RNA干擾沉默褐飛虱糖轉運蛋白基因4的研究

摘要：褐飛虱是水稻上危害最嚴重的害蟲之一，目前的防治措施存在各種弊端，開展控制褐飛虱的探索研究可開辟新的防治途徑。本研究利用dsRNA（douhle-stranded RNA，雙鏈RNA）介導的RNAi（RNA interfer-ence，RNA干擾）技術，以褐飛虱糖運輸蛋白基因（Mst4）為靶標，在體外合成Nlst4的dsRNA，將其飼喂褐飛虱若蟲后，其體內目標基因表達量顯著下降，產生致死表型；構建Ntst4的RNAi干擾載體，通過農桿菌侵染轉化培育轉基因水稻，褐飛虱取食后，體內目標基因轉錄水平顯著降低，1齡、2齡若蟲發育歷期顯著延長，但未出現致死表型。試驗結果證實，利用RiVAi技術通過培育轉基因水稻防治褐飛虱存在可行性，可為后續轉基因抗褐飛虱水稻的培育提供科學依據。

關鍵詞：褐飛虱；RNA干擾；糖轉運蛋白基因4；人工飼喂；轉基因水稻

中圖分類號：S433.3；Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025）01-0022-08

褐飛虱（Nilaparvata lugens Stal）屬半翅目（Hemiptera）飛虱科（Delphacidae），為單食性害蟲，只能在水稻和普通野生稻上取食和繁殖后代，通過刺吸取食水稻植株營養以及傳播草狀叢矮病和齒葉矮縮病等水稻病毒病等方式進行為害，是水稻上危害最嚴重的害蟲之一。褐飛虱種群具有繁殖能力強、可遷飛的特點，防治措施仍以化學防治為主，導致褐飛虱抗藥性、環境污染等問題日益加劇，因此，迫切需要發展新的防治措施來防治褐飛虱。

dsRNA（double-stranded RNA，雙鏈RNA）介導的RNAi（RNA intederence，RNA干擾）技術首次在秀麗線蟲中發現而被廣泛關注，之后作為基因功能研究的重要手段而被廣泛應用。隨著RNAi干擾技術的不斷完善，其在害蟲防治研究中取得重要進展，已經實現了利用轉基因技術培育表達產生目標基因的dsRNA的轉基因植物，從而達到對目標害蟲進行防治的目的。例如，Baum等通過轉基因技術，獲得了可表達AT-Pase A基因dsRNA的轉基因玉米，對鞘翅目害蟲玉米根螢葉甲有良好的防治效果。Mao等培育出可表達P450（ CYP6AE14）基因dsRNA的轉基因棉花，可明顯抑制鱗翅目害蟲棉鈴蟲的生長發育。因此，利用轉基因技術培育可表達產生目標基因dsRNA的轉基因植物，對目標害蟲中目標基因功能進行干擾從而達到防治目的已成為可能。

利用RNAi技術培育轉基因水稻進行目標基因的調控以達到防治褐飛虱的目的，關鍵在于選擇合適的目標基因。飼喂法是褐飛虱通過口針攝取體外合成的dsRNA，它可以很好地模擬褐飛虱自然取食的效果，是篩選目標基因培育轉基因水稻防治褐飛虱等刺吸性害蟲的最佳方法。目前，大部分的研究主要集中在對褐飛虱基因的功能驗證方面，僅有少數研究者通過培育轉基因水稻表達目標基因dsRNA，來驗證此方法對褐飛虱防治的作用是否顯著。Zha等采用RNAi技術，以NLHTl（hexose transporter gene）等3個基因為目標基因培育轉基因水稻，發現褐飛虱體內目標基因轉錄水平明顯降低，但未發現褐飛虱表型的明顯變化。陸琳等以a-l鏈微管蛋白-dsl、微管蛋白特異的伴侶分子c-dsl0為干擾目標培育轉基因水稻，進行褐飛虱防治研究，結果顯示，取食轉基因植株后，部分蟲體目標基因的轉錄水平下降顯著，但未觀察到蟲體死亡現象。

在生物體內，糖分不僅提供能量及碳源，而且在信號傳導和滲透過程也起著重要的作用。然而，糖分不能直接通過細胞膜，其在細胞間或者亞細胞之間交換需要糖轉運蛋白介導。褐飛虱主要糖分能量來源于水稻韌皮部汁液，褐飛虱取食的蔗糖不能直接穿過中腸上皮細胞而被吸收利用，需在腸內水解為葡萄糖和果糖經糖轉運蛋白轉運至血淋巴中才能被吸收利用，因此糖轉運蛋白在褐飛虱等刺吸性害蟲的生長發育過程中起著極其重要的作用。Price等對預測的93個褐飛虱糖轉運蛋白基因進行鑒定，最終獲得18個糖轉運蛋白基因，其中Nlstl、Nlst4、Nlst6、Nlst9、Ntst12、Nlst16及Ntst18在中腸高表達。褐飛虱糖轉運基因6（Nlst6）在將蔗糖水解產物葡萄糖、果糖轉運至血淋巴被褐飛虱吸收利用過程中起著重要作用，NLst6下調對產卵前期、產卵期、產卵數量和體重等方面產生顯著影響。

本研究選取在褐飛虱中腸特異表達的糖轉運基因4（sugar transporter 4，Nlst4，GenBank accession：AB549997.1）為研究對象，利用飼喂法進行RNAi的研究，了解褐飛虱取食外源合成目標基因dsRNA后的生長發育狀況：構建基因Ntst4的RNAi載體，用獲得的可表達Nlst4 dsRNA的轉基因材料飼喂褐飛虱，研究褐飛虱體內目標基因Nls4的表達及褐飛虱生長發育變化情況，探索防治褐飛虱的新途徑。