馬鹿鹿茸原代前軟骨與軟骨細胞電穿孔法轉染研究

關鍵詞：電穿孔轉染；鹿茸原代細胞；質粒；電轉染效率；細胞存活率

在細胞與分子生物學研究中，細胞膜是外源生物大分子導入細胞的主要屏障［1］。1982 年，Neumannet al.［2］在體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中第1次利用電穿孔傳遞基因。其原理是通過將細胞暴露于脈沖電場中來提高細胞膜的通透性，從而將RNA、DNA、肽或小分子跨膜傳輸，遞送到細胞以及整個組織和生物體中［3］。基于此原理形成的電轉染技術為將外源核酸大分子轉染導入細胞提供了一種非常重要的方法。目前常用的細胞轉染方法包括脂質體轉染、逆轉錄病毒轉染、慢病毒轉染、磷酸鈣沉淀和電穿孔轉染（簡稱“電轉染”）等［4］。其中，電轉染技術憑借簡單、方便、重復性好和高效率等優(yōu)點已被廣泛應用于導入報告基因進行標記指示或者具體的靶標功能基因研究，也常用于導入化學藥物、蛋白和抗體等其他分子，以觀察其對細胞結構和生理功能變化的影響和機制探究［5］。

鹿茸是大多數(shù)鹿科（Cervidae）動物（除馴鹿Rangifer tarandus 外）雄性個體第二性征，鹿茸是在雄鹿進入發(fā)情期前生成，每年更新一次［6］。它是目前所知哺乳動物中唯一可以周期性再生的器官。鹿茸再生的細胞生物學基礎可能是干細胞［7?8］，但目前仍然具有爭論［9?10］。廣大研究者一直以來都把鹿茸的生長發(fā)育和再生機理作為研究的重點和熱點［11］。從組織學和發(fā)育生物學的角度看，整個鹿茸再生過程包括創(chuàng)傷修復、軟骨生成、骨生成和礦化等復雜的過程［12?13］，因而再生鹿茸已成為研究哺乳動物器官再生機理的重要模型。由于軟骨生成是鹿茸快速再生期的核心事件之一，研究人員前期對其開展了大量研究［14?15］。鹿茸前軟骨和軟骨組織在表觀遺傳學上存在顯著差異，甲基化研究顯示涉及軟骨生成的6 個關鍵基因（TNFRSF11B、TRPV4、HYAL2、MMP16、EIF2A 和SCIN）基因組甲基化水平在鹿茸前軟骨和軟骨組織中表達差異顯著［16］，2種組織RNA-Seq 分析進一步證實上述基因表達存在差異，提示鹿茸軟骨再生存在尚未發(fā)現(xiàn)的新調控機理［17］。這些發(fā)現(xiàn)迫切需要在細胞水平上開展研究證實。

原代細胞是指從活體動物器官或組織中新鮮分離出來并在體外立即進行培養(yǎng)的細胞［18］，由于它們可以很好地反映細胞在體時的生物學特性，因而用于遺傳學和細胞生物學等試驗研究，可以獲得與在體生理功能更接近的數(shù)據(jù)結果。部分研究團隊使用鹿茸原代細胞開展研究已取得了較大進展。Zhonget al.［19］研究發(fā)現(xiàn)使用IGF-1處理鹿原代軟骨細胞可以上調細胞增殖、分化和細胞外基質（ECM）相關基因的表達。Zhou et al.［20］使用TGF-β 對鹿茸原代軟骨細胞刺激，進一步揭示TGF-β 信號通路具有通過調節(jié)軟骨細胞增殖、分化和ECM合成來促進軟骨生成的功能。Liu et al.［21］利用CRISPR-Cas9慢病毒載體敲除梅花鹿（Cervus nippon）鹿茸TGF-β 基因，發(fā)現(xiàn)敲除該基因可抑制原代軟骨細胞的增殖并增強遷移能力，證明TGF-β 是梅花鹿茸快速生長的關鍵調控因子。但是，對原代鹿茸細胞能否使用電轉染法開展研究？各電轉染參數(shù)對轉染效率以及細胞存活率有何影響？目前相關研究還處于空白。本研究以馬鹿（C. elaphus）鹿茸前軟骨和軟骨組織原代細胞為對象，嘗試利用電穿孔法轉染增強型綠色熒光蛋白（EGFP）報告基因，對相關電轉染參數(shù)進行對比研究，以期為后續(xù)開展電轉染技術在鹿茸再生機理研究中的應用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集及原代細胞制備

選取2頭馬鹿雄性個體（3歲），取其生長期約為60 d的新鮮鹿茸。清洗鹿茸并取其頂端5 ～ 7 cm，縱切組織后，分離出前軟骨和軟骨組織置于PBS雙抗緩沖液中。鹿茸原代前軟骨和軟骨細胞的制備參照已有方法［22］。將各組織切成3 ～ 4 mm小塊，加足量HBSS 緩沖液浸沒組織塊，分別加入透明質酸酶15 mL，37 ℃孵育1. 0 ～ 1. 5 h后，組織塊逐漸呈蓬松狀。離心去除透明質酸酶并用PBS清洗，低速離心后吸掉清洗液。按照50 ～ 200 U/mL用量加入適量膠原酶Ⅱ，置于水平搖床37 ℃孵育4 ～ 18 h。待組織塊完全消失，孵育結束。將消化完畢的細胞混合物用無菌尼龍網(wǎng)過篩，殘留組織可再添加適量的新鮮膠原酶工作液，并于37 ℃孵育以進一步解離。將過篩收集到的細胞用HBSS緩沖液清洗數(shù)遍后，低速離心，棄掉清洗液，再用適當?shù)募毎囵B(yǎng)液重懸細胞，并用自動細胞計數(shù)器或手動法進行活細胞數(shù)檢測。最后根據(jù)細胞數(shù)量，轉移細胞液到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，將細胞（密度1 × 106 個/mL）凍存于液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 質粒提取

報告基因表達載體pCMV-C-EGFP購自上海碧云天生物技術股份有限公司。取出保存于冰箱的載體菌種，使用時吸取10 μL，在含有氨芐抗性的固體LB瓊脂培養(yǎng)皿中平板劃線，37 ℃過夜培養(yǎng)。在固體培養(yǎng)皿中挑取單個菌落置于液體LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)16 ～ 24 h。質粒提取使用EasyPure 去內(nèi)毒素質粒大提試劑盒（天根，中國北京）進行。使用核酸定量檢測儀測定提取質粒質量濃度，于冰箱中-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 細胞培養(yǎng)與電穿孔轉染

以廣泛使用的人胚腎來源的293T 細胞（普諾賽，中國武漢）作為一個平行實驗組。將凍存于液氮中的293T細胞、前軟骨細胞和軟骨細胞復蘇，并分別用含有10%FBS和雙抗的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞密度生長至80% ～ 90%時進行電轉染。對每種細胞用0. 25%胰酶消化處理，離心后吹打為單細胞懸液，用顯微鏡計數(shù)并調節(jié)細胞密度為1 × 106 ～ 5 ×106 個/mL 后，再離心，用緩沖液吹打成細胞懸液，將細胞懸液分別與質量濃度為10、20、30、40、50、60 μg/mL 的EGFP 質粒混合均勻，按照方波系統(tǒng)電穿孔參數(shù)條件（表1，表2）轉染。電穿孔轉染后將細胞轉至六孔板，顯微鏡觀察后置于培養(yǎng)箱中（37 ℃、CO2體積分數(shù)5%）培養(yǎng)，24 h后觀察293T轉染情況，48 h 后觀察鹿茸原代細胞轉染情況。依據(jù)已有文獻［23］，細胞轉染效率以電穿孔轉染后具有綠色熒光陽性細胞數(shù)占存活細胞總數(shù)百分比計算；細胞存活率以電穿孔后活細胞總數(shù)占未電穿孔條件活細胞總數(shù)百分比計算。

1. 4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)分析及作圖均采用軟件GraphPad Prism9. 0，質粒質量濃度對鹿茸原代細胞電轉染效率和存活率的影響以及不同脈沖長度對293T電轉染效率和存活率的影響用單因素方差分析，鹿茸原代細胞電轉染反應體系和電轉參數(shù)的優(yōu)化用t 檢驗，以P lt;0. 05為差異顯著，P lt; 0. 01為差異極其顯著。

2 結果

2. 1 鹿茸原代細胞電轉染反應體系

所有電穿孔實驗均使用方波系統(tǒng)。對鹿茸前軟骨細胞，以電壓500 V、脈沖長度（pulse length，PL）0. 4 ms、脈沖間隔（pulse intervals，PI） 3 s、脈沖次數(shù)（number of pulses，NoP）2、質粒質量濃度20 μg/mL進行電轉染，存活率保持85%，但無有效轉染。保持電壓和質粒質量濃度不變，延長脈沖長度至1. 3 ms、脈沖間隔至0 s，脈沖次數(shù)減為1，細胞存活率升至97%，轉染效率提高到2%（圖1A、B）。以此為基礎，固定脈沖次數(shù)和質粒質量濃度，進一步以電壓700 V、脈沖長度1. 4 ms進行電轉染，結果顯示細胞全部喪失活性。由此可知，鹿茸前軟骨細胞電轉染電壓為500 ～ 700 V，脈沖長度為0. 4 ～ 1. 4 ms，脈沖次數(shù)優(yōu)選1或2次，其電轉參數(shù)條件可以此為基礎進一步優(yōu)化。

對于鹿茸軟骨細胞，在電壓為500 V、質粒質量濃度為20 μg/mL條件下，改變脈沖長度、脈沖次數(shù)和脈沖間隔，當脈沖長度從0. 2 ms延長至1. 0 ms，脈沖次數(shù)由2降為1，脈沖間隔至0 s，轉染效率則由0提升至2%（圖1C、D）。再進一步穩(wěn)定電壓，以脈沖長度1. 3 ms-脈沖次數(shù)2-脈沖間隔10 s參數(shù)進行轉染，發(fā)現(xiàn)細胞活性降為0。由此可以推定，鹿茸軟骨細胞電轉染時電壓500 V，脈沖長度0. 2 ～ 1. 3 ms，脈沖次數(shù)1或2次，脈沖間隔可適當延長，其電轉參數(shù)條件可以此為基礎進一步優(yōu)化。

平行實驗組293T 細胞以電壓500 V-脈沖長度0. 4 ms-脈沖次數(shù)2-脈沖間隔10 s的條件進行電轉染，轉染效率最高可達45%（圖1E、F）。當脈沖長度以梯度形式電轉染293T，轉染效率逐漸升高，存活率卻出現(xiàn)下降趨勢（圖2）。

2. 2 鹿茸原代細胞電轉染參數(shù)優(yōu)化

依據(jù)已建立的反應體系，進一步探索關鍵參數(shù)優(yōu)化的可能性。對于鹿茸前軟骨組織原代細胞，當質粒質量濃度為20 μg/mL，增加了脈沖間隔和脈沖次數(shù)，同時減短脈沖長度；或者在同樣質粒質量濃度條件下，設定脈沖次數(shù)為3且脈沖間隔為10 s，2種參數(shù)體系的轉染效率相似（P gt; 0. 05），表明脈沖長度、脈沖間隔和脈沖次數(shù)參數(shù)之間存在相關性，均對前軟骨組織原代細胞電轉染效率有影響。對于軟骨組織原代細胞，減少脈沖長度；或不改變脈沖長度但增加脈沖次數(shù)時，細胞轉染效率大約可提升至3%。這說明目前原代細胞轉染效率還有提升的空間，多參數(shù)協(xié)同調節(jié)可能比僅調節(jié)單一參數(shù)更易獲得更高的轉染效率。

2. 3 不同質粒質量濃度對鹿茸原代細胞的轉染效率及存活率的影響

為進一步研究質粒質量濃度這個關鍵要素對鹿茸原代細胞轉染效率和存活率的影響，在電壓500 V-脈沖長度0. 9 ms-脈沖次數(shù)2-脈沖間隔10 s的條件下，按質量濃度梯度（10、20、30、40、50、60 μg/mL）將質粒分別電轉染入鹿茸前軟骨和軟骨組織原代細胞。前軟骨原代細胞試驗結果顯示：增大質粒質量濃度可顯著提高轉染效率（P lt; 0. 05，圖3），但隨著質粒質量濃度增大，細胞存活率有略下降的趨勢，雖然統(tǒng)計結果并不顯著（P gt; 0. 05）。使用同樣電轉染條件，鹿茸軟骨原代細胞卻顯示出：當質粒質量濃度為10 μg/mL 時，鹿茸軟骨細胞具有較高的轉染效率，且存活率為85%；隨著質粒濃度增加轉染效率逐漸降低（P lt; 0. 01），且存活率也在質粒質量濃度超過30 μg/mL后顯著下降（P lt; 0. 01）；當質粒質量濃度超過40 μg/mL 后，細胞無法存活且轉染效率為0（圖4）。從區(qū)間看：質粒質量濃度為40 ～ 60 μg/mL時有較好的細胞存活率（70% ～ 80%），轉染效率為2% ～ 4%（圖3）；而在質粒質量濃度為20 ～ 30 μg/mL時，鹿茸軟骨細胞轉染效率極低（1% ～ 2%）。在質粒質量濃度為10 ～ 20 μg/mL時，軟骨原代細胞存活率為80% ～ 90%，且轉染效率為1% ～ 4%（圖4）。

3 討論與結論

電轉染可以使用指數(shù)衰減和方波2種不同的波形脈沖，由于后者已被證明是哺乳動物細胞電轉染的最佳波形［24］，所以本研究選擇了方波脈沖。通過探索電壓、脈沖長度、脈沖次數(shù)、脈沖間隔和質粒質量濃度等參數(shù)對轉染效率和細胞存活率的影響來構建鹿茸原代細胞電轉染反應體系。

通常情況下對于同種細胞，電轉染可以達到與脂質體轉染相似的轉染效率［25］，如盧莎等［26］通過脂質體轉染和電轉染2種方法均可建立嵌合HCV的人肝癌細胞培養(yǎng)體系，對比脂質體轉染法對細胞較小的損傷，電轉染法轉染效率較高、收獲HCVcc的時間更短，但2種方法收獲的HCVcc感染滴度無明顯差異；隋娟等［27］比較電轉染法和脂質體轉染法在K562、HepG2細胞中的轉染效率，發(fā)現(xiàn)電穿孔轉染法蛋白表達量高于脂質體轉染法。以上報道呈現(xiàn)的電轉染技術的優(yōu)勢表明，電穿孔技術在轉染難以轉染的細胞系時更具優(yōu)勢［28］。目前盡管對鹿茸的生長發(fā)育機制已有深入研究，但鹿茸原代細胞的轉染仍然是一個具有挑戰(zhàn)性的問題。因此，本研究旨在探索電穿孔技術在鹿茸原代細胞轉染中的應用。

電轉染的效率取決于細胞膜的滲透性，所以通過優(yōu)化不同參數(shù)的電刺激，如脈沖電壓、持續(xù)時間和脈沖次數(shù)等［29?30］，可以在一定存活率范圍內(nèi)最大限度地提高轉染效率［31］。另外，細胞的轉染效率和存活率同時也受物種、細胞類型等多種因素的影響，因此針對特定細胞株需單獨優(yōu)化轉染條件［32］。本研究使用的方波脈沖允許靈活調節(jié)脈沖電壓、脈沖長度及脈沖次數(shù)等多個參數(shù)，這些參數(shù)對轉染效率起著關鍵作用［33?34］。在對牛成纖維細胞電轉染pT2-RMCE-Lenus質粒試驗中，Hyder et al.［35］發(fā)現(xiàn)電轉緩沖液、脈沖電壓、脈沖長度及外源基因濃度對轉染效率影響較大。Hui［36］在脈沖長度和強度對電穿孔效率影響的研究中發(fā)現(xiàn)，當電壓過低、脈沖電穿孔條件對特定細胞株不足時，細胞膜不會改變，外源基因不能輕易進入細胞，轉染效率不會最大化；而過高的電壓會對細胞造成不可逆的損傷，因此存活和轉染效率會受到極大影響。在本研究中，當電壓相同時，鹿茸原代細胞使用更長的脈沖長度和更多的電擊次數(shù)，轉染效率仍顯著低于293T細胞，所以鹿茸原代細胞較293T細胞更難獲得較高的轉染效率，此結果與使用脂質體轉染法對上述細胞轉染的數(shù)據(jù)基本一致（數(shù)據(jù)未附），提示物種（鹿、人）、細胞類型（原代細胞、細胞系）以及細胞組織來源（軟骨、腎）等要素對電轉染結果也具有較大的系統(tǒng)性影響。

除電轉染脈沖參數(shù)外，質粒質量濃度也會影響鹿茸原代細胞的轉染效率和細胞存活率，鹿茸前軟骨原代細胞和軟骨原代細胞對質粒質量濃度變化帶來的細胞毒性存在不同響應。增大質粒質量濃度可顯著提高對前軟骨原代細胞的轉染效率；而在軟骨原代細胞中，低濃度下細胞擁有較高的存活率，增大質粒質量濃度會降低轉染效率，而當質粒質量濃度達到40 μg/mL后，細胞無法存活且不能轉染。這表明鹿茸前軟骨組織與軟骨組織原代細胞具有細胞生物學特性差異，對于不同質粒質量濃度細胞毒性的敏感度不同，這種差異的機理值得深入研究。

本研究首次揭示電壓、脈沖長度、脈沖次數(shù)、脈沖間隔和質粒質量濃度等因素對不同鹿茸原代細胞轉染效率和存活率的影響。應當指出的是，轉染效率與細胞存活率通常存在負相關關系。理論上，2次脈沖就足以將質粒轉染到大多數(shù)細胞中，而增加脈沖次數(shù)在理論上有助于提高轉染效率。但是，超過5次的脈沖所產(chǎn)生的細胞損傷，甚至死亡，將抵消轉染效率提高帶來的效果［37］，在建立電轉染體系過程中，本研究數(shù)據(jù)還提示需要注意電壓參數(shù)的選擇，如果電壓過高，電轉細胞會一次性全部喪失活性。細胞在不同區(qū)域承受不同的電場參數(shù)，其死亡機制因此會不同。例如，有研究顯示靠近電極的細胞暴露在振幅最高的電場中，常死于蛋白變性所致的壞死，甚至凝固性壞死［38］。所以，電場強度、脈沖長度、脈沖次數(shù)與脈沖間隔之間需要合理的調節(jié)參數(shù)，才能進行下一步的優(yōu)化轉染工作。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)在優(yōu)化電轉染參數(shù)過程中，同時調節(jié)2 個及以上參數(shù)可能會獲得更佳的轉染效率。轉染效率和存活率標準反應體系的結果也表明了通過雙向調節(jié)電轉參數(shù)，可以優(yōu)化電轉染條件，通過雙向調整電場強度、脈沖間隔、脈沖長度或脈沖次數(shù)，細胞可以在單獨優(yōu)化的條件下獲得良好的電轉染結果。但是需要注意，這種優(yōu)化策略也會給實驗整體操作帶來更高的復雜性。

在試驗中，本研究選擇293T細胞系作為平行實驗組，其目的在于比較物種、細胞類型和細胞來源等多種因素對電轉染效率和細胞存活率的影響，同時為后續(xù)進一步優(yōu)化鹿茸原代細胞電轉染體系提供一個良好的參照系。

本研究成功地對鹿茸原代細胞的電轉染技術進行了探索性研究，初步建立了鹿茸原代細胞電轉染體系和相關參數(shù)。在后續(xù)試驗中，建議將指數(shù)波、緩沖液體系和細胞密度等因素也納入并進行深入研究。