綠色合成銀納米顆粒對鏈格孢菌侵染煙草活性氧及抗氧化酶的影響

摘要：煙草赤星病是煙草重要的葉斑病害，綠色合成納米顆粒具有良好的抗菌活性，以及提高植物抗病性。因此，本研究探索綠色合成銀納米顆粒（AgNP）對鏈格孢菌（Alternaria alternata）侵染煙草的作用機制，為防治煙草赤星病提供參考。以煙草花朵提取液綠色合成AgNP、鏈格孢菌和易感煙草赤星病的NC82為試驗材料，測定煙草花朵提取液綠色合成的AgNP處理后接種鏈格孢菌的煙葉光合色素含量、活性氧含量和抗氧化酶活性，以及綠色合成的AgNP處理后煙草種子的發芽率。結果表明，90 μg/mL AgNP處理后接種鏈格孢菌的煙草葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量分別比對照高43.21%（Plt;0.05）和44.28% （Plt;0.05），O-2·含量與對照差異不顯著，H2O2含量比對照低38.21% （Plt;0.05），SOD活性與對照差異不顯著，CAT和POD活性分別比對照高110.14% （Plt;0.05）和15.68% （Plt;0.05），PAL活性比照低17.93% （Plt;0.05）。90 μg/mL AgNP處理的煙草種子發芽率為79.67%，與對照發芽率差異不顯著。綜上所述，煙草花朵提取液綠色合成AgNP提高了葉片光合色素水平，主要通過增加CAT和POD活性來清除H2O2，維持煙草葉片的活性氧穩態，減輕鏈格孢菌侵染對煙草葉片的傷害程度。同時，發芽試驗結果表明，AgNP對煙草沒有毒性，具備作為抗真菌劑在煙葉生產中推廣使用的潛力。

關鍵詞：銀納米顆粒；鏈格孢菌；煙草；活性氧；抗氧化酶

中圖分類號：S435.72文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）02-0101-06

鏈格孢菌（Alternaria alternata Keissler）為煙草赤星病的病原真菌，主要通過氣流和雨水傳播，在煙葉上形成黃褐色病斑，侵染后期導致煙葉焦枯壞死，嚴重影響煙葉產量和質量，造成嚴重經濟損失［1-2］。目前煙草赤星病主要采用化學防治，傳統化學農藥長期使用會引起農藥超標、抗藥性等問題，嚴重影響煙葉質量安全及農業生態安全［1，3-4］。

納米顆粒的綠色合成被認為是一種無害的納米顆粒合成方法，與物理和化學方法相比，具有簡便、環保、可再生和生物相容性等優點。綠色合成金屬基納米顆粒已被發現具有抗菌活性，可用于由細菌和真菌病原體引起的植物病害防控［4-5］。向順雨等研究發現，綠色合成銀納米顆粒（AgNP）在 1.0 μg/mL 時對煙草赤星病菌菌絲生長抑制率為83.9%，AgNP處理的菌絲鮮重與菌絲干重顯著低于對照。并且，AgNP在較低濃度時能夠抑制赤星病菌侵染植株，在較高濃度時能夠完全保護植株不受侵染［6］。苦楝綠色合成AgNP，與對照相比，20、40、60 mg/kg的AgNP對茄子黃萎病病原（Verticillium dahliae）菌絲生長抑制率分別為18%、33%、51%。與對照相比，AgNP處理的黃萎病嚴重程度降低［7］。綠色合成AgNP（60～140 μg/mL）對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）菌絲生長抑制率為79%～98%，20～140 μg/mL的AgNP可顯著抑制番茄枯萎病，與對照相比，AgNP處理的番茄總葉綠素、類胡蘿卜素、酚類含量及過氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性顯著提高［5］。綠色合成納米顆粒具有良好的抗菌活性。本研究旨在探討煙草花朵綠色合成AgNP對鏈格孢菌侵染煙草的光合色素含量、活性氧含量和抗氧化酶活性的影響，以及AgNP對煙草種子萌發的影響，以期為綠色合成納米顆粒在煙草赤星病防治方面的應用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1銀納米顆粒（AgNP）的制備供試的AgNP為煙草花朵提取液綠色合成的AgNP。稱取1 g煙草花朵，加10 mL超純水研磨成勻漿，勻漿80" ℃加熱1 h，離心后過濾得到煙草花朵提取液。將10 mL煙草花朵提取液和10 mL AgNO3（2.5 mmol/L）溶液混合，混合液在90 ℃水浴反應4 h。將反應后獲得的磚紅色混合物離心、冷凍干燥備用。

1.1.2菌株供試鏈格孢菌（A. alternata）菌株從貴州省安龍縣感染赤星病煙草葉片上分離獲得，保存于貴州省煙草品質研究重點實驗室。鏈格孢菌在馬鈴薯胡蘿卜瓊脂（PCA）培養基上培養1周后，用無菌水沖洗孢子，配制成孢子濃度為106個/mL的孢子懸浮液。

1.1.3植物材料供試煙草品種為赤星病易感品種NC82。煙苗長至5葉1心時移栽至40 cm直徑的盆中，參照常規生產措施管理，打頂20 d后處理上部葉片。

1.2試驗處理

試驗于2023年在貴州大學校園內（26.45°N，106.66°E）進行。試驗設置4個處理：T0（空白，蒸餾水）；T1（對照，蒸餾水+孢子懸浮液）；T2（30 μg/mL AgNP+孢子懸浮液）；T3（90 μg/mL AgNP+孢子懸浮液）。每個處理21株，重復3次。將不同濃度（0、30、90 μg/mL）的AgNP溶液噴施葉面6 h后，用孢子懸浮液噴霧法接種鏈格孢菌。處理當日記為 0 d，處理后0、4、8 d取樣測定生理指標。

種子萌發試驗參照Mathew等的方法［8］，將煙草種子浸泡在10%次氯酸鈉溶液中10 min，以確保表面無菌，然后浸泡在無菌水中。然后，將種子在0、30、90 μg/mL的AgNP溶液中處理2 h，其中 0 μg/mL AgNP（無菌水）的為對照。2 h后，將種子干燥一段時間，并以每皿100粒種子放置在濕潤的濾紙上，于人工氣候箱中25 ℃進行暗培養，每個處理重復3次。以胚根超過種子長度的1/2為發芽標準，測定7 d的發芽率［9］。

1.3測定項目

葉綠素、類胡蘿卜素含量測定采用乙醇浸提-分光光度法［10］；超氧陰離子（O-2·）含量測定采用羥胺氧化法［11-12］；過氧化氫含量測定采用KI法［13］；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑光還原法［11-12］；過氧化氫酶（CAT）活性測定采用紫外吸收法［11-12］；過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創木酚氧化法［12］；苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測定參照張晨和"" Ansari等的方法［14-15］。

1.4數據處理

采用Excel和SPSS 26軟件處理數據，采用Duncans法進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1AgNP對鏈格孢菌侵染煙草光合色素含量的影響

由圖1可知，處理后4 d，T2和T3處理葉綠素含量與對照（T1處理）差異不顯著，T2處理類胡蘿卜素含量與對照差異不顯著，T3處理類胡蘿卜素含量顯著高于對照和T2處理。處理后8 d時，T2和T3處理光合色素含量顯著高于對照，葉綠素含量分別比對照高33.79%和43.21%，類胡蘿卜素含量分別比對照高28.87%和44.28%，T2和T3處理光合色素含量差異不顯著，且均與空白（T0處理）差異不顯著。

2.2AgNP對鏈格孢菌侵染煙草活性氧含量的影響

由圖2可知，處理后4 d，T2和T3處理的活性氧含量顯著低于對照（T1處理），T2處理的O-2·含量顯著低于T3處理；T3與T2處理的H2O2含量差異不顯著；T2和T3處理的活性氧含量均與空白處理差異不顯著。處理后8 d，T2和T3處理的O-2·含量分別比對照低6.13%、5.19%，但差異不顯著；T2和T3處理的H2O2含量顯著低于對照，分別比對照低31.60%、38.21%，T3與T2處理差異不顯著。

2.3AgNP對鏈格孢菌侵染煙草抗氧化酶活性的影響

由圖3可知，處理后4 d，處理間SOD、CAT、POD和PAL活性差異不顯著。處理后8 d，T2和T3處理的SOD活性分別比T1處理高10.23%和6.17%，T2處理顯著高于對照，T3處理與對照差異不顯著，T2、T3處理均與空白差異不顯著；T2、T3處理的CAT活性顯著高于對照，分別比對照高104.14%、110.14%，T2、T3處理差異不顯著；T2、T3處理的POD活性顯著高于對照，分別比對照高19.94%、15.68%，T2、T3處理差異不顯著，T2、T3處理均與空白處理差異不顯著；T2和T3處理的PAL活性比對照低3.20%、17.93%，T2處理與對照差異不顯著，T2處理顯著高于T3處理，T3處理顯著低于對照，T3處理與空白處理差異不顯著。綜上分析，AgNP處理的SOD、CAT和POD活性比對照高，PAL活性比對照低。

2.4AgNP對煙草種子發芽率的影響

由圖4可知，30、90 μg/mL的AgNP處理的煙草種子發芽率分別為81.67%、79.67%，與對照差異不顯著，說明AgNP處理對煙草種子萌發沒有不利的影響。

3討論與結論

3.1AgNP對鏈格孢菌侵染煙草葉光合色素含量的影響

光合作用為植物提供所需的物質和能量，是植物生長發育的基礎，病原菌侵染能夠破壞寄主葉綠體結構，葉綠素含量降低，導致光合速率明顯下降［16］。本研究中，接種鏈格孢菌導致光合色素含量下降，而T2和T3 AgNP處理的葉綠素含量分別顯著高于對照（T1處理）33.79%和43.21%；類胡蘿卜含量分別顯著高于對照28.87%和44.28%；T3處理光合色素含量高于T2處理；T2和T3處理光合色素含量與空白（T0處理）差異不顯著，這與Ahamad等的研究結果類似，與對照（水）相比，接種胡蘿卜鏈格孢（Alternaria dauci）的胡蘿卜植株葉綠素含量和類胡蘿卜素含量分別降低21.18%和10.17%，而葉面施用MgONP處理并感染病原體的胡蘿卜的葉綠素和類胡蘿卜素含量提高［17］。類似的，受病原菌Xanthomonas campestris（簡稱XC）侵染的植株葉綠素含量降低69.49%，而殼聚糖雜化生物源銀納米顆粒（Ch@BSNP）處理受病原菌侵染的植株葉綠素含量與對照植物大致相等［18］。Anum等研究發現，AgNP處理顯著增加葉綠素b含量，葉綠素b含量的增加與AgNP的濃度成正比［19］。說明在本研究中，鏈格孢菌侵染導致葉片光合色素含量下降，而AgNP處理能緩解葉片中光合色素的降解，維持葉片光合色素含量，來有效抑制鏈格孢菌對葉片的傷害。90 μg/mL AgNP處理的效果較好于30 μg/mL AgNP處理，且AgNP處理與空白處理光合色素含量差異不顯著，AgNP對煙草葉片沒有明顯傷害。

3.2AgNP對鏈格孢菌侵染煙草葉片活性氧含量的影響

活性氧（ROS）是細胞正常代謝的一部分，但是當產生的ROS和清除的ROS之間的平衡受到干擾時，活性氧的有害影響就會顯現出來，植物細胞對病原體的最早反應之一是產生ROS，如超氧陰離子（O-2·）和過氧化氫（H2O2），活性氧加劇導致植物細胞膜損傷，嚴重損害植物結構并破壞植物細胞的功能［20-21］。本研究中，鏈格孢菌接種后導致葉片中 O-2· 和H2O2含量上升，而AgNP處理能降低活性氧的含量，T2處理O-2·含量顯著低于對照6.13%，T2和T3處理的H2O2含量分別顯著低于對照31.60%和38.21%；T2處理的H2O2含量與空白處理差異不顯著，T3處理的H2O2含量顯著低于空白。Wang等研究發現，二氨基聯苯胺（DAB）染色后，接種青枯菌（Ralstonia solanacearum）的植物葉片比未接種的暗。在接種條件下，SNP（二氧化硅納米顆粒）處理接種的葉片中H2O2水平顯著降低，在接種后1 d和2 d分別降低38.54%和22.15%［21］。有研究表明，與未處理的感病（Fusarium oxysporum）對照相比，boi-FeNP（生物-鐵納米顆粒）和SINC（負載水楊酸的生物-鐵納米顆粒）處理的植物根（57%和69%）和莖（46%和54%）中H2O2含量降低，植物的根（34%和61%）和莖（23%和50%）中的O-2·水平降低［22］。本試驗中，接種鏈格孢菌導致葉片活性氧含量上升，而AgNP處理葉片活性氧含量下降，推測AgNP處理減輕了活性氧對細胞膜的損傷，減輕了鏈格孢菌對葉片DNA、蛋白質和脂類等分子結構的破壞，從而降低鏈格孢菌對葉片侵染的傷害。

3.3AgNP對鏈格孢菌侵染煙草葉片抗氧化酶活性的影響

為了有效生長和發育，植物具有多種抵御外部脅迫的防御機制，抗氧化防御系統，包括酶促抗氧化劑，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、愈創木酚過氧化物酶等，在改善來自細胞的ROS中起主要作用［20，23］。本研究中，接種鏈格孢菌處理導致SOD、CAT和POD活性下降，PAL活性上升，而T3處理CAT、POD活性分別顯著高于對照110.14%、15.68%，PAL活性顯著低于對照17.93%；T2處理SOD、CAT、POD活性顯著高于對照10.23%、104.14%、19.94%；T2和T3處理的SOD和POD活性均與空白處理差異不顯著，T3處理的PAL活性與空白處理差異不顯著。Kumari等的研究表明，與單獨感染Alternaria solani（簡稱AS）的植株相比，AS+SNP（生物合成的銀納米顆粒）處理的植物SOD活性顯著降低28.57%，PAL活性增加了23.52%［24］。Giri等研究發現，與未經處理的相比，受XC侵染的植株PAL活性顯著提高了4.08倍；與受XC侵染植株相比，XC+Ch@BSNP處理的植物SOD活性沒有顯著變化，愈創木酚過氧化物酶活性降低了36.58%，PAL活性減少2.10倍［18］。感染青枯菌后，施用SNP的葉片SOD活性在接種后1、2 d分別顯著增加46.02%和51.68%，CAT活性分別增加1.59倍和1.64倍［21］。ZnO-Z（氧化鋅納米顆粒）和Ber@ZnO-Z（負載黃連素的氧化鋅納米顆粒）用于防治番茄青枯病，納米顆粒處理后，番茄植株SOD活性分別增加1.49倍和1.90倍；POD活性分別是CK的3.04倍和2.14倍，PAL活性與CK無顯著差異［23］。在本研究中，接種鏈格孢菌導致葉片SOD、CAT和POD活性下降，PAL活性上升，是煙葉對鏈格孢菌的防御反應；而AgNP處理葉片SOD、CAT和POD活性高于對照，PAL活性低于對照，是AgNP對鏈格孢菌侵染煙葉的防御反應，能有效降低活性氧含量，減少氧化損傷，從而改善病原體對植株的傷害，并且90 μg/mL AgNP處理的SOD、POD和PAL活性與空白處理差異不顯著。

3.4AgNP對煙草種子發芽率的影響

在本試驗中，AgNP處理與對照差異不顯著，AgNP沒有對煙草種子發芽率產生不良影響，這與Jo等的研究結果相似，AgNP不影響未受藤倉赤霉（Gibberella fujikuroi）侵染種子的出苗率和株高，處理0～48 h，150 μg/mL AgNP處理的未受感染的種子與未受感染的水處理的種子相比，種子發芽率、子葉高度和胚根長度相似，并且150 μg/mL AgNP處理種子12 h或24 h，顯著提高了藤倉赤霉侵染種子的出苗率和株高［25］。AgNP可以提高大白菜種子的萌發速度、幼苗生長和產量［26］。

本研究中，AgNP處理的葉片光合色素含量高于對照、活性氧含量低于對照，SOD、CAT和POD活性高于對照，PAL活性低于對照，增強了抗氧化酶對活性氧的清除能力，提高了植物對病原菌的防御。此外，AgNP對煙草種子萌發沒有影響。因此，煙草花朵綠色合成AgNP可作為一種安全有效的抗真菌劑加以推廣和應用。

參考文獻：

［1］張文梅，歐陽冬梅，顏牛生，等. 水楊酸和2，1，3-苯并噻二唑誘導煙草抗赤星病的效應研究［J］. 生物災害科學，2022，45（3）：318-323.

［2］陳玉國，姚晨虓，李洪亮，等. 不同植保施藥器械的噴霧效果及對煙草赤星病的防效［J］. 煙草科技，2023，56（10）：30-39.

［3］曾維愛，周志成，譚琳，等. 湖南煙草病蟲害綠色防控技術研究現狀與應用對策［J］. 中國煙草學報，2019，25（2）：69-73.

［4］Rasmiya B S L，Jayawardana N U.Green synthesized metal nanoparticles as an ecofriendly measure for plant growth stimulation and disease resistance［J］. Plant Nano Biology，2023，3：100028.

［5］Ashraf H，Anjum T，Riaz S，et al. Microwave-assisted green synthesis and characterization of silver nanoparticles using Melia azedarach for the management of Fusarium wilt in tomato［J］. Frontiers in Microbiology，2020，11：238.

［6］向順雨，王靖，謝中玉，等. 一種新型銀納米顆粒的制備及其抑制煙草赤星病菌的機制［J］. 中國農業科學，2020，53（14）：2885-2896.

［7］Jebril S，Khanfir B J R，Dridi C. Green synthesis of silver nanoparticles using Melia azedarach leaf extract and their antifungal activities：in vitro and in vivo［J］. Materials Chemistry and Physics，2020，248：122898.

［8］Mathew S S，Sunny N E，Shanmugam V. Green synthesis of anatase titanium dioxide nanoparticles using Cuminum cyminum seed extract；effect on mung bean （Vigna radiata） seed germination［J］. Inorganic Chemistry Communications，2021，126：108485.

［9］梁俊陽，劉茜，王靜，等. 硫化氫對煙草種子萌發和幼苗生長的影響［J］. 煙草科技，2023，56（4）：10-16.

［10］翟雪琴. 氮素和外源生長物質對煙草次生代謝的影響［D］. 貴陽：貴州大學，2022：12-13.

［11］高俊鳳. 植物生理學實驗指導［M］. 北京：高等教育出版社，2006.

［12］Batool T，Ali S，Seleiman M F，et al. Plant growth promoting rhizobacteria alleviates drought stress in potato in response to suppressive oxidative stress and antioxidant enzymes activities［J］. Scientific Reports，2020，10（1）：16975.

［13］Tongu M，Güler M，nder S. Germination，reserve metabolism and antioxidant enzyme activities in safflower as affected by seed treatments after accelerated aging［J］. South African Journal of Botany，2023，153：209-218.

［14］張晨，臧穎，許倩，等. 毛果楊苯丙氨酸解氨酶活性比較及肉桂酸制備［J］. 南京林業大學學報（自然科學版），2020，44（1）：97-104.

［15］Ansari N，Yadav D S，Singh P，et al. Ozone exposure response on physiological and biochemical parameters vis-a-vis secondary metabolites in a traditional medicinal plant Sida cordifolia L.［J］. Industrial Crops and Products，2023，194：116267.

［16］楊志曉，薛剛，丁燕芳，等. 煙草赤星病脅迫對不同抗性品種光合特性和滲透調節的影響［J］. 中國煙草學報，2015，21（3）：82-87.

［17］Ahamad L，Ali K A，Khan M，et al. Exploring the nano-fungicidal efficacy of green synthesized magnesium oxide nanoparticles （MgO NPs） on the development，physiology，and infection of carrot （Daucus carota L.） with Alternaria leaf blight （ALB）：molecular docking［J］. Journal of Integrative Agriculture，2023，22（10）：3069-3080.

［18］Giri V P，Pandey S，Srivastava S，et al. Chitosan fabricated biogenic silver nanoparticles （Ch@BSNP） protectively modulate the defense mechanism of tomato during bacterial leaf spot （BLS） disease［J］. Plant Physiology and Biochemistry，2023，197：107637.

［19］Anum F，Jabeen K，Javad S，et al. Management of Botrytis grey mold of tomato using bio-fabricated silver nanoparticles［J］. South African Journal of Botany，2023，159：642-652.

［20］Kapoor D，Singh S，Kumar V，et al. Antioxidant enzymes regulation in plants in reference to reactive oxygen species （ROS） and reactive nitrogen species （RNS）［J］. Plant Gene，2019，19：100182.

［21］Wang L，Pan T W，Gao X H，et al. Silica nanoparticles activate defense responses by reducing reactive oxygen species under Ralstonia solanacearum infection in tomato plants［J］. NanoImpact，2022，28：100418.[HJ2mm]

［22］Noman M，Ahmed T，Shahid M，et al. Salicylic acid-doped iron nano-biostimulants potentiate defense responses and suppress Fusarium wilt in watermelon［J］. Journal of Advanced Research，2023，59：19-33.

［23］Liang W L，Cheng J L，Zhang J D，et al. pH-responsive on-demand alkaloids release from core-shell ZnO@ZIF-8 nanosphere for synergistic control of bacterial wilt disease［J］. ACS Nano，2022，16（2）：2762-2773.

［24］Kumari M，Pandey S，Bhattacharya A，et al. Protective role of biosynthesized silver nanoparticles against early blight disease in Solanum lycopersicum［J］. Plant Physiology and Biochemistry，2017，121：216-225.

［25］Jo Y K，Cromwell W，Jeong H K，et al. Use of silver nanoparticles for managing Gibberella fujikuroi on rice seedlings［J］. Crop Protection，2015，74：65-69.

［26］Zhou X D，Jia X R，Zhang Z H，et al. AgNPs seed priming accelerated germination speed and altered nutritional profile of Chinese cabbage［J］. Science of the Total Environment，2022，808：151896.