產生針對融合后PEDV S蛋白的非中和抗體，并產生抗體依賴增強效應。

基因工程亞單位疫苗可利用體外表達系統進行蛋白大量表達，便于規模化生產，具有安全性高、穩定性好的優點；同時還可配套病原體其他蛋白作為抗原建立診斷方法，以區分亞單位疫苗免疫和野毒感染。然而，與含有完整病原體成分的疫苗相比，亞單位疫苗的免疫原性較低，通常需要佐劑輔助來增強免疫效果。Wang等^［44］在PEDV亞單位疫苗中添加復合佐劑CpG5和MF59，對30日齡的仔豬肌肉免疫后，復合佐劑組仔豬的IgG抗體滴度明顯高于單獨使用兩種佐劑的組別，表明MF59和CpG5的佐劑組合具有協同效應，可在PEDV亞單位疫苗中產生更強烈和更持久的免疫增強反應。

4.2 病毒樣顆粒疫苗

PEDV病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）疫苗是一種和病毒結構相似的空心顆粒，基于PEDV的一種或多種結構蛋白（不含核酸）組裝而成。與亞單位疫苗相比，VLPs可以模擬病毒自然感染的過程，誘導免疫保護作用。同時，由于VLPs缺乏遺傳物質，因此不存在自主復制的能力和毒力返強的風險，安全性更高。

近五年在豬體內進行過動物試驗的豬流行性腹瀉VLPs疫苗研究如表6所示。Lu等^［45］將PEDV S蛋白的B細胞表位⁷⁴⁸YSNIGVCK⁷⁵⁵重組到乙肝病毒核心衣殼蛋白（HBcAg）中制備VLPs，在妊娠母豬分娩前6周進行3次肌肉注射，每次間隔2周；與對照組相比，所產仔豬的攻毒后存活率提升30%，發病癥狀減輕。Hsu等^［46］以PEDV VLPs（包含S、M和E蛋白）為抗原，輔以CCL25和CCL28作為佐劑，免疫4周齡仔豬后能夠檢測到高水平的特異性IgG和sIgA抗體，并誘導了細胞免疫。ADDomer是一種基于腺病毒多聚蛋白的納米顆粒骨架，其與BEVs聯合產生的VLPs疫苗表現出優異的免疫原性，具有巨大的開發前景^［47］。Du等^［48］同時將PEDV S蛋白的SS2和2C10結構域以及TGEV S蛋白的A和D位點插入到ADDomer框架中，并通過BEVS表達重組蛋白AD、AD-P、AD-T和AD-PT，隨后將自組裝的重組ADDomer-VLPs制備成疫苗。臨床結果表明，該重組ADDomer-VLPs疫苗能夠有效刺激仔豬產生針對PEDV和TGEV的中和抗體以及Th1型和Th2型免疫反應。Trimer-Tag（蛋白質三聚體化）技術平臺可以使任意一個目的蛋白三聚體化，獲得穩定的類天然三聚體結構的病毒抗原，為開發VLPs提供了新的思路。該技術平臺已通過新冠肺炎疫苗（SCB-2019）全面驗證，SCB-2019已在中國獲得緊急使用授權。Li等^［49］使用Trimer-Tag平臺生產了PEDV GS2022毒株的S1-Trimer、COE-Trime和RBD-Trimer作為候選亞單位疫苗。妊娠母豬于產前35 d和20 d進行兩次肌肉接種免疫，結果表明，與RBD-Trimer和COE-Trimer相比，S1-Trimer表現出優勢。S1-Trimer在妊娠母豬的血清、初乳和唾液中誘導高水平的PEDV特異性IgG和sIgA抗體，同時還誘導了細胞免疫，母豬PBMC中的IFN-γ和IL-4的表達量顯著升高，所產仔豬的血清和腸道樣本中均檢測到高水平的IgG、IgA和中和抗體。

4.3 重組活載體疫苗

重組活載體疫苗是基于同源重組原理研發的疫苗，將PEDV編碼有效抗原蛋白的基因重組到活載體的基因組中并使之表達。活載體疫苗的安全性高，生產成本低，能夠激發體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫。活載體的基因組能容納足夠的外源基因，可用于多聯或多價疫苗的研制。研發重組活載體疫苗時，應注意載體安全性、外源基因表達量、重組菌/毒株遺傳穩定性等問題。目前主要包括細菌活載體疫苗和病毒活載體疫苗。

4.3.1 細菌活載體疫苗

細菌活載體疫苗通常通過口服免疫，重組菌在體內可與病原體競爭腸道黏膜結合位點，起到免疫保護作用。目前常用的細菌活載體包括腸道乳酸菌和枯草芽胞桿菌。乳酸菌可以在膽汁和低pH值條件下存活，因此可以保證重組菌在通過胃腸道過程中的免疫原性^［50］。此外，乳酸菌易于通過腸道吸收，有利于產生黏膜免疫^［51］。近五年在豬體內進行過動物試驗的豬流行性腹瀉細菌活載體疫苗研究如表7所示。Zang等^［52］用嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）表達PEDV CH-SDBZ-1-2015毒株的S1蛋白，構建了重組菌L. acidophilus-S1，妊娠母豬口服免疫后，初乳中特異性sIgA抗體水平顯著升高，可為新生仔豬提供良好的被動免疫。Zheng等^［53］用約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）表達PEDV HLJ-2012株S蛋白的中和表位COE區，從而構建了重組菌株pPG-T7g10-COE/L. johnsonii，母豬口服免疫后在母乳中檢測到高水平的PEDV特異性IgG和sIgA抗體，為仔豬預防PEDV感染提供了有效保護。馬茹夢^［54-55］以工程菌干酪乳桿菌（Lacticaseibacillus casei 393）、豬源副干酪乳酪桿菌（L. paracasei 27-2）、豬源羅伊氏黏液乳桿菌（Limosilactobacillus reuteri J31）和豬源約氏乳桿菌（L. johnsonii 6332）為宿主菌，構建表達PEDV CH/HLJ/2019 毒株S1蛋白的四株重組菌株并將其口服免疫新生仔豬，結果表明重組豬源L. paracasei 27-2的益生性、抗逆性、遺傳穩定性和免疫應答效果均優于其他三種重組菌，為構建更為有效的乳酸菌口服疫苗提供了科學數據。Guo等^［56］用干酪乳桿菌（L. casei ATCC 393）表達PoRV 6Ds蛋白、PEDV COE蛋白和TGEV VP4蛋白，構建了重組乳酸菌pPG-T7g10-6Ds-COE-VP4/LC393，新生仔豬口服免疫后誘導了針對三種病毒的特異性黏膜免疫和體液免疫。此外，枯草芽胞桿菌作為活載體制備PEDV載體疫苗具有安全性高、免疫效果好等優點。Wang等^［57］將PEDV ZJ08毒株的抗原表位COE重組至枯草芽胞桿菌（B. subtilis WB800）中獲得重組菌B. subtilis RC，口服免疫仔豬后顯著提高了仔豬CD3＋T細胞的數量和CD4＋/CD8＋T細胞的比率，并檢測到高滴度的特異性IgG和sIgA抗體水平。

4.3.2 病毒活載體疫苗

由于病毒活載體本身有助于增強免疫應答，并且可以攜帶多種外源基因片段，因此被認為是一種理想的疫苗研發載體。近五年在豬體內進行過動物試驗的豬流行性腹瀉病毒活載體疫苗研究如表8所示。腺病毒（adenovirus，AdV）是最常用的病毒活載體。AdV具有非整合性的表達基因和轉導能力，因此被廣泛用于表達外源抗原的疫苗開發^［58］。Do等^［59］構建了編碼LTB和PEDV COE的重組腺病毒rAd-LTB-COE，對3周齡仔豬進行肌肉注射或口服免疫后均可誘導高水平的體液免疫和細胞免疫。Wang等^［60］構建了表達特異性靶向PEDV SH2012-5株N蛋白的單鏈可變片段（single-chain variable fragment，scvFs）的重組腺病毒rAdV-ZW1-16、rAdV-ZW3-21、rAdV-ZW1-41和rAdV-ZW4-16，3日齡仔豬口服免疫后顯著抑制了PEDV誘導的促炎細胞因子的表達，恢復了IFN-λ的表達水平，在仔豬受到PEDV強毒株的攻擊后可以起到保護作用，為后續開發基于單鏈抗體的疫苗提供了基礎。Liu等^［61］用AdV表達PEDV CH/HBXT/2018株的S蛋白，構建了重組病毒rAd-PEDV-S，對4周齡豬進行兩次肌肉注射后誘發了特異性體液免疫反應，可以在仔豬受到PEDV強毒株的攻擊時起到保護作用，保護率為40%（2/5）。Song等^［62］構建了表達PEDV/CH/TP-4-4/2018株S蛋白的重組腺病毒rAd5-PEDV-S，設計了在妊娠母豬分娩前5周和2周進行兩次肌肉接種以及在分娩前5周進行單次肌肉接種的兩種免疫程序。結果顯示，通過這兩種免疫程序引起的IgA、IgG和NAb滴度的差異并不顯著，這可能是因為rAd5-PEDV-S免疫的豬體內已經存在抗腺病毒的抗體，表明在分娩前5周給母豬進行單次rAd5-PEDV-S疫苗接種也可能是一種可行的免疫方案。目前，大多數PEDV商業疫苗都推薦在母豬分娩前5周和2周進行兩次免疫接種，Song等^［62］的這一發現對減少母豬免疫應激具有重要意義。

水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）是一種有潛力的外源表達病毒載體，已被用作構建人用疫苗的平臺。Ke等^［63］以VSV為載體表達PEDV/CHN/SHANGHAI/2012 株的S蛋白，獲得了重組病毒VSVMT-SΔ19，對妊娠母豬進行2次肌肉注射后，妊娠母豬和所產仔豬（5日齡）血清中均含有針對PEDV G2b型的中和抗體；但作為活疫苗對母豬進行滴鼻免疫后在血清中沒有檢測到中和抗體，推測原因可能是S蛋白未在宿主細胞中表達或抗原表位未被抗原呈遞細胞獲取。Wang等^［64］以豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）C株表達了PEDV GX750A毒株的S1N和COE結構域，構建了重組病毒vC/SM3’UTRN-CARD/tPAsS1NCOE，對5周齡仔豬肌肉接種后可誘導產生同時針對CSFV和PEDV的高免疫應答，并具有對抗CSFV和PEDV強毒株感染的保護作用，有望在臨床上達到一針兩防的免疫效果，從而減少豬群免疫次數。

TGEV、PoRV和PEDV都是引起仔豬腹瀉疾病的冠狀病毒。Li等^［65］構建了表達PoRV VP7蛋白的重組PEDV病毒rPEDV-PoRV-VP7，接種10日齡仔豬后，在其唾液中檢測到針對PoRV VP7蛋白和PEDV S蛋白特異性sIgA抗體，表明該疫苗可以有效誘導黏膜免疫反應，為開發PEDV和PoRV的二聯疫苗提供了思路。Pascual-Iglesias等^［66］構建了表達PEDV-NVSL株S蛋白的重組TGEV病毒rTGEV-RS-SPEDV，三周齡仔豬口服接種后誘導了針對PEDV的特異性體液免疫反應，可以保護仔豬免受PEDV強毒株的攻擊，但TGEV抗體檢測為陰性。

4.4 轉基因植物疫苗

轉基因植物疫苗是將PEDV主要保護性抗原基因整合到植物細胞基因組中形成轉基因植物，利用植物作為生物反應器大量表達外源蛋白，將外源蛋白作為疫苗或將轉基因植物直接加工飼喂動物使其獲得免疫。近五年在豬體內進行過動物試驗的豬流行性腹瀉轉基因植物疫苗研究如表9所示。Ho等^［67］用本氏煙草表達PEDV PS6株的COE/G2a-p2蛋白，肌肉注射妊娠母豬后，可在所產仔豬5日齡時檢測到高水平IgG、COE-IgA、中和抗體和IFN-λ，并可以保護仔豬免受PEDV強毒株的攻擊。Sohn等^［68］用本氏煙草表達融合了豬Fc結構域（pFc2）的PEDV S1蛋白，妊娠母豬在產前6周和2周進行兩次肌肉注射免疫，可在母豬的初乳和血清中檢測到高水平的中和抗體，對哺乳仔豬的保護率達80%。尹國友^［69］將PEDV HeNPEDV-01株的S1基因導入到番茄中，給仔豬口服轉基因番茄后可刺激機體產生免疫應答從而有效保護仔豬。Egelkrout等^［70］將PEDV Colorado/2013毒株的S蛋白與不耐熱腸毒素B亞基和樹突狀細胞肽融合后轉化至玉米中，檢測到目的抗原蛋白表達量可以達到20 mg·kg^-1，仔豬口服轉基因玉米后可產生高水平的血清中和抗體。

轉基因植物疫苗具有成本低廉、穩定性好和便于貯存等優點。同時，轉基因植物疫苗的抗原蛋白可作為口服疫苗或飼料添加劑，便于大規模免疫應用，具有廣闊的發展前景。但是目前抗原蛋白在轉基因植物中的表達量通常較低，且由于動物個體攝入量不一，免疫效果不易保障，因此未來還有待繼續發展。

5 核酸疫苗

核酸疫苗是將編碼PEDV特異性抗原蛋白的外源基因（DNA或RNA）直接導入宿主細胞內，并通過宿主細胞的表達系統合成抗原蛋白以誘導宿主產生針對該抗原蛋白的特異性免疫應答。核酸疫苗包括DNA疫苗和mRNA疫苗。現有在豬體內進行過動物試驗的豬流行性腹瀉核酸疫苗研究如表10所示。DNA疫苗以質粒為載體表達抗原基因，免疫時以重組質粒的形式直接注射到宿主體內，或先將質粒轉化至載體菌內，依靠載體菌將疫苗質粒導入宿主細胞。Yin等^［71］用pPI-2.EGFP載體構建了共表達PoRV VP7基因和PEDV S基因的DNA疫苗pPI-7.EGFP.VP7.S，經肌肉注射免疫小鼠后誘導了抗S蛋白和VP7蛋白的特異性免疫應答。Zhang等^［72］用鼠傷寒沙門菌（S. Typhimurium aroA）SL7207構建了共表達TGEV SC-H毒株和PEDV SC-L毒株S基因的DNA疫苗pVAXD-PS1-TS，20日齡仔豬口服免疫后可有效刺激針對TGEV和PEDV的體液免疫、黏膜免疫和細胞免疫。相比mRNA疫苗，DNA疫苗更加穩定，制備方法也更加簡單，但重組質粒具有整合到宿主細胞基因組中的風險。其次，DNA疫苗目標蛋白的表達需要經過復制、轉錄和翻譯等多個步驟才能產生免疫原，這導致目標蛋白的表達效率相對較低，限制了DNA疫苗的進一步發展。

相對于DNA疫苗，mRNA疫苗只能實現一輪感染，不具備連續感染能力，從而減少了與宿主細胞基因組整合的風險。但mRNA疫苗通常需要借助額外的載體進行遞送，如脂質納米顆粒（lipid nanoparticles，LNPs）和復制缺陷型病毒顆粒。2014年6月，美國批準了一款用于緊急接種的PEDV mRNA疫苗（PED-RP），PED-RP是將 PEDV S基因連接到pVEK載體中制備而成，pVEK是基于復制缺陷型的委內瑞拉馬腦炎病毒開發的一種載體^［18］。此外，PED-RP也是美國第一個用于預防PEDV的mRNA疫苗。2020年，在菲律賓某豬場開展了針對該疫苗的免疫效力試驗，結果表明該疫苗能夠促進母豬初乳和常乳中中和抗體、IgG和sIgA的產生，從而給仔豬提供有效的保護^［73］。楊利敏等^［74］選擇PEDV NB-F71毒株的RBD結構域作為疫苗靶抗原，制備了基于RBD單體和二聚體的mRNA疫苗，妊娠母豬產前7周先免疫弱毒疫苗，4周后分別免疫RBD-D mRNA候選疫苗或滅活疫苗，結果表明mRNA和滅活疫苗誘導的中和抗體平均滴度分別達到531.8和464.8，無顯著性差異，提示mRNA疫苗可誘導與滅活疫苗相近的抗體水平。Zhao等^［75］設計了用LNPs封裝的mRNA（mRNA-LNP）疫苗，編碼PEDV AH2012/12株的S蛋白。臨床試驗結果表明，3日齡仔豬肌肉接種疫苗后，可誘導產生特異性IgG和sIgA抗體，且免疫后3個月內IgG抗體仍保持相對較高的水平，同時還能夠激活細胞免疫應答；妊娠母豬免疫后，母豬血清和初乳中的特異性IgG和sIgA抗體滴度顯著增加，并能在仔豬血清中檢測到IgG與sIgA抗體，為仔豬提供了良好的被動免疫。

核酸疫苗屬于第三代疫苗，同時具備亞單位疫苗的安全性和弱毒疫苗的時效性，能夠更好地刺激機體的免疫應答。同時，核酸疫苗的研發生產周期相對較短，當病原體發生變異時只需要替換相關的基因序列就能夠快速地制備新疫苗。這些特點在新冠mRNA疫苗的成功應用中得到了體現，隨著mRNA技術的不斷發展和產業鏈的完善，核酸疫苗有望在未來成為獸用疫苗領域的主力軍。

6 展 望

傳統的滅活疫苗具有安全性好、無毒力返強風險、制品穩定、便于保存運輸等優點；弱毒疫苗具有免疫作用快、免疫期長、適用于多種免疫途徑等優點，因此被廣泛用于臨床預防PED。隨著高致病性PEDV變異株的出現，傳統疫苗的效果逐漸受到挑戰。因此，提高滅活疫苗的有效抗原含量以及平衡弱毒疫苗的有效性和安全性成為加強傳統疫苗免疫保護效力的關鍵。雖然基因工程技術的發展為新型PED疫苗的研發提供了新的思路和平臺，但由于安全性、生產成本、免疫保護效果和研發周期等限制因素，基因工程疫苗在實驗室走向臨床應用還需要時間。在新冠疫情暴發后，mRNA疫苗作為備受關注的疫苗類型，為未來研發PED疫苗提供了新的途徑和思路。

PEDV是一種腸道感染的病毒。相比于刺激機體產生血清IgG抗體，刺激腸道免疫產生的sIgA抗體更能有效保護仔豬。因此，未來PED疫苗的研究重點應放在如何刺激腸道免疫以誘導sIgA抗體的產生以及對sIgA抗體水平的快捷評估。PEDV的蛋白結構與功能挖掘、致病與免疫機制解析有助于為PED疫苗和抗病毒藥物的研發提供新的靶點，并為通用性冠狀病毒疫苗的研發提供新的策略。此外，優化不同類型疫苗的組合使用、創新免疫接種方式和建立現代化疫苗技術平臺都有助于提高現有疫苗的免疫效果。隨著不斷的科學推進和技術發展，人們有望看到更多PED疫苗研究技術的突破，從而保障養豬行業的健康持續發展。

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（編輯 白永平）