基于高通量測序技術的活性干酵母中的微生物多樣性分析

摘要" 為明確酵母產品的菌相構成，本研究采用純培養法和高通量測序技術對活性干酵母及其原料糖蜜和酵母蛋白胨的微生物多樣性進行分析。純培養法結果表明，活性干酵母的主要微生物菌群為葡萄球菌和乳酸乳球菌。高通量測序結果表明，活性干酵母的主要微生物菌群為桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬、葡萄球菌屬以及威克漢姆酵母屬；糖蜜的主要微生物菌群為明串珠菌屬、威克漢姆酵母屬和結合酵母屬；酵母蛋白胨的主要微生物菌群為葡萄球菌屬、威克漢姆酵母屬。研究結果為了解活性干酵母的菌相成分提供參考，為有針對性地在酵母發酵中對雜菌進行精準地抑制提供一定參考。

關鍵詞" 活性干酵母；菌相分析；高通量測序；微生物多樣性

中圖分類號" S-3 """文獻標識碼" A """文章編號" 1007-7731（2025）05-0093-04

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.05.020

Analysis of microbial diversity in active dry yeast based on high-throughput sequencing technology

LI Yanli JIANG Yifei QIN Leilei HU Yan ZHANG Xiaoji HAN Shujun

（Three Gorges Public Inspection and Testing Center， Yichang 443000， China）

Abstract" To determine the microbial composition of yeast products， the microbial diversity of active dry yeast， its raw molasses and yeast peptone were analyzed by pure culture method and high-throughput sequencing technology. The results of pure culture showed that the main microbial groups of active dry yeast were Staphylococcus and Lactococcus lactis. The results of high-throughput sequencing showed that the main microbial groups of active dry yeast were Bacillus， Leuconostoc， Weissella， Staphylococcus and Wickerhamomyces. The main microbial community of molasses were Leuconostoc， Wickerhamomyces and Zygosaccharomyces. The main microbial group of yeast peptone were Staphylococcus and Wickerhamomyces. The results of this study provide a reference for understanding the composition of active dry yeast， and provide a reference for the precise inhibition of hybrid bacteria in yeast fermentation.

Keywords" active dry yeast; microbial facies analysis; high-throughput sequencing; microbial diversity

活性干酵母是鮮酵母經脫水干燥、復水活化后仍具有較強發酵能力的干酵母制品[1]。其以淀粉或糖蜜為原料，輔以粗加工原料如酵母蛋白胨等，是一種以顆粒形式存在但不失去生物活性的酵母產品[2]。隨著現代檢測技術的不斷發展，微生物多樣性的研究方法也得到了發展壯大，目前的研究方法主要集中在傳統的純培養技術和現代的分子生物學技術上，前者主要包括平板劃線培養、Biolog技術等，后者主要包括DNA探針雜交、PCR擴增技術等。高通量測序技術以其快速、準確的突出特點，被廣泛應用于分析食品中的微生物多樣性[3]。與傳統微生物分離培養技術等方法相比，該方法可一次性對樣品中的幾十萬到幾百萬條脫氧核糖核酸分子序列進行測定，從而快速確定微生物的種類和豐度[4]。該技術不僅可以展示微生物在門、屬等水平的豐度及結構組成，還能合理預測相關功能，是微生物代謝分析的有效手段[5]。傳統微生物分離培養技術和高通量測序技術目前已得到較多的應用，這兩種方法各有特點，比如傳統微生物分離培養技術難以準確反映微生物的實際構成情況，而高通量測序技術由于數據量大，對數據的處理和解析過程較煩瑣，且成本較高，限制了其在食品工業中的推廣[6]。因此在研究過程中，將兩類方法有效結合，取長補短，才能更好地對產品的微生物多樣性進行研究。

目前對活性干酵母的微生物多樣性分析較少，本研究采用純培養法與高通量測序技術對活性干酵母及其原料糖蜜和酵母蛋白胨的菌相構成進行研究，并對其中雜菌來源進行初步探討，識別產品中可能存在潛在的危害或影響因子，有利于針對性改善工藝，降低生產成本，從而提高產品質量，為產品標準修訂及產品創新提供參考，并為產品應用后期風味影響研究提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同種類的活性干酵母（7種），糖蜜和酵母蛋白胨均來自市售，PCA培養基和營養肉湯，購自青島海博生物技術有限公司；細菌擴增引物：標準細菌16S V3V4（a），真菌擴增引物：標準真菌ITS1（a）；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit、瓊脂糖和TAE，購自Invitrogen。

1.2 儀器與設備

全自動微生物鑒定系統（梅里埃）、PCR擴增儀（ABI）、酶標儀（BioTek）、電泳儀（北京六一）、凝膠成像系統（北京百晶）。

1.3 微生物的分離鑒定

1.3.1 微生物的分離篩選 （1）平板計數瓊脂篩選。參考GB 4789.2—2022《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》；稱取25 g酵母于225 mL生理鹽水中，均質2 min制成1∶10的樣品勻液。吸取1∶10樣品勻液1 mL于 9 mL生理鹽水中，渦旋混勻，制成1∶100的樣品勻液。依次制備10倍稀釋系列樣品勻液。吸取各樣品勻液于無菌培養皿內，并加入平板計數瓊脂培養基，轉動混勻。待瓊脂凝固后將平板倒置，（36±1）℃培養（48±2）h，觀察平板上菌落生長情況，挑取不同的特征菌進行分離純化。（2）營養肉湯增菌篩選。在無菌條件下，稱取25 g酵母，加入225 mL營養肉湯，均質。于（36±1）℃培養20 h，劃線轉接營養瓊脂平板，（36±1）℃培養24 h后，觀察平板上菌落生長情況，對不同的特征菌落進行分離純化。

1.3.2 微生物的鑒定 將分離純化得到的不同特征菌落，進行革蘭氏染色鏡檢，并用生化鑒定儀對分離的目標菌進行生化鑒定。

1.4 高通量測序

按照DNA 提取試劑盒說明提取樣品的微生物群落總DNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，采用Nanodrop測定DNA濃度和純度。采用Pfu高保真DNA聚合酶，細菌使用16S V3-V4 區特異性引物（上游引物：ACTCCTACGGGAGGCAGCA；下游引物：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）進行PCR擴增，真菌使用ITS1（a）（上游引物：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；下游引物：GCTGCGTTCTTCATCGATGC）進行PCR擴增。具體體系見表1。

PCR 擴增程序：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，重復該循環27次；最后72 ℃穩定延伸5 min。將擴增得到的DNA產物進行 2%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段用Axygen 凝膠回收試劑盒進行回收。利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit將PCR擴增回收產物進行熒光定量分析，根據熒光定量結果，根據每個樣本的測序量要求，對各個樣本按相應比例進行混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫，采用Agilent High Sensitivity DNA Kit對文庫進行質檢，再采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor熒光定量系統上對文庫進行定量，將合格的上機測序文庫梯度稀釋后，根據測序量按比例混合，經NaOH變性后上機測序；建庫與測序等工作委托武漢百易匯能生物科技有限公司完成。

1.5 數據分析

對于細菌的16S rRNA基因，選用Silva數據庫[7]，采用QIIME2的classify-sklearn算法[8]；對于真菌ITS序列，選用UNITE數據庫（Release 9.0）[9]。首先將測序得到的原始圖像數據轉化為序列數據，然后使用QIIME2（2023.7）軟件用DADA2方法[10]進行去重，以100%相似度聚類，生成特征序列ASVs。這些序列在樣本中的豐度表稱為特征表（對應于OTU表）。使用R語言將ASV/OTU數目繪制成柱狀圖，對ASV/OTU進行統計，可以獲得每個樣本中微生物群落在各分類水平上的物種組成。

2 結果與分析

2.1 微生物的分離鑒定

根據菌落典型特征，從活性干酵母中分離出了4種菌，包括木糖葡萄球菌、雞葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、乳酸乳球菌乳亞種（表2）。

2.2 高通量測序

如圖1～2所示，細菌的分類學在屬水平（genus）上獲得了較多的ASV/OTU數目，而真菌的分類學在種水平（species）上獲得了較多的ASV/OTU數目。

2.2.1 細菌物種組成分析 本研究在屬水平上統計出相對豐度排名前10的物種，繪制出各樣品對應的物種相對豐度圖。如圖3所示，J-1酵母中主要有不動細菌屬（Acinetobacter）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、桿菌屬（Bacillus）；J-2酵母中主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、土芽孢桿菌屬（Geobacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）；J-3酵母中主要有腸球菌屬、土地桿菌屬（Pedobacter）；J-4酵母中主要有桿菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）；J-5酵母中主要有魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬；J-6糖蜜中主要有明串珠菌屬（Leuconostoc）；J-7酵母蛋白胨中主要有葡萄球菌屬（Staphylococcus）；J-8、J-9酵母中主要有魏斯氏菌屬（Weissella）、桿菌屬、葡萄球菌屬。綜上，活性干酵母中通過高通量測序分析得到的酵母屬水平的細菌主要集中在桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌以及葡萄球菌屬。

2.2.2" 真菌物種組成 由圖4可知，J-5酵母中，僅有威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）；J-6糖蜜中，威克漢姆酵母屬豐度比達到75%以上，還有少量結合酵母屬（Zygosaccharomyces）；J-7酵母蛋白胨中，威克漢姆酵母屬豐度比接近50%。由此可以看出，活性干酵母中主要的真菌為威克漢姆酵母屬。

綜上，結合細菌和真菌的物種組成，表明活性干酵母的主要微生物菌群為桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌屬、葡萄球菌屬以及威克漢姆酵母屬；糖蜜的主要微生物菌群為明串珠菌屬、威克漢姆酵母屬和結合酵母屬；酵母蛋白胨的主要微生物菌群為葡萄球菌屬、威克漢姆酵母屬。

3 結論與討論

純培養法和高通量測序技術是常見的微生物多樣性分析方法。賈鑫等[3]基于純培養法結合高通量測序技術，成功解析了脹袋輻照鳳爪中的微生物多樣性。本研究通過純培養法及高通量測序技術分析活性干酵母中的微生物多樣性。純培養法結果表明，活性干酵母的主要微生物菌群為葡萄球菌和乳酸乳球菌。而高通量測序結果表明，活性干酵母的主要微生物為桿菌屬、明串珠菌屬、魏斯氏菌以及葡萄球菌屬和威克漢姆酵母屬。作為活性干酵母生產的原料，糖蜜主要微生物菌群為明串珠菌屬、威克漢姆酵母屬和結合酵母屬；酵母蛋白胨的主要微生物菌群為葡萄球菌屬、威克漢姆酵母屬。本研究為活性干酵母的微生物群落多樣性研究提供一定理論參考，但其具體的酵母菌相分析，還需進行進一步的分析與研究。

參考文獻

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（責任編輯：胡立萍）