從“非主流”到“主流”的華麗轉身：miRNA如何逆天改命

微RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約為22個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA分子，在不同的細胞活動及生命進程中都發揮重要的調控作用。1993年，安布羅斯（V.Ambros）和魯夫昆（G.Ruvkun）在《細胞》（Cell）雜志以背靠背形式發表兩篇研究論文[1，2]，驚人地發現秀麗隱桿線蟲（C.elegans，以下簡稱線蟲）中22個核苷酸的lin-4竟能與lin-14mRNA的3’UTR部分互補，從而抑制其翻譯成蛋白質。然而，由于lin-4僅存在線蟲中，這一重要發現被當時的科學界所忽視。7年后，魯夫昆團隊在線蟲中發現第二個miRNA——let-7，不僅能靶向lin-413’UTR降低其表達，而且在果蠅和斑馬魚等動物界高度保守[3]。隨后，成千上萬的miRNA在人以及小鼠、擬南芥等動植物中被發現，由此開啟了RNA調控基因的全新領域。目前，miRNA靶向抑制基因理論已經成為經典，但卻讓miRNA研究由“熱”轉“冷”。近些年，核內miRNA靶向增強子激活基因理論正悄然興起，能否借諾貝爾獎之東風掀起miRNA研究的新浪潮，讓我們拭目以待！

興趣碰撞開啟miRNA新紀元

1953年，安布羅斯出生于美國新罕布什爾州，家里有8個孩子，其父親是波蘭人，因躲避戰火連中學都沒有念完。他為父親感到惋惜，懂得珍惜學習機會，自小立志成為一名科學家。他在申請麻省理工學院（MIT）讀書時就表明，“我想當個科學家”。隨后，他進入MIT學習天文，但發現自己對物理學興趣一般，在室友的熏陶下，癡迷于揭示分子生物與基因組學的奧秘，徹底愛上了分子生物學。在博士期間，他師從巴爾的摩教授（D.Baltimore，1975年獲諾貝爾生理學或醫學獎），研究脊髓灰質炎病毒的基因組結構和復制。在此期間，霍維茨教授（H.R.Horvitz，2002年獲諾貝爾生理學或醫學獎）來到MIT建立實驗室，進行了線蟲研究的學術報告，讓安布羅斯對線蟲產生濃厚興趣。1979年，他加入霍維茨實驗室進行博士后訓練，研究lin-4和unc-86對線蟲發育的調控作用。

1952年，魯夫昆出生在美國加州伯克利市的猶太家庭，其父母鼓勵他對科學的熱愛。童年時期，他對科學充滿興趣，因愛好無線電，對電子學和物理學很著迷，后來他進入加州大學伯克利分校學習電氣工程。1973年，魯夫昆獲得學士學位，恰逢經濟蕭條，對未來困惑不已。于是，他買了一輛面包車，沿美國西海岸旅行直到玻利維亞，曾嘗試應聘電臺DJ等工作都未成功，最后得到酒吧的種樹工作，與滿懷理想的年輕嬉皮士共同種樹和生活。然而，一次偶然的機會，他被《科學美國人》雜志所吸引，內心科研的火種被再次點燃，命運的齒輪也由此反轉。1976年，他返回美國進入哈佛大學攻讀博士學位，師從植物分子生物學家奧蘇貝爾（F.Ausubel），并共同解開了植物固氮的諸多謎團。1982年，他獲得生物物理學博士學位后，決定改變研究方向，在哈佛大學吉爾伯特（W.Gilbert，1980年獲諾貝爾化學獎）和MIT的霍維茨實驗室進行博士后研究，關注線蟲發育相關的信號通路，并與安布羅斯相遇。

1980年代，安布羅斯和魯夫昆在霍維茨實驗室中共同探究lin-14在線蟲發育中的作用機制，但并未解開未知之謎。隨后，他們分別加入哈佛大學的不同團隊繼續聚焦lin-14研究，盡管兩人保持相對獨立，但又緊密合作。后來，安布羅斯和魯夫昆分別獨立推導lin-4和lin-14的序列信息，在1992年6月11日晚上交換彼此的結果，對比后驚奇地發現，lin-4非編碼RNA在lin-14mRNA的3’UTR存在多個結合位點，像拉鏈一樣吻合。兩個團隊進一步證實lin-4通過結合在lin-14mRNA的3’UTR抑制其翻譯，并于1993年將論文同時發表在《細胞》雜志上[1，2]。一種以miRNA為媒介的新型基因調控方式被發現，但當時并未引起科學界的關注。直到2000年，魯夫昆團隊證實線蟲中let-7在動物界具有高度保守性[3]，突顯了miRNA抑制基因的普適性，才正式開啟miRNA研究新領域。

miRNA掌控細胞命運轉換

研究表明，miRNA生成是一個被精心編排的生物學過程。首先，在細胞核內，基因組DNA轉錄產生長鏈的初級miRNA（primarymiRNA，pri-miRNA），通常包含一個或多個發夾狀結構，是miRNA成熟的關鍵信號。接著，DGCR8蛋白與Drosha酶等相互作用并結合pri-miRNA，Drosha酶將pri-miRNA剪切成約70個核苷酸長的前體miRNA（precursormiRNA，pre-miRNA）。然后，pre-miRNA在exportin-5蛋白協助下，從細胞核被轉運至細胞質，被Dicer酶進一步剪切形成雙鏈RNA，與AGO蛋白組成miRNA誘導的沉默復合體（miRNA-inducedsilencingcomplex，miRISC）并完成雙鏈解旋，最終導致RNA雙鏈中僅有一條鏈與AGO蛋白穩定結合，該鏈被稱為引導鏈，即成熟miRNA。目前，最全面的miRNA公共數據庫——miRBase已收錄來自271個物種、超過4萬個miRNA的信息，其中，人類miRNA共1917個，可能在疾病和發育進程中起重要的調控作用。

miRNA通過調控基因表達影響細胞增殖、分化和凋亡等生物學功能，在個體發育、行為表現以及疾病發生發展中至關重要。例如，最早發現的兩個miRNA——lin-4和let-7都能調控線蟲的發育時序。其中，lin-4通過抑制lin-14和lin-28表達，分別調控線蟲L1～L2期和L2～L3期的轉變[1]；let-7通過調控lin-41、hbl-1等靶基因，調控線蟲從L4期到成蟲的轉變[4]。另外，miR-iab4/iab8突變則顯著影響果蠅幼蟲的自我糾正能力[5]，進而影響其行為表現。然而，miRNA表達異常則導致靶基因表達失控，與腫瘤、自身免疫性疾病以及神經退行性疾病等密切相關。以乳腺癌為例，低表達的miR-339通過降低抑癌基因表達促進乳腺癌發生發展[6]。那么，miRNA如何影響個體發育和疾病進程呢？

我們認為，miRNA通過改變時空維度上細胞的身份及狀態影響發育和疾病過程。事實上，miRNA具有很強的組織細胞特異性，如肌肉特異性miR-1和肝臟特異性miR-122等。其中，小鼠miR-122隨著胚胎發育逐漸升高，在出生時急劇升高，這與出生后肝臟代謝功能密切相關。另外，小鼠被敲除miR-122后導致脂肪在肝臟積累，逐漸獲得脂肪細胞儲肪功能，丟失部分肝臟細胞排除脂肪的能力，引起肝炎，最終在11月齡時發展成肝癌。此外，miR-17～92家族參與Th細胞身份的塑造，而miR-7在成熟的胰腺β細胞身份維持中發揮重要作用。因此，miRNA組織特異性表達的特征與細胞特定身份密切相關，其異常表達會造成細胞身份轉變及疾病發生與進展，但具體作用機制尚不完全清楚。

NamiRNA打破基因沉默的魔咒

目前，沉默基因表達是miRNA調控基因的經典途徑，主要發生在轉錄后水平。在細胞質中，成熟miRNA與AGO蛋白形成miRISC復合體并通過堿基互補配對原則與mRNA結合，負向調節其翻譯效率和穩定性抑制基因表達。一方面，miRISC復合體通過阻止翻譯起始因子被招募到mRNA的5’端非編碼區或者影響核糖體沿mRNA的移動，抑制核糖體的翻譯[7]。另一方面，miRISC復合體會激活去腺苷化酶，將mRNA3’端的多腺苷酸尾切除，進一步導致mRNA的5’端帽結構丟失，加速mRNA被核酸外切酶降解，降低基因表達。然而，動植物中miRNA與mRNA的結合方式并不完全相同。在植物中，miRNA常以完全匹配的方式結合mRNA并形成穩定的雙鏈結構沉默基因表達，而在動物中，miRNA與mRNA的結合通常是不完全匹配的，極大增加miRNA抑制靶標結合位點預測的復雜性和難度[8]。與此相反，miRNA能與啟動子相互作用以非經典途徑在轉錄水平上激活基因表達。例如，細胞核中的miR-373能夠與E-鈣黏蛋白基因的啟動子區域序列互補并促進mRNA的轉錄，揭示miRNA更為復雜的生物學功能。

近些年，復旦大學于文強團隊發現了一種全新的非經典途徑——細胞核內miRNA靶向增強子激活基因轉錄，并將這類miRNA命名為核內激活miRNA（nuclearactivatingmiRNA，NamiRNA）。2009年，該團隊發現大多數miRNA在基因組位置上與基因激活元件增強子高度重疊，提示miRNA可能具有激活基因的功能。經過8年潛心研究，團隊證實miRNA能夠定位于細胞核內，并揭示了核內miRNA激活基因的功能機制，創造性地提出了NamiRNA-增強子-基因激活的全新理論[9，10]。NamiRNA指的是一類在細胞核內的miRNA，能夠通過與增強子相互作用促進基因轉錄。具體來說[10]，miRNA作為楔子，打開基因組DNA雙鏈，AGO2識別增強子與miRNA的雜交鏈，維持DNA單鏈狀態，促進RNA聚合酶Ⅱ對基因的轉錄。事實上，NamiRNA不僅能夠激活與其位置相鄰的靶基因表達，還能夠激活全基因組范圍內的基因表達，從而影響細胞身份及功能改變。NamiRNA的發現開啟了一個新的研究領域，實現了miRNA從沉默基因到激活基因的華麗轉身，為miRNA的基礎研究和臨床應用轉化提供了新的視角和方向。

借諾貝爾獎東風創miRNA研究新浪潮

截至2024年12月，PubMed檢索“miRNA”文章已超過17萬篇，涵蓋病毒、細菌、真菌、植物和動物自然界五大類生物，不僅揭示了miRNA調控微生物繁殖及對宿主的作用，而且探究了miRNA在動植物的發育及不同疾病過程的重要作用，尤其在miRNA的生成加工過程、生物功能以及基因調控模式等方面都取得很大進展。然而，miRNA文章自2021年開始逐年減少，2024年發文總量銳減近50%，似乎意味著miRNA研究正由“盛”轉“衰”，其背后原因值得我們深思。

首先，miRNA的基礎研究似乎早已陷入“科研怪圈”：過表達miRNA能夠誘導基因的差異表達，但大多數研究者僅僅關注下調的基因，對上調基因視而不見。相應地，miRNA上調基因的研究少之又少，且主要是miRNA通過沉默中間基因導致下游基因的上調。那么，miRNA能否激活基因？如前所述，答案是肯定的。如何探究其正向的基因調控作用呢？NamiRNA-增強子-基因激活理論為科研工作者指明了具體方向，細胞核內的miRNA可以作為激活劑，活化基因組增強子并與其相互作用，打開DNA雙鏈，激活基因轉錄。目前，NamiRNA研究尚處于早期階段，還有諸多未知值得深入探究。我們相信，在不遠的未來，NamiRNA研究的新生力量必將涌現，共同實現miRNA基礎研究的繁榮與復興！

其次，miRNA的臨床應用似乎總是“撲朔迷離”，尤其是成藥極其困難。2008年，丹麥制藥公司SantarisPharma宣布SPC3649（Miravirsen）進入臨床試驗，是全球首個靶向miRNA的核酸藥物，能特異性結合miR-122，旨在降低丙肝病毒（hepatitisCvirus，HCV）載量。隨后的臨床Ⅱ期試驗顯示，該藥物用于慢性丙肝病毒感染患者呈現劑量依賴性的丙肝病毒RNA的降低[11]，但后報道稱Miravirsen會誘導HCV的UTR區域突變，沒有進一步的進展。2016年，首個miR-34a類似物MRX34的多中心臨床I期試驗因嚴重的免疫副作用致死而終止[12]。目前，尚無臨床可用的靶向miRNA核酸藥物。近些年，核酸藥物的修飾以及遞送系統已取得巨大進步，不僅能降低核酸藥物的免疫原性，而且能促進其向靶組織器官的運輸。那么，決定miRNA成藥的關鍵是什么呢？我們認為，靶點篩選是miRNA成藥的核心，而篩選策略是重中之重。與經典抑制理論不同，NamiRNA-增強子-基因激活理論讓我們更關注miRNA對全基因組的激活作用，有望引領一種全新的miRNA篩選潮流，突破miRNA成藥難的困境。我們期待，藥物研發團隊及生物醫藥企業能夠重拾信心，提升靶向miRNA核酸藥物的研發投入，加快miRNA的臨床應用轉化！

借著諾貝爾獎的東風，miRNA研究2.0時代已經開啟，讓我們共同努力，推動基礎研究向臨床應用的轉化，催生臨床可用的靶向miRNA核酸藥物，為人類與疾病的斗爭貢獻力量！

[1]LeeRC，FeinbaumRL，AmbrosV.TheC.elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14.Cell，1993，75（5）：843-854.

[2]WightmanB，HaI，RuvkunG.Posttranscriptionalregulationoftheheterochronicgenelin-14bylin-4mediatestemporalpatternformationinC.elegans.Cell，1993，75（5）：855-862.

[3]PasquinelliAE，ReinhartBJ，SlackF，etal.Conservationofthesequenceandtemporalexpressionoflet-7heterochronicregulatoryRNA.Nature，2000，408（6808）：86-89.

[4]ReinhartBJ，SlackFJ，BassonM，etal.The21-nucleotidelet-7RNAregulatesdevelopmentaltiminginCaenorhabditiselegans.Nature，2000，403（6772）：901-906.

[5]Picao-OsorioJ，JohnstonJ，LandgrafM，etal.MicroRNA-encodedbehaviorinDrosophila.Science，2015，350（6262）：815-820.

[6]LiangY，LuQ，LiW，etal.ReactivationoftumoursuppressorinbreastcancerbyenhancerswitchingthroughNamiRNAnetwork.NucleicAcidsResearch，2021，49（15）：8556-8572.

[7]MeijerH，KongY，LuW，etal.TranslationalrepressionandeIF4A2activityarecriticalformicroRNA-mediatedgeneregulation.Science，2013，340（6128）：82-85.

[8]LewisBP，ShihIH，Jones-RhoadesMW，etal.PredictionofmammalianmicroRNAtargets.Cell，2003，115（7）：787-798.

[9]XiaoM，LiJ，LiW，etal.MicroRNAsactivategenetranscriptionepigeneticallyasanenhancertrigge.RNABiology，2017，14（10）：1326-1334.

[10]YangS，ZouQ，LiangY，etal.miR-1246promotesosteosarcomacellmigrationviaNamiRNA-enhancernetworkdependentonArgonaute2.MedComm，2024，5（4）：e543.

[11]JanssenHL，ReesinkHW，LawitzEJ，etal.TreatmentofHCVinfectionbytargetingmicroRNA.NewEnglandJournalofMedicine，2013，368（18）：1685-1694.

[12]HongDS，KangYK，BoradM，etal.Phase1studyofMRX34，aliposomalmiR-34amimic，inpatientswithadvancedsolidtumours.BritishJournalofCancer，2020，122（11）：1630-1637.

關鍵詞：諾貝爾獎miRNA沉默基因NamiRNA基因激活■