醬油釀造中添加淀粉酶的應用研究

摘要：該研究基于低鹽固態發酵工藝，選用米曲霉3.042菌株制作大曲，并在制曲過程中引入外源淀粉酶進行酶法輔助發酵。通過單因素試驗確定了淀粉酶的最佳添加量，隨后對醬醪中還原糖、全氮、氨基酸態氮等理化指標進行跟蹤測定，同時對發酵終端醬油中的風味物質進行細致分析，最終對發酵終端醬油進行感官評價，以深入探究低鹽固態醬油釀造過程中外源淀粉酶發揮的作用。研究結果顯示，當淀粉酶添加量為大曲質量的0.05%時，大曲的淀粉酶活力提升了67.9%，同時醬油的氨基酸態氮含量和蛋白質利用率分別提升了10.8%、7.14%，感官方面，在色澤、醇香、麥芽香、煙熏香等方面有較大提升，同時酸味有小幅降低。綜上所述，適量添加外源淀粉酶不僅可以強化大曲酶系，而且具有提高醬油原料利用率和改善醬油風味的效果，該研究結果為今后在醬油釀造過程中添加外源淀粉酶進行酶法輔助發酵技術開發提供了相關依據和參考。

關鍵詞：低鹽固態醬油；淀粉酶；理化特性；風味物質；感官評定

中圖分類號：TS264.21""""""文獻標志碼：A"""""文章編號：1000-9973（2025）02-0087-06

Study on Application of Addition of Amylase in Soy Sauce Brewing

WANG Bing-hui¹， ZHAO Yue¹， SUN Cheng-guo²， MO Fang-hua¹， TIAN Yu-tong¹，

SHEN Zhan-yu¹， WANG Chun-ling^1*

（1.College of Food Science and Engineering， Tianjin University of Science and Technology，

Tianjin 300457， China; 2.R amp; D Center， COFCO-Oils， Beijing 100020， China）

Abstract： In this study， based on the low-salt solid-state fermentation process， Aspergillus oryzae 3.042 strain is selected to make Daqu， and exogenous amylase is introduced for enzyme-assisted fermentation during koji making process. Through single factor test， the optimal addition amount of amylase is determined， and then the physicochemical indexes such as reducing sugar， total nitrogen and amino acid nitrogen in sauce mash are tracked and measured， meanwhile， a detailed analysis of the flavor substances in the soy sauce at the terminal of fermentation is conducted， finally， the sensory evaluation of soy sauce at the terminal of fermentation is carried out， so as to deeply explore the role of exogenous amylase during the brewing of low-salt solid-state soy sauce. The results show that when the addition amount of amylase is 0.05% of the mass of Daqu， the amylase activity of Daqu increases by 67.9%. At the same time， amino acid nitrogen content and protein utilization rate of soy sauce increase by 10.8% and 7.14% respectively. In terms of sensory indexes， there is a significant improvement in color， mellow aroma， malt aroma， smoky aroma and so on， while the sourness slightly decreases. In summary， adding an appropriate amount of exogenous amylase not only strengthens Daqu enzyme system， but also has the effect of increasing the utilization rate of soy sauce raw materials and improving soy sauce flavor. The research results have provided relevant basis and references for the development of enzyme-assisted fermentation "technology with the addition of exogenous amylase during soy sauce brewing in the future.

Key words： low-salt solid-state soy sauce; amylase; physicochemical properties; flavor substances; sensory evaluation

醬油是基于蛋白質原料如大豆、豆粕，以及淀粉原料如面粉、小麥，加入水、食鹽釀造而成的調味品。在曲霉和酵母菌、乳酸菌等微生物作為關鍵參與者的條件下所分泌的蛋白酶、淀粉酶等酶系，通過對原料的水解作用產生多種有機化合物，如氨基酸、糖類物質，賦予了醬油獨特的滋味和口感，而特殊的微生物代謝過程也影響了醬油的色澤和風味，使醬油成為具有特殊色、香、味、體的調味品^[1]"，在東亞和東南亞地區的餐飲業、日常烹飪和食品工業中被廣泛使用^[2]。米曲霉在發酵過程中可以產生豐富的酶系，與醬油的風味形成密切相關。在醬油釀造過程中，米曲霉是大部分酶類和芳香類物質的來源，其最重要的作用是產生多種蛋白質水解酶，將大分子物質降解成小分子物質，從而形成醬油的香味物質^[3]"，進而進一步影響醬油的揮發性氣味^[4]。

淀粉酶是可以分解淀粉糖苷鍵的一類酶的統稱，能夠水解淀粉類等大分子物質，產生葡萄糖、麥芽糖等小分子物質，單糖和寡糖是醬油甜味的重要來源，同時伴有美拉德反應，在醬油發酵過程中，一些小分子物質可以被微生物利用^[5]，進而轉化成醇類等風味物質，因此，淀粉酶對醬油的風味具有非常重要的作用。低鹽固態發酵工藝大多使用單一菌種，酶系不足，并且由于前期發酵溫度設定偏高，容易造成酶系失活速度加快等問題^[6]，從而對酶系分解利用原料產生不利影響，影響發酵后期風味物質的形成，同時原料利用率也偏低^[7]。

針對這些問題，國內外開展了有關在醬油生產中使用酶制劑的研究，但存在使用酶制劑的種類有限和添加量不明確等問題。本研究通過添加外源淀粉酶來調整酶的配比，使醬油成曲的酶系得以豐富強化，后期發酵原料利用得更加徹底，醬油的品質提高，為企業使用酶制劑輔助發酵生產醬油提供了理論依據和技術支撐，具有推廣應用價值。

1"材料和方法

1.1"原料與菌種

豆粕、麩皮：市售；米曲霉3.042：由本實驗室保藏。

1.2"試驗試劑

米曲汁培養基、察氏培養基：北京索萊寶科技有限公司；食品級淀粉酶：河南省萬邦實業有限公司；硼酸、氯化鈉：天津市風船化學試劑科技有限公司；硫酸、鹽酸：天津市化學試劑供銷公司。

1.3"儀器與設備

K9840自動凱氏定氮儀"山東海能科學儀器有限公司；Multiskan GO酶標儀"美瑞泰克科技（天津）有限公司；FE20/EL20 pH計"美國梅特勒-托利多儀器公司；LRH-250-A生化培養箱"上海賀杰儀器有限公司；GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜-質譜聯用儀"日本島津公司。

1.4"培養基與溶液

1.4.1"種曲培養基

按照1∶1.1的比例，稱量約30 g麩皮于錐形瓶中，加入溫度為80～90 ℃、質量約為33 g的熱水，用玻璃棒攪拌均勻，用棉塞、牛皮紙和橡皮筋密封，于121 ℃高溫滅菌20 min，備用。

1.4.2"可溶性淀粉

稱取1 g可溶性淀粉，用緩沖液定容至100 mL。

1.5"試驗方法

1.5.1"制曲工藝

1.5.1.1"種曲的制備

使用接種環于墨綠色米曲霉斜面上劃取適量生長旺盛的孢子接入溫度已降至40 ℃以下的種曲培養基中，確保其充分均勻地與原料接觸，于30 ℃堆積培養，15 h后振蕩麩皮使其松散，使孢子進行二次接種，平鋪培養6～8 h后再次搖瓶，保持平鋪狀態48 h后即可將成熟種曲放入55 ℃的烘箱中烘干8 h，備用。

1.5.1.2"大曲的制備

取120 g豆粕于2 L燒杯中，加入200 g熱水完全浸泡，用玻璃棒攪勻并覆上保鮮膜浸泡1 h，然后加入80 g麩皮拌勻，再用濕潤透氣的布料將其裹起，于滅菌鍋中滅菌后，將曲料翻搗至溫度低于40 ℃，加入0.6 g種曲，堆疊于30 ℃的培養箱中培養，生長15 h左右，待大曲溫度升高至38 ℃時進行第一次翻曲，平鋪培養22 h后二次翻曲，保持平鋪狀態，培養至42 h時大曲成熟^[8]。

1.5.2"發酵工藝

采用低鹽固態發酵工藝，以豆粕和麩皮作為原料制作大曲，再以1∶1.25的配比加入12%鹽水，入罐進行發酵。43 ℃恒溫發酵10 d后，降溫至33 ℃再發酵18 d，總發酵周期為28 d。

1.5.3"大曲中淀粉酶活力的測定

淀粉酶活力的測定參考徐歡歡^[9]的方法。

1.5.4"理化指標的測定

稱取10 g發酵過程中的醬醪，用研缽研磨碾碎后，在100 mL容量瓶中定容，在4 ℃、3 850 r/min的條件下離心15 min，取上清液測定各項指標。

pH值的測定：采用pH計測定；總酸、氨基酸態氮、全氮含量的測定：分別參考GB 12456—2021、GB 5009.235—2016、GB/T 18186—2000中的方法；還原糖含量的測定：采用彥繁鶴等^[10]的方法。

1.5.5"醬油指標的測定

1.5.5.1"氨基酸態氮生成率的計算

氨基酸態氮生成率（%）=ANTN×100%。

式中：AN為醬油中氨基酸態氮含量，g/100 mL；TN為醬油中全氮含量，g/100 mL。

1.5.5.2"蛋白質利用率的計算

蛋白質利用率（%）=（m₁×TN₁d₁+m₂×TN₂d₂）×6.25m′×100%。

式中：m₁、m₂分別為醬油頭油、二油的產量，kg；TN₁、TN₂分別為醬油頭油、二油的全氮含量，g/100 mL；d₁、d₂分別為醬油頭油、二油的相對密度；m′為混合原料蛋白質總量，kg；6.25為全氮折算成蛋白質的系數。

1.5.6"揮發性風味物質的測定分析

利用SPME-GC-MS技術對醬油中的風味物質進行分析和研究^[11]。

1.5.7"醬油的感官評定

將頭油、二油等比例混勻后進行巴氏殺菌操作。選擇七點線性標度表示醬油的感官特征強度^[12]。表1中1～7表示醬油的感官特征強度逐漸增強^[13]。

2"結果與分析

2.1"不同淀粉酶添加量對大曲中淀粉酶活力的影響

大曲是生產醬油的重要原料，其產生的豐富酶系能夠將淀粉類物質轉化成糖類物質，將蛋白質轉化成氨基酸和多肽，同時對最終產品的風味、口感和質量也具有決定性作用^[14]。淀粉酶能夠作用于原料中的淀粉類物質，催化水解淀粉類大分子物質，生成葡萄糖、麥芽糖等小分子物質^[15]，可參與多種合成反應，對醬油的色澤、體態和風味的形成均有重要作用。

以低鹽固態工藝進行發酵，每隔7 d取樣一次，測定醬油的pH、總酸等指標，直至28 d發酵結束。確定合適的酶制劑添加量對原料分解利用十分重要，以淀粉酶為研究對象，在大曲制作過程中的24，36，42，48 h 4個時間點分別取樣，設定大曲制作過程中不添加淀粉酶的組別為空白組，在大曲制作過程中0 h時分別添加大曲質量0.05%、0.3%、0.5%的淀粉酶為試驗組，測定空白組與試驗組的淀粉酶活力變化情況。

由圖1可知，淀粉酶活力隨著時間的增加逐漸上升，4組大曲中的淀粉酶活力均在48 h時達到最大值，可以明顯看出，在48 h時淀粉酶添加量為0.5%的試驗組淀粉酶活力的提升最顯著，最大值可達1 189 U/g，此時空白對照組的淀粉酶活力為651 U/g，該試驗組淀粉酶活力提高了82.6%；其次為0.3%試驗組，淀粉酶活力在48 h時為1 170 U/g，提高了79.7%；最后是0.05%試驗組，在48 h時淀粉酶活力達1 093 U/g，提高了67.9%。

2.2"不同淀粉酶添加量對理化指標的影響

2.2.1"pH值的測定

醬醪的發酵體系通常處于偏酸性的環境，這種環境有利于發酵后期各酶系分解原料，生成小分子物質，對醬油風味的形成有益。由圖2可知，4組pH值均隨著發酵時間的延長而降低，在前7 d迅速下降，隨后pH值下降幅度趨于平穩，至發酵終端時，醬醪的pH值在4.9～5.0左右，總體偏酸性。

2.2.2"總酸含量的測定

醬油的總酸含量指的是其有機酸含量，有機酸含量是一個重要的評價指標，直接關系到醬油的口感和品質。由圖3可知，隨著發酵時間的延長，總酸含量總體呈現增加的趨勢，前7 d上升幅度較快，隨后增加趨勢漸緩。可以明顯看出，0.5%淀粉酶組的總酸含量最高，在28 d時可達2.197 g/100 mL，此時空白對照組的總酸含量為1.856 g/100 mL，由此得出0.5%淀粉酶組的總酸含量提高了18.4%。

2.2.3"氨基酸態氮含量的測定

氨基酸和肽類是醬油呈味物質的主要來源，在醬油發酵期間由蛋白質分解生成。醬油品質的分類中一項是以氨基酸態氮含量為標準，氨基酸態氮含量高的醬油品質較好^[16]。由圖4可知，隨著發酵時間的延長，醬醪中的氨基酸態氮含量呈上升趨勢，前7 d迅速升高，隨后緩慢增加，在28 d時，0.05%淀粉酶組的氨基酸態氮含量最高，為0.859 5 g/100 mL，較氨基酸態氮含量為0.775 5 g/100 mL的空白組提升了10.8%。

2.2.4"全氮含量的測定

全氮作為醬油品質評估的重要理化指標，能夠體現出醬油的成分和營養價值，通過測定全氮含量，可深入了解醬油中的氨基酸、蛋白質等成分。由圖5可知，發酵期間，醬醪中的全氮含量隨著發酵時間的增加而升高，且在發酵前7 d上升迅速。在發酵終端，0.05%淀粉酶組的全氮含量最高，達到1.700 g/100 mL，較全氮含量為1.550 g/100 mL的空白組提升了9.7%。

2.2.5"還原糖含量的測定

由圖6可知，發酵前7 d，還原糖含量迅速升高，在第7天時達到最高值，隨后還原糖含量開始下降。在第7天時，0.3%淀粉酶組的還原糖含量明顯高于另外3組，為3.356 g/100 mL，較還原糖含量為2.935 g/100 mL的空白組提升了14.3%，這可能是由于適量淀粉酶的加入促進了淀粉質原料的分解，產生了更多的還原糖^[17]。

2.3"不同淀粉酶添加量對醬油成品指標的影響

2.3.1"醬油成品的理化指標

醬油成品的各項理化指標見圖7。

由圖7可知，0.05%淀粉酶組的氨基酸態氮含量最高，為0.631 g/100 mL，較氨基酸態氮含量為0.563 g/100 mL的空白對照組提高了12.1%。對于還原糖含量而言，4個組別中0.5%淀粉酶組的還原糖含量高于其他組，為1.075 g/100 mL，相較于還原糖含量為0.921 g/100 mL的空白對照組提高了16.7%；0.05%淀粉酶組的還原糖含量為1.006 g/100 mL，較空白對照組提升了9.2%。4組醬油全氮含量在0.95～1.10 g/100 mL之間。在總酸含量方面，0.5%淀粉酶組的總酸含量最高，為1.825 g/100 mL，而0.3%淀粉酶組的總酸含量最低，為1.507 g/100 mL。

2.3.2"醬油成品的氨氮轉化率

由圖8可知，0.05%淀粉酶組的氨氮轉化率最高，達59.15%，相較于空白組提高了3.75%，表明適量淀粉酶的引入對原料的分解具有顯著的促進效果，有助于更充分地利用原料中的大分子物質。

2.3.3"醬油成品的蛋白質利用率

蛋白質利用率作為衡量原料利用效率的重要技術指標，在醬油發酵中扮演著至關重要的角色，高蛋白質利用率不僅能夠促進風味物質的形成，使醬油呈現更復雜和豐富的口感，而且可對醬油的香氣產生積極的影響，同時還能有效提升醬油的產量，且無需額外增設設備，從而有效提高整體經濟效益。4組醬油成品的蛋白質利用率見圖9。

由圖9可知，空白組、0.03%淀粉酶組、0.3%淀粉酶組、0.5%淀粉酶組的蛋白質利用率分別為81.07%、86.86%、84.69%、79.28%，添加0.05%淀粉酶組的蛋白質利用率最高，與空白組相比提高了7.14%，說明其能夠較好地利用原料中的蛋白質。綜上，淀粉酶的最佳添加量為0.05%。

2.4"添加淀粉酶對醬油成品風味物質的影響

通過SPME-GC-MS技術對醬油中風味物質進行測定，由圖10中a可知，空白組共含有59種風味物質，0.05%淀粉酶組共含有68種風味物質，其中醇類15種，比空白組多5種；醛類15種，比空白組少1種；酮類12種，比空白組多1種；烴類7種，比空白組多4種；酸類、酯類均5種，酚類2種，吡嗪類6種，其他類1種，以上種類數與空白組相同。

由圖10中b可知，與空白組風味物質的相對含量相比，0.05%淀粉酶組中，醇類、醛類、酮類、烴類物質的相對含量均有不同程度的提升，同時，酯類、酚類、吡嗪類物質的相對含量變化不大，而酸類物質的相對含量呈現小幅度的降低。

由圖11中a可知，空白組主要分布在第二、三象限，而0.05%淀粉酶組主要分布在第一、四象限，這種明顯的分布差異表明兩類樣品在主成分空間中區分明顯。采用S-plots分析，通過VIP預測值成功找到了15種符合條件的差異性物質，更精確地定位到了引起這些差異的典型風味物質。為深入了解這些差異性風味物質之間的關系，對它們進行了聚類分析（見圖11中b），其中醛類物質5種，包括正戊醛（n-pentanal）、2-甲基丁醛（2-methyl-butanal）、苯乙醛（phenylacetaldehyde）、反-2-辛烯醛（trans-2-octenal）、正辛醛（octanal）；醇類物質4種，包括1-辛烯-3-醇（1-octen-3-ol）、異戊醇（3-methyl-1-butanol）、苯乙醇（phenylethyl alcohol）、3-辛醇（3-octanol）；酸類物質2種，包括異戊酸（3-methyl-butanoic acid）、2-甲基丁酸（2-methylbutanoic acid）；酮類物質為1-辛烯-3-酮（1-octen-3-one）；酚類物質為愈創木酚（2-methoxy-phenol）；烴類物質為2，3-二甲基戊烷（2，3-dimethyl-pentane）；其他類物質為二甲基二硫（2，3-dithiabutane）。在這些風味物質中，相對含量較高的苯乙醛來源于苯丙氨酸的降解，具有花香；1-辛烯-3-醇的前體物質是1-辛烯-3-酮，具有蘑菇香^[18]。更多的醛類物質也為醬油成品增添了麥芽香氣^[19]。0.05%淀粉酶組中醇類、醛類物質相對含量的升高可能是由于淀粉酶的加入加速了對原料中淀粉類物質的分解利用，從而生成更多的糖類物質，有助于糖類物質通過代謝作用產生更多的醇類、醛類物質。

2.5"淀粉酶添加量對醬油成品感官的影響

由表2可知，0.05%淀粉酶組的總分最高。該組在體態、色澤上較空白組有較高提升，在醇香、麥芽香、煙熏香等方面也有一定改善，同時酸味有小幅降低。這可能是因為適量淀粉酶的添加增加了醬油中還原糖含量，促進了美拉德反應，生成了大分子物質類黑精和呈味的美拉德肽^[20]，對醬油的色、香、味產生了積極的影響。

得分結果在蜘蛛網圖上的分布情況見圖12。

由圖12可知，0.05%淀粉酶組在醇香、醬香、煙熏香和麥芽香上的得分較突出，與理化分析結果相符。綜合考慮，淀粉酶的最佳添加量為大曲質量的0.05%。

3"結論

本研究對低鹽固態發酵工藝的優化進行了深入探討，通過向大曲中添加不同比例的外源淀粉酶，研究了其對大曲淀粉酶活力、醬醪的各項理化指標以及發酵終端成品指標的影響，綜合判定外源淀粉酶添加量為大曲質量的0.05%為宜。相較于空白對照組，0.05%淀粉酶組的各項指標有不同程度的提升，還原糖含量和氨基酸態氮含量變化幅度明顯，分別提升了7.16%、10.8%，蛋白質利用率提高了7.14%，同時氨氮轉化率略有增加，提升了3.75%。風味物質方面，醇類、醛類、烴類等相對含量有所提升，醬油成品在麥芽香、煙熏香和醇香等方面的感官得到明顯改善。因此，添加外源淀粉酶使得醬油的原料利用率有所提升，同時也改善了醬油產品的品質和風味，具有一定的推廣應用價值，為醬油工業的技術改進和品質提升提供了參考。

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