青花菜自交不親和相關內參基因篩選與應用

摘要：為研究青花菜自交不親和反應過程中最適內參基因與自交不親和相關基因的表達，以青花菜自交不親和系BOP04-28-16開花期分別取不同器官、花的不同組織部位、不同發育時期的花蕾和不同授粉時期柱頭4個組合為試驗材料，利用實時熒光定量PCR技術及3個RT-qPCR分析軟件GeNorm、NormFinder和BestKeeper檢測了17個候選內參基因分別在4個組合中的表達水平。結果表明，在不同組織部位中的穩定內參基因為UBC7、Actin-1、UBC9；在花的不同部位中穩定的內參基因為DNAJ、Tubα-3；在不同發育時期花蕾中穩定的內參基因為Actin-7、UBC7、Actin-3；在4個不同授粉時期柱頭中穩定的內參基因為Actin-7、His。綜合分析認為，UBC7和Actin-7為青花菜SI中最適合的內參基因組合，并以其分別分析青花菜柱頭S位點受體激酶基因（SRK）在花的不同組織部位和不同授粉時期柱頭的表達水平進行驗證篩選的可靠性，結果顯示SRK基因在柱頭中特異表達，并且與柱頭的發育成熟性成正相關。研究結果為開展青花菜自交不親和相關基因的表達特征分析提供了穩定的內參基因，為后續開展關鍵基因的挖掘、利用以及自交不親和分子調控網絡解析奠定了基礎。

關鍵詞：青花菜；自交不親和；內參基因；SRK

中圖分類號：S635.301文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）02-0034-10

青花菜（Brassica oleracea var. italica）別稱西藍花，是十字花科蕓薹屬甘藍種的變種，原產于地中海東部沿岸地區，營養價值十分豐富，被譽為“蔬菜皇冠”［1-2］。隨著人們生活水平的日益提高，對青花菜產品的需求逐年增加。近10年來，我國青花菜播種面積已超過10萬hm2，年產量約400萬t，這在保持我國蔬菜周年供應和出口創匯方面起著關鍵作用［3］。雜種優勢是提高作物產量和品質的重要途徑，開展青花菜雜種優勢利用的研究，選育優質雜交種，是當前青花菜育種的主攻方向，其中利用自交不親和系來生產雜種1代則是青花菜等十字花科作物雜種優勢利用的重中之重［4-5］。

自交不親和性（self-incompatibility，SI）是指植物能產生功能正常的有生育能力的雌雄配子，但是自花授粉后不能結籽的現象［6-8］。青花菜屬于嚴重自交不親和作物，在青花菜親本繁種過程中需要人工剝蕾授粉，極大地增加了種子生產的成本和勞動強度［4-6］。隨著我國對青花菜自主品種選育的日益重視，自交不親和造成的青花菜親本繁育問題越發制約青花菜育種進程，開展青花菜SI的相關分子機制研究尤為重要［4-7］。蕓薹屬植物自交不親和方面的研究發現，自交不親和反應的發生與雌蕊柱頭組織的生長發育水平有著極為密切的關系［8-11］。現有關于自交不親和反應的報道中重要基因主要包括2個方面：一方面是雌性識別因子S位點受體激酶（S-locus receptor kinase，SRK）基因［12］，另一方面是雄性識別因子S位點富半胱氨酸蛋白（S-locus cysteine-rich protein，SCR）基因和S位點蛋白11（S-locus protein 11，SP11）基因［13］。有報道表明，S位點糖蛋白（S-locus glycoprotein，SLG）基因和SRK等基因在柱頭組織特異性表達，并且隨著柱頭組織的發育成熟表達量會顯著上調［13-18］。因此準確分析青花菜自交不親和相關基因在不同組織及柱頭不同發育階段的表達模式，對闡述相關基因在青花菜自交不親和及柱頭發育方面的功能是十分重要的。

實時熒光定量PCR（RT-qPCR）是一種用于評估基因表達量的通用技術，具有高重復性和高通量性［19-20］。大量研究表明，內參基因的選擇不是固定不變的，在試驗材料及試驗條件不同的情況下研究者所選擇的內參基因也是有所不同的，選擇的內參基因是否適合可極大程度地影響RT-qPCR分析結果的準確性［21-24］。具體則需要根據不同物種、不同試驗條件、不同組織器官和不同生長發育階段等因素分別進行篩選和驗證內參基因的可行性［20］。已有研究結果揭示了TUB4、DNAJ、UBQ和GAPDH等內參基因涉及生物體的基本生化反應過程（如中間代謝、蛋白翻譯等），并且被普遍應用于各種植物之間的基因表達研究［25-28］。然而多數報道指出內參基因的選擇具有相對性和非穩定性［24-28］。在十字花科蔬菜中，已有的研究顯示甘藍中適用的內參基因為Actin、Tip41和Tub-α6等，花椰菜中為SKIP16、ACT等［29-33］。但是，筆者所在課題組前期的研究顯示，適用于甘藍的內參基因不適用于青花菜自交不親和相關基因的定量表達分析，因此推測青花菜自交不親和相關內參基因的選擇與物種或基因型密切相關［29-34］。基于此，本研究在青花菜自交不親和識別反應中系統地對候選內參基因進行篩選和驗證。

本研究根據已報道的內參基因和筆者所在課題組已建立的青花菜轉錄組數據庫，選取17個常見候選內參基因［21-34］，使用GeNorm、NormFinder和BestKeeper等3個內參基因篩選軟件進行分析，比較了17個候選內參基因在4個組合（青花菜不同器官、不同時期花蕾、花不同組織部位、不同授粉時期柱頭）中的表達情況［35-37］。利用篩選得到的內參基因分析了青花菜自交不親和反應中關鍵基因SRK的表達模式，驗證了最佳內參基因的可靠性。研究結果以期為闡明SI相關基因的表達模式以及揭示SI的分子機制研究提供參考，同時為自交不親和的利用與克服提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為筆者所在課題組保存的青花菜高代自交系BOP04-28-16，材料于2022年10月定植于湖南農業大學金山基地。在次年4月青花菜開花期，分別取不同器官（根、莖、葉），花的不同組織部位（花梗、花托、萼片、花瓣、花藥、花絲、花期柱頭、子房），不同發育時期的花蕾（小于5 mm、大于 5 mm、完全花），不同授粉時期柱頭（蕾期柱頭、花期柱頭、自花授粉10 min柱頭、自花授粉30 min柱頭）為樣品。

1.2試驗方法

1.2.1試驗材料總RNA的提取和cDNA的合成

所有樣品的總RNA提取參照湖南艾科瑞公司提供的RNA提取試劑盒的說明書進行。使用微量分光光度計對RNA的濃度與純度進行檢測，最后使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。cDNA的合成參照湖南艾科瑞公司的Evo M-MLV RT Premix for qPCR反轉錄試劑盒的說明書進行。

1.2.2候選內參基因引物設計

在OligoArchitectTM Pyimer and probe Design網頁分別設計用于RT-qPCR的Actin-1、Actin-2、Actin-3、Actin-7、Tubα-6、TUBβ-4、UBC7、UBC9、UBQ、UKN1、CYP、DNAJ、EFα、EFβ、GAPDH、His、Tubα-3共17個候選內參基因及SRK基因引物。引物相關信息見表1。

1.2.3候選內參基因片段的PCR擴增

以cDNA為模版， 利用所設計的候選內參基因引物進行PCR擴增，PCR反應體系與反應條件參照試劑盒MegaFi Fidelity 2×PCR MasterMix說明書進行，PCR產物最后使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并分析產物大小，確定引物特異性。

1.2.4RT-qPCR分析

RT-qPCR分析包括候選內參基因和SRK基因2個部分，SRK基因的RT-qPCR分析基于篩選獲得的內參基因進行開展。RT-qPCR 分析操作參照湖南艾科瑞公司的 SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒說明書進行。每個樣品進行3次技術重復。

1.2.5數據分析

候選內參基因的表達穩定性利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper等3款軟件進行統計分析［35-37］。GeNorm和NormFinder軟件需要輸入2-ΔΔCT值，即將Cq值轉換為相對表達量進行分析；BestKeeper軟件則是以輸入原始數據（Cq值）分析［38］。3款軟件最后都是根據分析結果對各候選基因的穩定性進行排名，篩選出最適內參基因。分析結果使用LightCycler"96 SW 1.1軟件、Minitab Statistical Software軟件、Microsoft Excel軟件、Photoshop CS5 Portable 軟件進行數據處理及作圖。

2結果與分析

2.1青花菜花蕾、柱頭及不同組織部位總RNA提取

分別提取不同器官（根、莖、葉），花的不同組織部位（花梗、花托、萼片、花瓣、花藥、花絲、花期柱頭、子房），不同發育時期的花蕾（小于5 mm、大于 5 mm、完全花），不同授粉時期柱頭（蕾期柱頭、花期柱頭、自花授粉10 min柱頭、自花授粉30 min柱頭）的總RNA。如圖1瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，所提取柱頭總RNA的18S條帶及28S條帶清晰，未發現明顯降解現象，適用于后續試驗。

2.2候選內參基因的PCR擴增分析

采用所提取葉片總RNA通過反轉錄獲得cDNA后，以葉片cDNA為模板對所設計的17對候選內參基因引物分別進行PCR擴增，最后利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果（圖2）顯示所設計候選內參基因引物擴增出的條帶清晰可見，并且單一無雜帶，適用于RT-qPCR的分析。

2.3候選內參基因的RT-qPCR表達分析

分別對17個候選內參基因進行RT-qPCR檢測，結果顯示在所有樣品中，17個候選內參基因的熔解曲線峰值明顯且單一，且擴增曲線良好，可以滿足RT-qPCR的要求。候選內參基因的表達量用Cq值表示，Cq值與基因的表達量成負相關，即Cq值越大，表達量越小。如圖3所示，內參基因的Cq值在13～27之間，整體上UBC9的表達量較低（高Cq值），而EFα表達量較高（低Cq值）。大多數候選內參基因的表達量Cq值分布比較集中，特別是Actin-1、Actin-7、UBC7等，說明其表達較為穩定。

2.4候選內參基因表達穩定性的統計分析

2.4.1GeNorm軟件分析

GeNorm軟件判斷標準：表達相對穩定的內參基因其平均表達穩定指數M值小于1.5，且M值越小，表達越穩定，反之則表達不穩定［38］。圖4-a中的結果表明，在青花菜不同器官中Actin-1、Actin-2是表達較為穩定的內參基因；在花的不同組織部位中EFα和EFβ是表達較為穩定的內參基因；在不同發育時期花蕾中Actin-7和UBC7是表達較為穩定的內參基因；在不同授粉時期柱頭中Actin-7和UKN1是表達較為穩定的內參基因。GeNorm軟件可以通過計算出的配對變異值Vn/Vn+1來選擇最適內參基因數目，判定標準為當Vn/Vn+1lt;0.15時，則最合適內參基因的數量是n個，反之則需要n+1個［38］。圖5中結果顯示，花的不同組織部位組合的V2/V3比值小于0.15，表明該組合最適內參基因的數目為2個。

2.4.2NormFinder軟件分析

NormFinder軟件計算原理與GeNorm軟件相似，但該軟件只能篩選出一個最合適的內參基因［38］。由表2可知，NormFinder軟件得出在不同組織部位中最穩定的內參基因是UBC9；在花的不同部位中最穩定的內參基因是Actin-1；在不同發育時期花蕾中最穩定的內參基因為Actin-7；在不同授粉時期柱頭中最穩定的內參基因為UBC7。

2.4.3BestKeeper軟件分析

BestKeeper軟件分析判定原則為相關系數越大、標準偏差和變異系數越小、內參基因穩定性越好，反之，穩定性越差；當標準偏差＞1時，則該內參基因表達不穩定［38］。此軟件分析17個候選基因穩定性結果為在不同組織部位中表達較為穩定的是Actin-3和UBC9（表3）；在花的不同部位中表達較為穩定的是Actin-3和DNAJ（表4），有7個基因： UKN1、UBC9、UBQ、EFβ、TUBβ-4、Tubα-6、GAPDH，不符合內參基因穩定性要求，即標準偏差大于1；在不同發育時期的花蕾中表達較為穩定的是His和UBQ（表5）；在不同授粉時期柱頭中表達較為穩定的是DNAJ和Tubα-6（表6），有2個基因GAPDH和UBQ不符合內參基因穩定性要求。

綜合分析顯示，GeNorm軟件和NormFinder軟件分析結果相近，最穩定的基因組合為UBC7和Actin-7。BestKeeper軟件分析結果稍有不同，表達穩定的內參基因為Actin-3和DNAJ，但UBC7排名也僅次于最優選。3款軟件中也得到一致的最差結果：GAPDH和Actin-2，說明其最不適合作為青花菜SI的內參基因。綜合3款軟件的分析結果，認為UBC7和Actin-7為青花菜SI中最適合內參基因組合。

2.5SRK在不同組織和不同發育時期柱頭的表達分析

SRK等基因在柱頭組織特異性表達，并且會隨著柱頭組織的發育成熟表達量顯著上調［39-41］。因此為驗證篩選到的內參基因的可行性， 筆者所在課題組對SRK基因在不同組織和不同發育時期柱頭中的表達進行了分析。當以穩定內參基因Actin-7分析SRK的表達時，結果顯示SRK在柱頭組織中特異表達，且表達量與柱頭熟性成正相關，當以UBC7作為內參基因時，SRK表現出相似的表達模式（圖6）。但是當以最不穩定的Actin-2和GAPDH作為內參基因時，SRK在蕾期柱頭高表達，顯著高于花期柱頭，與柱頭熟性成負相關（圖7），與已報道SRK基因的表達模式不吻合。上述結果說明，在青花菜自交不親和相關基因的熒光定量PCR研究中，采用Actin-7和UBC7作為內參基因進行分析是可靠的。

3討論與結論

青花菜自交不親和相關基因表達模式分析中，選擇合適的內參基因是得到準確的定量分析結果的重要前提［31-37］。有報道顯示，內參基因的選擇會隨著物種或組織的變化而有著不同的選擇，如青花菜花蕾發育過程中穩定的內參基因是XLOC_000400/XLOC_008536和XLOC_039609/XLOC_021473，抵御逆境脅迫中的穩定內參基因是XLOC_010342和XLOC_007980［42-43］；甘藍柱頭發育過程中穩定的內參基因是Tubα-6、Actin，非生物脅迫試驗條件下適應的內參基因是EF1a、GAPC2和SAND［32，44-45］。然而，上述內參基因不適用筆者所在課題組前期青花菜SI相關基因的熒光定量，具體表現為不同SI基因的表達模式分析結果顯示其在不同組織的表達特異性不顯著以及在SI識別反應前后表達量無明顯差異等。因此本研究系統地在青花菜中對相關候選內參基因進行了統計分析。結果顯示，在近緣物種相關研究中穩定的內參基因對于青花菜而言并不是最優選，如Actin-1、Actin-2、DNAJ、UKN1、Actin-3及Tubα-6等，其中Actin-2驗證為不穩定。因此在開展具有組織特異性基因表達特征分析時應基于本物種或組織預先開發適用的內參基因，而簡單地引用其他物種的已有報道具有潛在的試驗誤差。本研究以青花菜自交不親和系為材料，利用實時熒光定量PCR技術及3個RT-qPCR分析軟件GeNorm、NormFinder和BestKeeper檢測了17個候選內參基因分別在4個組合中的表達水平，篩選獲得了適用于青花菜自交不親和相關基因的內參基因。

綜合GeNorm、NormFinder及BestKeeper分析結果，認為在不同組織部位中的穩定內參基因為UBC7、Actin-1、UBC9，不穩定內參基因為GAPDH、UKN1、His；在花的不同部位中穩定的內參基因為DNAJ、Tubα-3，不穩定的內參基因為GAPDH、Tubα-6、 TUBβ-4； 在不同發育時期花蕾中穩定的內參基因為Actin-7、UBC7、Actin-3，不穩定的內參基因為Actin-2、Tubα-6、UBC9；在不同授粉時期柱頭中穩定的內參基因為Actin-7、His，不穩定的內參基因為UBQ、GAPDH、Actin-2。在數據分析過程中，發現依據3個內參基因篩選軟件直接得出的結果，無法直接選擇出最穩定的內參基因。有研究顯示GeNorm軟件和NormFinder軟件有時可以得到大體一致的結果，有時也會得到差別很大的結果［46-48］。在本研究中，GeNorm軟件和NormFinder軟件篩選出穩定內參基因基本一致（Actin-7和UBC7）。BestKeeper軟件得出了不同結果（表達穩定的內參基因為 Actin-3 和DNAJ），但UBC7的排名也僅次于 Actin-3 和DNAJ。值得注意的是3款軟件一致認為不穩定內參基因是GAPDH和Actin-2。因此本研究綜合考慮了3個軟件中的結果，最終選出在青花菜中穩定的內參基因是Actin-7和UBC7，不穩定的內參基因是GAPDH和Actin-2。對于3款軟件所得的結論存在的一些差異，這可能是軟件對于內參基因穩定性的算法不同造成的［24，35-38］。

此外，通過篩選到的內參基因分析青花菜自交不親和反應中扮演著重要角色的基因SRK的表達情況可以驗證所篩選到的內參基因的可行性，使用Actin-7和UBC7的分析結果顯示SRK在柱頭組織中特異表達，表達量與柱頭熟性成正相關，這個驗證結果與預期的已報道的SRK基因表達模式較為一致，也表明了在SI反應中SRK作為雌性識別因子的重要性［39-41］；而不穩定的內參基因GAPDH和Actin-2的使用導致了SRK表達模式相反的結果。基于以上信息，不建議在青花菜SI中使用這2個基因。

本研究基于17個候選內參基因的表達特性，系統地評估了其在青花菜SI相關基因定量表達研究的適用性，篩選獲得了2個適用的內參基因Actin-7和UBC7，并通過驗證已報道的SRK的表達分析來說明本研究篩選結果的可行性。研究結果為開展青花菜自交不親和相關基因的表達特征分析提供了穩定的內參基因，為后續開展關鍵基因的挖掘、利用以及自交不親和分子調控網絡解析奠定了基礎。

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