大口黑鱸銅綠假單胞菌的分離鑒定與抗菌藥物篩選

摘要：為研究導致河南省某養殖場大口黑鱸皮膚潰爛并死亡的病因并從中分離優勢感染菌株，從中獲取大口黑鱸爆發該病的試驗數據，達到預防與治療的的目的。首先通過顯微鏡觀察和分子生物學等手段排除寄生蟲病和病毒感染的可能性，排除之后在患病大口黑鱸的肝臟和脾臟中，分離出1株優勢菌株NY22101804，經過形態觀察與通過生理生化試驗分析和檢測菌液16S rDNA基因序列并比對構建進化樹分析，確認菌株類型，再通過人工回歸感染試驗驗證致病性并通過紙片擴散法和牛津杯法測定了該菌對抗生素和中藥單體的藥物敏感性對藥物進行篩選。結果顯示，該菌為銅綠假單胞菌株，通過人工回感試驗發現，NY22101804對大口黑鱸具有急性致死效應，死亡率與濃度有依賴性呈正相關變化，通過藥敏試驗數據發現，菌液對妥布霉素、四環素等10種抗生素敏感，對青霉素、氨卡西林等9種抗生素具有耐藥性，在中藥單體的測試中，黃芩素表現出最好的抑菌效果，其他如黃芩苷、柚皮素、蕓香苷等也顯示出不同程度的抑菌活性。

關鍵詞：大口黑鱸；銅綠假單胞菌；藥物敏感性；16S rRNA；中藥單體

中圖分類號：S941.4""文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）01-0231-06

大口黑鱸是一種目前國內淡水水產養殖優勢品種之一，特點鮮明，具有適應性強、生長速度快、成熟體型大、經濟價值高昂的優勢，被我國的商家漁戶重點看待，年產量逐年上升^［1］。大口黑鱸于20世紀80年代引進我國，在經濟價值與食用價值上地位越來越明顯，在高端餐飲和海鮮市場上有著廣闊的前景^［2］。大口黑鱸以其鮮美的肉質和高蛋白的優點，受到廣大食客與消費者的歡迎，經濟價值潛力巨大，而且大口黑鱸抗病力強，病害少，在池中可單養或魚塘中混養，也可在網箱中高密度養殖，養殖經濟效益較高。2022年我國淡水鱸魚養殖量達到80.25萬t，相比于2021年的70.21萬t，總產量增加了14.3%，成為國內養殖數量巨大的淡水魚種之一^［3］。然而，隨著養殖技術的不斷完善進步，養殖密度變大，微生物繁殖迅速，伴隨著大口黑鱸魚體內的病害也逐漸增長。研究表明，導致大口黑鱸病害的病原主要包括細菌病（諾卡氏菌、嗜水氣單胞菌等）、病毒病（如虹彩病毒、彈狀病毒等）、寄生蟲病（如車輪蟲、杯體蟲等）^［4］。銅綠假單胞菌廣泛分布于自然界，是土壤中存在的最常見的細菌之一，也是一種人獸共患的革蘭氏陰性桿菌，而水上養殖中，目前有在草魚及錦鯉等魚類中分離到銅綠假單胞菌^［5-6］，在大口黑鱸中沒有分離到該菌株。

近期，河南省南陽市某養殖場的大口黑鱸出現暴發式死亡病害，經濟損失嚴重，主要癥狀為：魚體皮膚潰瘍、腹部腫大發紅，為了研究病因，對其病原進行分離鑒定，本研究在患病大口黑鱸脾臟組織中分離純化到1株細菌，通過生理生化試驗和16S rRNA基因序列分析鑒定為銅綠假單胞菌。對該病原菌進行了抗生素和天然小分子藥物篩選，以期為大口黑鱸預防銅綠假單胞菌細菌病提供參考依據。

1"材料與方法

本試驗于2022年4—11月于南陽師范學院生命科學與農業工程學院中英聯合試驗室完成。

1.1"試驗材料

患病大口黑鱸魚5尾，來自河南省某大口黑鱸養殖場。用于試驗的健康大口黑鱸魚苗120尾，購自河南省南陽市某大口黑鱸魚苗場，體重（5.0±1.0） g，水溫22～25 ℃，每日投喂基礎飼料1次，換1次水，暫養1周后開始試驗。試驗前，隨機抽取 5%的魚苗，取肝和脾組織進行無菌研磨后，在LB（Luria-Bertani）固體培養基上進行涂盤子，在 28 ℃ 下孵育24～48 h，確保無細菌從動物樣本中檢測到。

1.2"主要試劑和儀器

ApexHF HS DNA 聚合酶預混液-FS（含染料）（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；無菌PBS［磷酸鹽緩沖液，生工生物工程（上海）股份有限公司］；Biospin病毒DNA/RNA提取試劑盒（北京華新康信生物科技有限公司）；抗生素藥敏片、生理生化管試劑（杭州微生物試劑有限公司）；中藥單體（上海麥克林生化科技股份有限公司、上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；恒溫培養箱（上海一恒儀器有限公司）；光學顯微鏡［舜宇光學科技 （集團）有限公司］；電動研磨器、高壓蒸汽滅菌鍋（廣州科曉科學儀器有限公司）；超凈工作臺（廣州沃霖實驗室設備有限公司）；PCR 儀（美國 Bio-Rad 公司）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；凝膠紫外成像分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；微量移液器和多道移液器、微型離心管、一次性培養皿等［生工生物工程（上海）股份有限公司］。引物合成和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3"病毒及寄生蟲檢測

使用無菌剪剪下患病鱸魚體表腐爛組織，與剪下的魚鰓部位進行壓片，用光學顯微鏡下觀察有無寄生蟲狀況。取病魚腐爛位置和肝組織，無菌PBS研磨后，用Biospin病毒DNA/RNA 提取試劑盒進行病毒DNA和RNA 的提取，提取產物分為2份，1份直接用于大口黑鱸虹彩病毒檢測，另外1份進行RNA反轉錄為cDNA后，采用特異性引物，分別利用DNA和cDNA為模板進行PCR擴增，檢測大口黑鱸虹彩病毒和彈狀病毒。PCR反應體系為：rTaq mix預混液（2×）5 μL，上、下游引物LMBVRTF4/LMBVRTR4（表1）各0.5 μL，超純水 3 μL，DNA "1 μL。另一份提取的RNA進行反轉錄為cDNA后，進行大口黑鱸彈狀病毒的檢測，PCR反應體系為rTap mix（2×）5 μL，上、下游引物SCRVRTF4/SCRVRTR4（表1）各0.5 μL，超純水 3 μL，cDNA 1 μL。PCR擴增反應條件：預變性階段95 ℃、5 min；變性階段95 ℃、30 s，退火階段56 ℃、30 s，延伸階段72 ℃、30 s，30個循環；最后72 ℃、5 min。產物通過1%瓊脂糖電泳鑒定，確定是否為病毒感染。

1.4"細菌分離純化

75%醫用乙醇進行魚體皮膚處理后，取病魚體皮膚潰爛處的潰爛組織，之后使用無菌剪沿肚臍剖開腹部，用無菌剪刀、鑷子取出肝臟、脾臟組織放入無菌1.5 mL EP管中，之后加入200 μL無菌PBS進行研磨處理后，對研磨液用PBS進行10倍稀釋，將稀釋好的組織液使用涂布器均勻的涂布在LB固體平板上，28 ℃恒溫培養14～18 h。觀察分離細菌的菌落形態，挑取優勢菌落進行3次劃線分離純化，觀察細胞的形態，并對純化后的菌株LB液體培養基搖至對數生長期后，同50%丙三醇保種，甘油保菌獲得純培養的菌株NY22101804。

1.5"16S rRNA基因序列分析和系統進化樹構建

用16S rRNA通用引物27F/1492R（表1），進行PCR擴增，PCR擴增反應體系（25 μL）包括：ApexHF HS DNA Master Mix 12.5 μL，引物27F/1492R分別加入1 μL，超純水9 μL，NY22101804菌液作為模板1.5 μL。PCR擴增反應條件：預變性階段98 ℃、30 s；變性階段98 ℃、10 s，退火階段56 ℃、15 s，延伸階段72 ℃、20 s，30個循環；之后72 ℃、10 min結束PCR反應。在電泳儀上進行PCR產物檢測，將樣品送至上海生工生物工程有限公司（鄭州）進行16S rRNA基因測序。將測序結果通過NCBI網站的GenBank數據庫中進行核酸BLAST序列比對，采用Cluxal和MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-Joining）進行進化樹構建，Bootstrap值設置為500。

1.6"生理生化特性

在超凈臺中無菌條件下用接種棒挑取菌液接種于微生物生化鑒定管中，進行生理生化特性鑒定試驗。按照試劑盒說明書接種后鑒定管于35 ℃溫度下恒溫培養18～24 h后觀察結果。將獲得的菌株生理生化特征與《常見細菌系統鑒定手冊》、試劑盒說明書中標準菌株的結果作對比來初步判定菌株屬種。

1.7"細菌人工回歸感染試驗

將分離純化得到的銅綠假單胞菌NY22101804接種于液體LB培養基中，以28 ℃在搖床搖菌 12 h，之后以8 000 r/min離心10 min，用無菌PBS清洗3遍，并使用分光光度計將菌懸液吸光度D600 nm調整為1，此時細菌懸液的濃度為1×10⁹"CFU/mL，利用10倍稀釋法，利用無菌PBS分別稀釋成1×10⁹～1×10⁵"CFU/mL這5種濃度。通過腹腔注射感染鱸魚，每組感染20尾健康鱸魚，每尾魚注射劑量為100 μL菌懸液，并取20尾健康的大口黑鱸注射100 μL的無菌PBS作為對照。每日早晚觀察記錄試驗鱸魚的患病癥狀和死亡數量，正常早晚2次喂食，及時清理魚缸，持續7 d。

1.8"藥敏試驗

采用紙片擴散法進行藥敏試驗，取對數生長期的菌液，使用分光光度計將菌懸液吸光度D600 nm調整為1，利用10倍稀釋法，將菌懸液濃度稀釋為1×10⁸"CFU/mL，取100 μL菌懸液均勻涂布于LB固體培養基上，之后用無菌鑷子順時針依次貼入試劑盒中的藥敏紙片，在28 ℃培養箱培養24 h 后，使用游標卡尺測量處理組與對照組的抑菌圈直徑，根據抑菌圈直徑大小，參考《抗微生物藥物敏感性試驗的執行標準》說明，判定菌株對不同抗生素的敏感性。

1.9"中藥單體抑菌研究

選用牛津杯法對26種不同的中藥單體進行病原菌抑菌研究，取對數生長期的菌液，使用分光光度計將菌懸液吸光度D600 nm調整為1，利用10倍稀釋法，將菌懸液稀釋為1×10⁸"CFU/mL的濃度，取100 μL菌懸液均勻涂布于LB 固體培養基上。在超凈臺中使用鑷子把牛津杯輕輕安置于涂布好的培養基表面并按照順時針標記放置，然后分別向牛津杯中加50 μL濃度為10 mg/mL的中藥單體溶劑作為試驗組，用二甲基亞砜（DMSO）與H2O作為對照組，分別對應做好標記。在28 ℃培養箱中正置平板24 h后，之后使用游標卡尺測定對應抑菌圈范圍，以抑菌圈直徑大小來判定中藥單體對病原菌的敏感程度。

2"結果與分析

2.1"病原檢測結果

患病的大口黑鱸腹部腫大發紅、魚體皮膚潰瘍癥狀，解剖后可見肝臟與脾臟顯著腫大，顯微鏡檢測沒有寄生蟲，通過PCR擴增檢測大口黑鱸虹彩病毒（圖1左）與彈狀病毒（圖1右），結果為陰性，說明病原也不是病毒感染，對其進行細菌分離發現，菌株單一感染。推測該大口黑鱸養殖基地患病魚病原是細菌感染引起的。

2.2"病原菌分離純化及生理生化特性

從患病大口黑鱸潰爛部位以及肝臟和脾臟組織中，分離出優勢菌株，將菌株命名為NY22101804。該菌在LB固體培養基上觀察到形態呈現不規則圓形，邊緣規整呈毛絮狀，菌落表面飽滿顆粒，菌落呈現乳白色非透明顏色（圖2）。通過生理生化試驗對菌株NY22101804的研究，結果（表2）顯示：與精氨酸、鳥氨酸、尿素、枸櫞酸鹽、葡萄糖等反應為陽性；與賴氨酸、七葉苷、β-半乳糖苷（ONPG）、硝酸鹽還原、蛋白胨水、硫化氫、麥芽糖、木糖、蔗糖等反應為陰性，并與參考已分離的銅綠假單胞菌作比較，結果一致，符合銅綠假單胞菌的生化鑒定特佂，符合初步判斷。

2.3"16S rRNA序列分析

利用通用引物27F和1492R擴增分離菌株的16S rRNA基因片段，擴增獲得1 500 bp左右的基因序列（圖3），送上海生工生物有限公司（鄭州）測序后，NCBI網站選擇進行核酸BLAST序列比對，NY22101804同銅綠假單胞菌XZPG11株（HQ844508.1）的16S rRNA序列的同源性達到99.72%，針對16S rRNA進行系統進化樹構建，結果顯示，新分離的NY22101804菌株與銅綠假單胞菌參考菌株的親緣關系最近（圖4），綜合考慮，本研究中分離的NY22101804細菌鑒定為為銅綠假單胞菌。

2.4"人工回感試驗

將分離純化的NY22101804進行不同濃度稀釋后，人工回感大口黑鱸魚苗，試驗感染的大口黑鱸魚體腹部腫大發炎，體表局部發炎、鰓部發紅，與采取病料魚體癥狀相似，魚體注射菌懸液1周后觀察發現，向魚體攻毒注射劑量為1×10⁸"CFU/尾與 1×10⁷"CFU/尾處理死亡率較高，分別為100%與80%（表3），感染后發病速度快，大多發生在48 h內的急性期死亡，對照組無死亡、無癥狀。從發病大口黑鱸的肝脾中分離純化細菌，鑒定為銅綠假單胞菌。

2.5"抗生素的藥敏試驗

采用紙片擴散法，參照杭州微生物試劑有限公司的藥敏試劑判斷標準來判定銅綠假單胞菌對24種抗生素的敏感程度，結果顯示，分離株NY22101804對頭孢他啶、呋喃妥因、諾氟沙星等抗生素敏感，對頭孢噻肟、鏈霉素等這一類抗生素中度敏感，對青霉素、呋喃唑酮、利福平等抗生素具有耐藥性，具體數據大小及標準見表4。

2.6"中藥單體抑菌試驗

使用游標卡尺測定抑菌圈直徑大小并統計數據，以抑菌圈直徑來判定26種中藥單體對病原菌的抑菌作用，結果發現中藥單體對NY22101804有不同程度的抑菌作用，其中黃芩素對NY22101804的抑菌效果最好，黃芩苷、芹菜酚、芝麻素、山柰酚、桑黃素、姜黃素、柚皮素、蕓香苷、水飛薊素、漆黃素、茶多酚、鞣花酸、香芹酚均有不同程度的抑菌作用，大黃素、綠原酸、原花青素、水飛薊賓、白藜蘆醇、甘草次酸、甘草酸、沒食子酸、木樨草素、異丁香酚、丁香酚、厚樸酚沒有抑菌效果（表5）。

3"結論與討論

隨著大口黑鱸養殖體量地不斷增大，發揮著越來越大的經濟潛力，但越來越頻繁的傳染病，尤其是細菌性疾病的暴發及其并發癥，給養殖業造成了巨大的經濟損失。細菌性疾病傳播速度快，死亡率高，有必要對致病細菌進行分離鑒定，從而研究其對魚類健康的影響^［10］。通過16S rRNA 分子標記來鑒定細菌分類是一種很有效的方法^［11］。本研究利用分離株的16S rRNA序列進行BLAST分析比對，結果顯示與NCBI數據庫中銅綠假單胞菌的一致性為99.72%，此外，構建的系統發育進化樹再次驗證了分離株為銅綠假單胞菌。利用人工回感試驗，發現NY22101804菌株具有急性致死作用，當注射劑量為1×10⁸"CFU/尾濃度下，1 d后死亡率達到100%，在1×10⁷"CFU/尾濃度下，48 h死亡率達到50%，96 h死亡率達到80%。并且試驗組魚發病情況與自然發病癥狀基本相同，體表發炎紅腫，腹部最為嚴重，從人工感染的病魚肝脾分離到與初次分離的NY22101804菌株形態相似，鑒定為同一株，可以表明銅綠假單胞菌為致病菌株，對大口黑鱸養殖具有潛在威脅作用。

目前，抗生素治療因其應用廣泛、種類多、見效快，仍然是對抗病害的第一選擇，而對于抗生素的使用也在標準化、合理化、科學化。為了使該菌的用藥更為合理，不再盲目用藥，以減少環境污染以及魚體傷亡，本研究發現NY22101804對頭孢他啶、慶大霉素等抗生素敏感，這些藥物在進行水產病害精準用藥過程中發揮著重要作用。然而，長期過度使用抗生素不僅會留下殘留物，還會導致抗生素耐藥菌（ARB）和抗生素耐藥基因（ARGs）的產生^［12］，許多水生細菌病原體產生了多種抗生素耐藥性，其中楊雪瓊等提到MDRPA（多重耐藥銅綠假單胞菌）對于青霉素、紅霉素、頭孢唑啉、氨卡西林這些抗生素的耐藥率達到了100%，其他抗生素也有不同程度的耐藥率^［13］。本研究發現的菌株NY22101804銅綠假單胞菌對青霉素等抗生素具有耐藥作用，隨著抗生素耐藥性細菌的產生，如何使用非抗藥物進行細菌防控愈發重要。

草本植物是藥用化合物和天然抗菌物質的重要來源^［14］，由于草藥及其提取物的有效性、安全性、環境友好性和耐藥性較低等特點，可用于治療許多難以使用化學藥物和抗生素治療的病毒性、細菌性和代謝性疾病，在水產養殖疾病的預防上展現環保潛力，成為越來越有前途的補充劑和替代品。中草藥在魚類疾病防治中的應用主要是由于其有效成分包括多酚、多糖、皂苷、黃酮、生物堿、精油等具有強大的免疫增強和抗氧化等作用，具有抗嗜水氣單胞菌、愛德華氏菌、柱狀黃桿菌、鰻弧菌等多種水產病原細菌^［15-16］，因此，中藥在抑制病原菌方面的重要性日益增加。

本研究采用瓊脂擴散法選用具有抑菌作用的多種中藥單體進行體外抗菌效果篩選，其中包括黃芩素、黃芩苷、芹菜酚、芝麻素、山柰酚、桑黃素、姜黃素、柚皮素、蕓香苷、水飛薊素、漆黃素、茶多酚、鞣花酸、香芹酚具有體外抑菌活性，其中以黃芩素的抑菌效果最佳。這為未來下一步中藥治療這類細菌病提供了理論基礎。鑒于大多數草藥產品的療效和安全性評估是基于臨床結果而不是體外測評，還需要詳細的體內動物研究和臨床試驗來確定其臨床效用。

綜上所述，本研究從患病大口黑鱸中分離鑒定到1株銅綠假單胞菌，分別對其進行抗生素藥敏試驗和中藥單體抑菌作用檢測，為水產養殖使用抗生素精準施治抑制病害提供參考的意見。此外，考慮到傳統草藥提取物比化學物質更環保，與抗生素相比，可以提供更可持續的治療，黃芩素和其他一些抗菌中藥單體有可能是未來控制銅綠假單胞菌的候選藥物，為下一步的綠色用藥提供理論依據。

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