腫瘤標(biāo)志物質(zhì)控品制備凍干工藝研究及質(zhì)量評價

摘要：目的：采用冷凍干燥工藝制備腫瘤質(zhì)控品，并對其質(zhì)量進(jìn)行評價。方法：確定冷凍干燥工藝，對凍干后的腫瘤質(zhì)控品外觀形態(tài)、含水量、標(biāo)志物含量進(jìn)行檢測，對比凍干前后標(biāo)志物含量差異，并根據(jù)CNAS-GL003文件提供的評價方法評估凍干后腫瘤質(zhì)控品的均勻性和穩(wěn)定性。結(jié)果：利用該研究設(shè)定的冷凍干燥工藝制備的腫瘤質(zhì)控品外觀形態(tài)良好，含水量符合標(biāo)準(zhǔn)要求，凍干后各腫瘤標(biāo)志物的含量與凍干前比較無顯著差異；均勻性分析結(jié)果表明，腫瘤質(zhì)控品的樣品間和樣品內(nèi)測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；穩(wěn)定性分析結(jié)果表明，在24個月的研究期間，各樣品間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t

關(guān)鍵詞：冷凍干燥；質(zhì)控品；腫瘤標(biāo)志物；均勻性；穩(wěn)定性；質(zhì)量評價

中圖分類號：R73文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1674-4977.2025.01.063

0引言

腫瘤是全球疾病致死的重要元兇之一。根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)于2024年2月在《臨床醫(yī)師癌癥雜志》發(fā)表的《2022全球癌癥統(tǒng)計報告：全球185個國家36種癌癥發(fā)病率和死亡率估計》，2022年全球新發(fā)癌癥病例1997.6萬例，死亡病例974.4萬例[1]。

腫瘤標(biāo)志物是在惡性腫瘤的發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細(xì)胞本身所產(chǎn)生的或是由機(jī)體對腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而異常產(chǎn)生和（或）升高的，反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、激素、酶（同工酶）、多胺及癌基因產(chǎn)物等，存在于患者的血液、體液、細(xì)胞或組織中，可用生物化學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)等方法進(jìn)行測定，對腫瘤的輔助診斷、鑒別診斷、療效觀察、復(fù)發(fā)監(jiān)測以及預(yù)后評估具有一定的價值[2]。在醫(yī)療機(jī)構(gòu)診療活動中，腫瘤標(biāo)志物的實(shí)驗室檢測質(zhì)量水平，直接影響臨床診斷、療效評估和預(yù)后判斷，因此腫瘤標(biāo)志物檢測的室內(nèi)質(zhì)控尤為重要[3]。

當(dāng)前，國內(nèi)腫瘤質(zhì)控品大部分是以試劑配套為主，多數(shù)按類別常規(guī)項目組合或單一項目濃度設(shè)計，復(fù)合程度相對不高，臨床新開展的標(biāo)志物項目涵蓋不全。因此，針對多項目復(fù)合特殊腫瘤質(zhì)控品的研究不僅有利于提高臨床實(shí)驗室工作效率、有助于實(shí)驗室質(zhì)量能力水平提高，也有廣闊的應(yīng)用前景。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1來源

已配制好的液態(tài)腫瘤質(zhì)控品（以下簡稱：質(zhì)控樣品）半成品，由鄭州標(biāo)源生物科技有限公司提供。

1.1.2主要試劑

本研究用到的PGI、PGII、proGRP、CA724、CA242、SCCA、HE4、CY211、NSE檢測試劑盒均由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供。

1.1.3主要儀器設(shè)備

凍干機(jī)（上海東富龍）；全自動化學(xué)發(fā)光測定儀（鄭州安圖生物）；卡爾費(fèi)休水分測定儀（江蘇維科特）。

1.2方法

1.2.1冷凍干燥

1.2.1.1預(yù)凍

將質(zhì)控樣品半開瓶塞放入凍干機(jī)內(nèi)，放置好溫度探頭，設(shè)置凍干機(jī)擱板溫度為-45℃，使其在1 h內(nèi)從室溫降至-40℃以下，維持180 min。留取若干瓶質(zhì)控樣品存放于-70℃作為凍干前的對照樣品。

1.2.1.2干燥

冷凍干燥階段包括升華干燥和解析干燥2個階段。升華干燥階段，冷阱溫度降至-60℃后，在-60℃左右波動。擱板溫度從-45℃以下升至-5℃并維持27 h。真空度一直保持在15 Pa。解析干燥階段，擱板溫度從-5℃升至10℃并維持0.5 h，而后在1 h內(nèi)升至約30℃并維持7 h。升溫期間真空度保持在15 Pa，保持極限真空直至凍干結(jié)束，獲得凍干曲線。

1.2.2質(zhì)量檢測

1.2.2.1外觀檢測

取凍干后的質(zhì)控樣品，采用目測法觀察樣品的成形外觀是否良好。

1.2.2.2水分含量測定

使用電子天平稱取適量質(zhì)控凍干制劑樣品。利用庫侖法原理，采用卡爾費(fèi)休水分測定儀檢測質(zhì)控凍干制劑的水分含量。

1.2.2.3含量測定

取凍干前后的不同濃度質(zhì)控樣品各3瓶，每瓶重復(fù)測試2次，分別檢測凍干前后樣品中標(biāo)志物的含量。計算t值，判斷凍干前后量值是否有顯著變化。

1.2.2.4均勻性評價

隨機(jī)抽取不同濃度質(zhì)控樣品各10瓶，每個重復(fù)測試2次，利用單因子方差分析法對檢驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，計算F值，若F值小于F臨界值（α=0.05），表明樣品是均勻的，樣品間和樣品內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）[4-9]。

1.2.2.5穩(wěn)定性評價

取制備好的不同濃度質(zhì)控樣品各3瓶，每瓶重復(fù)測試2次，以此作為各項目初始均值。分別在第1、3、6、12、18、24月隨機(jī)抽取不同濃度質(zhì)控樣品各3瓶，參照以上同樣的方法進(jìn)行測定，再分別取各項目均值與其初始均值比較，若計算得到的t值小于t0.05（10），表明樣品之間差異穩(wěn)定。

2結(jié)果

2.1凍干曲線

運(yùn)行本研究設(shè)定的冷凍干燥程序后，得到質(zhì)控樣品凍干曲線，如圖1所示。

2.2外觀檢測

外觀均呈淡黃、均勻、疏松體。

2.3水分含量

隨機(jī)取3份質(zhì)控樣品，檢測其水分含量為1.202%±0.181%，凍干效果良好。

2.4標(biāo)志物含量

對凍干前后質(zhì)控樣品的腫瘤標(biāo)志物含量進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，凍干質(zhì)控樣品中腫瘤標(biāo)志物的含量與凍干前的質(zhì)控樣品t值均小于t0.05（10）=2.23，無明顯差異。

2.5均勻性評價

分別隨機(jī)抽取三個水平質(zhì)控樣品各10瓶，用單因子方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計，計算均值、F值和P值。檢測結(jié)果顯示F值均小于F0.05（9，10）=3.02，P>0.05，質(zhì)控樣品中的腫瘤標(biāo)志物差異含量樣品內(nèi)和樣品間無顯著性差異。

2.6穩(wěn)定性評價

在全自動化學(xué)發(fā)光分析儀上分別測定初始、第1、3、6、12、18、24月的質(zhì)控樣品，檢測結(jié)果顯示各項目t值均小于t0.05（10）=2.23，結(jié)果差異不顯著，質(zhì)控樣品是穩(wěn)定的。

3討論

質(zhì)控樣品的項目復(fù)合度、均勻性和穩(wěn)定性是臨床室內(nèi)質(zhì)量控制應(yīng)用關(guān)注的重點(diǎn)，本研究從項目復(fù)合度上考慮，涵蓋了PGI、PGII、proGRP、CA724、CA242、SCCA、HE4、CY211、NSE這9個特殊的腫瘤標(biāo)志物，與陳文虎等[10]研究的多項目復(fù)合腫瘤標(biāo)志物相比，添加了除常規(guī)腫瘤標(biāo)志物外的新興腫瘤標(biāo)志物；從穩(wěn)定性上考慮，冷凍干燥可實(shí)現(xiàn)不穩(wěn)定標(biāo)志物的長期保存，便于臨床實(shí)驗室使用。孫珍珠等[11]做過血漿凍干制劑的制備研究，認(rèn)為冷凍干燥是一個復(fù)雜的過程，包括預(yù)凍階段、升華干燥階段、解析干燥階段，每個階段的溫度、時間、真空度等因素均可能會對質(zhì)控樣品凍干后的水分含量、標(biāo)志物含量和穩(wěn)定性等造成影響。本研究中質(zhì)控樣品復(fù)合度高包含標(biāo)志物數(shù)量多，單支裝量大厚度高，不利于冷凍干燥；同時質(zhì)控樣品中蛋白濃度高，導(dǎo)致凍干時間長。因此，優(yōu)化凍干工藝是成功制備凍干質(zhì)控樣品的關(guān)鍵，本研究所建立的質(zhì)控樣品冷凍干燥工藝可制備高質(zhì)量復(fù)合腫瘤標(biāo)志物質(zhì)控品，凍干工藝簡單、快速、效果好，為其他同類質(zhì)控品的研究開發(fā)奠定良好基礎(chǔ)。

本研究建立的冷凍干燥制備工藝制備的質(zhì)控樣品凍干制劑外觀呈淡黃、均勻、疏松體；檢測其水分含量為（1.202±0.181）%，符合制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求（含水量≤2%）。質(zhì)控樣品凍干制劑中標(biāo)志物含量在凍干前后無顯著差異。利用單因子方差分析法來檢驗質(zhì)控樣品的均勻性，結(jié)果顯示在α=0.05顯著性水平時，質(zhì)控樣品中所含的腫瘤標(biāo)志物是均勻的。利用獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行比較結(jié)果顯示在α=0.05顯著性水平時，質(zhì)控樣品穩(wěn)定性結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），穩(wěn)定性良好且能夠滿足臨床實(shí)驗室的使用需求。

該制備方法需從以下兩個方面進(jìn)一步完善：

1）凍干時間仍有提升空間，在后續(xù)研究中需繼續(xù)優(yōu)化凍干程序，以進(jìn)一步提高冷凍干燥效率。

2）本研究中是按3.0 mL的裝量設(shè)定凍干程序，在實(shí)際應(yīng)用中可能會有其他規(guī)格的需求，后續(xù)研究中仍需繼續(xù)摸索不同裝量規(guī)格下質(zhì)控樣品的冷凍干燥工藝。

參考文獻(xiàn)

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[11]孫珍珠，賈俊婷，王強(qiáng)，等.血漿凍干制劑的制備與質(zhì)量評價[J].軍事醫(yī)學(xué)，2023，47（10）：754-760.

作者簡介

張豪飛，男，1985年出生，學(xué)士，研究方向為醫(yī)學(xué)實(shí)驗室質(zhì)量控制。

（編輯：于淼，收稿日期：2024-05-25）