純植物基核桃發酵乳菌種篩選及發酵工藝優化研究

摘要：發酵菌種是發酵乳發酵過程中的關鍵因素，該研究以核桃原漿為發酵底物，篩選出合適的發酵菌種來制備純植物基核桃發酵乳，以解決其酸度不足、持水性差、風味不佳等問題，進一步提高該發酵乳的質構和穩定性。以持水性和感官評分為指標，采用單因素試驗、響應面法優化純植物基核桃發酵乳的發酵工藝。結果表明，篩選的最佳復配菌種為保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌，以1∶1∶1的復配比發酵后的發酵乳的質構特性和感官評分達到最優；最優發酵工藝為料液比1∶5、蔗糖添加量7%、發酵溫度36℃、發酵時間12 h、菌種接種量4.5%。在此條件下發酵的純植物基核桃發酵乳質地細膩黏稠、香氣適宜、口味獨特，感官評分達到89.4分，相關理化指標和微生物指標均符合標準要求。此產品的開發為核桃資源的開發和利用提供了參考，為提高純植物基核桃發酵乳的品質提供了篩菌和工藝優化的新思路。

關鍵詞：核桃；純植物基發酵乳；菌種篩選；發酵工藝；響應面優化

中圖分類號：TS201.3 文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2025）01-0001-09

Study on Screening of Strains of Pure Plant-Based Walnut Fermented Milk and Optimization of Fermentation Process

ZHENG Jing-chuan^1，2，3， YANG Rui-juan^{1，2，3}， LIN Xing-mi¹， SHEN Zhao-yu¹， TIAN Yang^{1，2，3，4*}

（1.College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China; 2.Engineering Research Center for the Development and Utilization of Food and Medicine Homologous Resources， Ministry of Education， Kunming 650201， China; 3.Yunnan Key Laboratory of Precision Nutrition and Personalized Food Manufacturing， Kunming 650201， China; 4.Pu'er University， Pu'er 665000， China）

Abstract： Fermentation strains are the key factor in the fermentation process of fermented milk， in this study， with walnut raw pulp as the fermentation substrate， suitable fermentation strains are selected to prepare pure plant-based walnut fermented milk， so as to solve the problems of insufficient acidity， poor water holding capacity and poor flavor， and further improve the texture and stability of the fermented milk. With water holding capacity and sensory score as the indexes， the fermentation process of pure plant-based walnut fermented milk is optimized by using single factor test and response surface method. The results show that the optimal screened compound strains are Lactobacillus bulgaricus， Streptococcus thermophilus and Lactobacillus plantarum.The texture characteristics and sensory score of fermented milk are the best by compounding at the ratio of 1∶1∶1. The optimal fermentation process is solid-liquid ratio of 1∶5， sucrose addition amount of 7%， fermentation temperature of 36℃， fermentation time of 12 h and strain inoculation amount of 4.5%. Under these conditions， the pure plant-based walnut fermented milk is fine and sticky in texture， with suitable aroma and unique taste. The sensory score reaches 89.4 points， and the relevant physicochemical indexes and microbiological indexes all meet the standard requirements. The development of this product has provided references for the development and utilization of walnut resources， and provided new ideas of strain screening and process optimization for improving the quality of pure plant-based walnut fermented milk.

Key words： walnut; pure plant-based fermented milk; strain screening; fermentation process; response surface optimization

胡桃（Juglans regia），胡桃科胡桃屬植物，是我國分布最廣的經濟樹種之一，產量位居世界首位^[1]。研究表明，核桃仁中因含有豐富的不飽和脂肪酸、蛋白質、膳食纖維、維生素和礦物質等^[2-3]，具有降血脂^[4]、抗炎^[5]、抗疲勞^[6]等多種功效，是人們日常生活中優質蛋白質和脂質的攝入來源。作為世界四大堅果之一的核桃具有廣闊的發展前景^[7]。

與傳統乳基發酵乳（酸奶）不同，純植物基發酵乳是以植物基為原料，添加菌種，并采用生物發酵工藝制成的發酵乳^[8]。因其用“植物原料”替換“動物原料”，具備植物原料不含膽固醇、低脂肪、低熱量、易消化等特點^[9-10]，具有適合乳糖不耐癥患者和素食主義者食用^[11]及減少動物飼養成本和環境污染^[12-13]等優點，利用植物蛋白為發酵底物替代動物蛋白開發純植物基發酵乳飲品已成為研究熱點。

但植物發酵乳的植物蛋白種類、分子量、空間結構和動物蛋白不同，導致發酵后易出現質構不良、風味不佳、口感欠缺等諸多問題，傳統解決方法大多局限于改良產品配方^[14]和優化加工工藝^[15]，而篩選合適的發酵菌種研究較欠缺。目前植物基發酵乳的發酵菌種主要為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌這些動物發酵乳常用菌，二者互惠共生，嗜熱鏈球菌所產甲酸、丙酮酸、葉酸等可為保加利亞乳桿菌所利用，同時保加利亞乳桿菌在發酵過程中產生的游離氨基酸和肽可為嗜熱鏈球菌所利用^[16]。有研究表明，現有益生菌核桃發酵乳的研究中，主要以傳統發酵菌種混合發酵為主，現今被作為益生菌的乳桿菌有嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌等^[17]。

目前，以核桃作為植物基原料完全替代乳基原料制備植物基發酵乳的相關研究較少，純植物基核桃發酵乳的研制還處于實驗室研究的初步階段，并且我國核桃產品精深加工不足、綜合利用率偏低，因此開發純植物基核桃發酵乳具有較大的市場潛力。本研究旨在以核桃原漿作為發酵底物，通過篩選適合發酵的乳酸菌菌種，并確定最佳的配方配比和加工工藝，研制出一款風味獨特、質地良好、健康營養的純植物基發酵乳飲品，為國內特色風味純植物基發酵乳飲料的開發提供了一定的理論支撐，同時也為開發優良的植物基發酵菌種奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

核桃：大理漾濞核桃有限責任公司；發酵菌種：實驗室冷凍保存；MRS培養基：北京索萊寶科技有限公司；蔗糖：市售。

1.2 儀器與設備

JMS膠體磨 廊坊市正瑞機械有限公司；打漿機 邢臺有間優宿科技有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州聚輝儀器制造有限公司；Eppendorf臺式冷凍離心機 鄭州今時邁科技有限公司；SRH高壓均質機 上海申鹿均質機有限公司；SKD-800凱氏定氮儀 上海沛歐分析儀器有限公司；QSY-8數控消化爐 杭州菲躍儀器有限公司；LRH-250生化培養箱 浙江譜析儀器有限公司；YXQ-100G立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 純植物基核桃發酵乳制作工藝流程和操作要點

1.3.1.1 工藝流程

1.3.1.2 操作要點

熱泡脫皮：選擇外形飽滿、無霉變、無蟲蛀的干核桃，去除外殼得核桃仁。使用沸水浸泡核桃仁10 min，除去種皮。

加水磨漿：在打漿機中放入核桃仁，并按照1∶5的料液比加入純水，磨漿處理3次。

過濾：使用100目過濾網進行過濾，去除核桃漿中的不溶性固體組分。

加料：蔗糖添加量為4%，將混合核桃漿加熱至45℃，并攪拌10 min。

均質：在25 MPa條件下均質3 min，循環3次，以保證原漿中各物料穩定結合。

殺菌：原漿采用85℃殺菌20 min，在不破壞原料營養和色澤的基礎上，保證充分殺菌。

接種：殺菌后的原漿冷卻至35～40℃，將混合菌種接種到原漿中，攪拌均勻。

發酵：接種后在36℃下恒溫發酵12 h。

冷藏后熟：冷卻至4℃并在4～8℃下低溫儲藏24 h，進一步發酵后熟產酸。

1.3.2 發酵單菌種的篩選

1.3.2.1 發酵菌種的活化

將實驗室-80℃保藏的菌種恢復至室溫，分別取1 mL接種到提前滅菌并冷卻至室溫的9 mL液體MRS培養基中，37℃恒溫培養24 h。重復傳代3次，活菌數達到10⁹ CFU/mL以上，備用。

1.3.2.2 發酵指標的測定

持水性：取10～15 mL發酵完成的核桃發酵乳樣品，稱取樣品的最初質量，以10 000 r/min離心15 min，靜置10 min后，倒去上層清液，稱取剩余沉淀質量，按照下式計算發酵乳的持水性。

發酵乳持水性（%）=沉淀質量（g）/樣品質量（g）×100%。

黏度：將核桃發酵乳發酵至pH值為4.5，破乳恢復至室溫，采用Brookfield DV3T黏度計3號轉子，轉速為60 r/min，測定30 s時樣品的黏度。

凝乳時間：將活化好的菌種按照1.3.1的操作發酵至凝乳，記錄凝乳時間。

發酵終點時間：以發酵乳的pH值達到4.5為發酵終點，記錄發酵終點時間。

發酵終點酸度：發酵乳酸度的測定按照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》中的酚酞指示劑法^[18]，記錄發酵終點酸度。

1.3.2.3 菌種產酸能力的測定

將11種待測菌種活化后，按照1.3.1的發酵工藝進行接種發酵，每隔2 h分別取樣測定其酸度，酸度按照1.3.2.2中的酸度測定法測定，并繪制產酸曲線。

1.3.3 優勢菌種組合發酵篩選試驗

根據1.3.2選取具有良好發酵核桃原漿性能的乳酸菌進行菌種組合篩選，并按照菌種濃度1∶1∶1的比例，以4.5%的接種量接種到滅菌的核桃原漿中，36℃恒溫發酵12 h，發酵完成后放入4℃冰箱中冷藏后熟24 h后進行質構檢測和感官評價，選出質構良好且感官評價最優的最佳菌種組合。

1.3.3.1 質構的測定

發酵乳全質構測定：質構儀測試模式選擇全質構測試，探頭型號為TA/36R，測前、測中、測后速度均為1 mm/s，觸發力為4 g。

1.3.3.2 感官評價

純植物基核桃發酵乳的感官評價參考國標GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》的規定進行。由10名經過專業品鑒培訓的人員組成感官評判小組，分別從視覺層面——色澤（20分）、味覺層面——滋味（20分）、嗅覺層面——氣味（30分）、觸覺層面——組織狀態（30分）4項指標對發酵乳打分，總分100分，具體感官評價標準見表1。

1.3.4 發酵工藝優化

1.3.4.1 單因素試驗

以持水性和感官評分為評價指標，將料液比、蔗糖添加量、發酵溫度、發酵時間、菌種接種量設為單因素，每個單因素設置5個試驗水平，依次考察料液比（1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9）、蔗糖添加量（1%、3%、5%、7%、9%）、發酵溫度（32，34，36，38，40℃）、發酵時間（8，10，12，14，16 h）、菌種接種量（1.5%、3%、4.5%、6%、7.5%）對純植物基核桃發酵乳品質的影響。

1.3.4.2 響應面優化試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以純植物基核桃發酵乳的發酵溫度、發酵時間、菌種接種量為自變量，利用Design-Expert軟件中Box-Behnken程序在三因素三水平的條件下進行響應面分析，對純植物基核桃發酵乳的最佳發酵工藝配方進行可行性優化。Box-Behnken試驗因素與水平見表2。

1.3.5 純植物基核桃發酵乳理化指標和微生物指標的測定

發酵乳的pH值使用pH計測定；蛋白質含量按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法測定^[19]；乳酸菌活菌數按照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》測定^[20]；大腸桿菌按照GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》測定^[21]；致病菌按照GB 29921—2021《食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量》測定^[22]。

1.4 數據處理

采用軟件GraphPad Prism 8.0.2和IBM SPSS Statistics 26對試驗數據進行處理和統計分析，利用Design-Expert 8.0.6進行響應面分析，每項試驗至少平行3次。

2 結果與分析

2.1 發酵單菌種篩選結果

2.1.1 不同菌種發酵指標測定結果與分析

一般發酵乳飲品的菌種篩選主要以凝乳時間、發酵終點時間和酸度作為衡量指標，凝乳時間和發酵終點時間短且產酸能力強的菌種一般可視為發酵活力強，可縮短發酵時間，廣泛應用于發酵工業。由表3可知，羅伊氏乳桿菌、約氏乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌的凝乳時間和發酵終點時間較長，分別在15～18 h和18～21 h之間，發酵終點酸度偏低，在30～40°T之間，根據《植物蛋白飲料 植物酸奶》中規定植物基發酵乳的酸度應該大于30°T，綜合可知，其對核桃原漿的發酵能力較差。而保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌表現出較強的發酵產酸能力，發酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌也表現出不錯的發酵產酸能力，雖然不如保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，但一般發酵乳多采用多菌種復配，將其與發酵能力強的菌種復配，可對發酵乳的質構、風味等產生積極影響。

與乳基發酵乳不同，純植物基發酵乳由于植物蛋白種類、分子量、空間結構和動物蛋白不同^[23]，并且缺乏乳清和酪蛋白，不能很好地建立三維立體結構來鎖住游離水分，極易出現水相分離的問題，進而影響產品品質，因此將發酵乳的持水性和黏度作為篩菌指標。由表3可知，發酵能力強的菌種的持水性和黏度都較高，嗜熱鏈球菌因具有以產黏為主的作用，持水性和黏度最高，分別達到48.6%和448.3 mPa·s。

2.1.2 不同菌種產酸能力結果與分析

通常產酸能力強的菌種被廣泛選為發酵菌種，菌種發酵過程中產酸速度也決定了發酵乳的發酵周期，對產品的口感、風味和衛生安全有著重要影響。由圖1可知，除了保加利亞乳桿菌在第6 h酸度開始迅速增長外，其他菌種在8～14 h快速增長，14 h后酸度增長基本趨于穩定。由發酵開始到發酵結束，保加利亞乳桿菌的酸度由12.7°T上升到74.6°T，酸度增加了61.9°T，產酸能力最強。植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、發酵乳桿菌、瑞士乳桿菌、鼠李糖乳桿菌的酸度分別增加了61.8，57.6，55.9，51.7，44.3，43.7°T。相比之下，約氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌的酸度增長較小，分別為36.9，31.5，30.6，28.1°T，由于產酸過慢且產酸較少，在發酵過程中周期較長，容易造成品質不佳和產品污染，因此不適合作為發酵菌種。

根據表3和圖1的結果，最終將產酸能力最強的保加利亞乳桿菌和產黏能力最強的嗜熱鏈球菌作為基礎發酵菌種，而發酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、瑞士乳桿菌和嗜酸乳桿菌作為待定搭配菌種，以此進一步進行最佳菌種組合發酵試驗。

2.2 菌種組合篩選結果

2.2.1 不同菌種組合對純植物基核桃發酵乳質構的影響

由表4可知，菌種組合L1+L2+L5發酵的發酵乳的各項質構參數在所有組合中最佳，發酵乳的硬度和膠黏性參數受不同發酵菌種組合的影響較大。發酵乳的硬度是其凝膠結構體系的特征，較好的硬度有利于發酵乳的運輸和儲存，菌種組合L1+L2+L5和L1+L2+L7的發酵乳在硬度方面比較出色。菌種組合L1+L2+L5的發酵乳在膠黏性方面表現出色，發酵乳的膠黏性是發酵乳可被其他物體黏附的能力，較高的膠黏性使發酵乳具有較好的黏性，進而表明發酵乳具有較好的流變特性^[24]，對發酵乳的口感具有顯著影響，并且發酵乳的膠黏性高可降低乳飲料的離心沉淀率^[25]，適合生產乳酸菌飲料。綜合比較可得，菌種組合L1+L2+L5在純植物基核桃發酵乳的質構方面表現最優。

2.2.2 不同菌種組合對純植物基核桃發酵乳感官評分的影響

由表5可知，不同菌種組合對發酵乳色澤和氣味的影響較小，但對發酵乳的滋味、組織狀態有顯著影響。滋味不良主要表現在由酸度不足導致發酵乳的風味不佳，缺乏發酵乳特有的酸甜口味，主要原因是菌種發酵過程中產酸不足和產酸速度過慢，無法在指定時間內達到特定酸度要求。組織狀態不佳表現在發酵乳質構不佳，體系結構呈塊狀，黏稠度低，并且水相分離嚴重，主要原因可能是菌種發酵過程中所產胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）量不同導致黏性不同，乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在發酵過程中產生的黏性物質^[26]，發酵乳的黏稠性與胞外多糖的量有著直接關系。菌種組合L1+L2+L5在發酵乳的滋味和組織狀態方面表現都非常出色。

綜合表4和表5中結果，最終將最優發酵菌種組合確定為保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌。

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 料液比對純植物基核桃發酵乳品質的影響

核桃原漿的不同料液比對純植物基核桃發酵乳品質的影響見圖2。

由圖2可知，當料液比為1∶1～1∶5時，發酵乳的感官評分持續快速增加，發酵乳的持水性呈現緩慢增加的趨勢；當料液比為1∶5時，感官評分達到最大值85.6分，此時持水性為59.4%；當料液比為1∶5～1∶9時，感官評分和持水性均逐漸下降，這是由于料液比過大時，核桃中以酮類為主要呈香物質，因過度稀釋導致香味不突出，口味偏淡，并且與傳統乳基發酵乳不同，純植物基發酵乳因植物蛋白種類、分子量、空間結構與動物蛋白不同，較高的料液比使其網狀結構體系很不穩定，導致發酵乳體系水相分離嚴重，影響發酵乳的整體品質；當料液比過大時，核桃原漿濃度過大，氣味濃郁而無法體現核桃的清香，過于濃稠的發酵底物也使發酵過程中乳酸菌不能均勻發酵核桃原漿，進而導致產酸不足，影響核桃發酵乳的口感。因此，最適料液比為1∶5。

2.3.2 蔗糖添加量對純植物基核桃發酵乳品質的影響

不同蔗糖添加量對發酵乳產品持水性和感官評分的影響見圖3。

由圖3可知，當蔗糖添加量為1%～7%時，發酵乳的持水性和感官評分均呈升高趨勢；當蔗糖添加量為7%時，感官評分達到最高，為86.4分，此時持水性為56%；當蔗糖添加量大于7%后，感官評分下降，但是持水性緩慢上升。在傳統發酵生產工藝中添加蔗糖的主要原因：添加適量蔗糖可以調節發酵乳的糖酸比例進而增加發酵產品的味感，并增加產品的滲透壓，減少雜菌污染來保證產品的質量安全和延長產品的貨架期，同時蔗糖的添加可為乳酸菌提供生長繁殖所需的能量。因此通過試驗證實，當蔗糖添加量過少時，乳酸菌生長繁殖緩慢，活力較低，導致核桃原漿所需發酵時間較長，極易引起體系水相分離和味道過酸，體系水相分離嚴重會進一步導致發酵乳的持水性下降，從而影響發酵乳的品質。蔗糖添加量過多時，會導致發酵乳產品過甜，遮蓋了產品原有核桃醇厚的風味，口味變差。因此，核桃發酵乳最適的蔗糖添加量為7%。

2.3.3 發酵溫度對純植物基核桃發酵乳品質的影響

不同發酵溫度對發酵乳產品持水性和感官評分的影響見圖4。

由圖4可知，當發酵溫度為32～36℃時，發酵乳的持水性和感官評分均升高；當發酵溫度為36℃時，感官評分和持水性均達到最高，分別為85.4分和60%；當發酵溫度大于36℃后，發酵乳的感官評分大幅度下降，其持水性也呈逐漸下降的趨勢。當發酵溫度過低時，乳酸菌種活性偏低，其產酸能力較弱，導致發酵乳中因風味物質發酵不充分而風味較差，并且因乳酸菌活性不高導致的發酵不充分也使發酵乳結構體系不穩定，進而表現出較低的持水性；當發酵溫度過高時，發酵乳體系酸化程度較大，以植物蛋白為發酵底物的植物基發酵乳極易形成不良的酸餿味，并且較高的發酵溫度使核桃中的揮發性醛類物質大量揮發，產生過多的不良“草味”，還會導致產品體系水相分離嚴重。綜上，相對于低溫發酵，較高的發酵溫度更易影響發酵乳的口感、風味和外觀品質。在適宜的發酵溫度下，純植物基核桃發酵乳能夠獲得純凈的香氣、細膩的口感和穩定的結構體系。因此，最適發酵溫度為36℃。

2.3.4 發酵時間對純植物基核桃發酵乳品質的影響

不同發酵時間對發酵乳產品持水性和感官評分的影響見圖5。

由圖5可知，當核桃原漿的發酵時間為8～12 h時，發酵乳的感官評分和持水性均呈現升高趨勢；當發酵時間為12 h時，產品的感官評分和持水性均達到最高，分別為84.4分和59.6%；當發酵時間大于12 h后，因發酵過度導致發酵乳體系酸度持續上升，酸味過重使感官評分持續下降。因為核桃中的核桃油含有豐富的不飽和脂肪酸甘油酯，容易氧化、酸敗和變質，因此發酵時間過長會導致核桃原漿在發酵過程中氧化嚴重，使發酵乳表面容易產生紫色色變，嚴重影響產品的色澤和風味；發酵時間過短會導致其發酵不完全，使發酵乳的呈味物質未完全體現，從而導致香氣不足，并且因為發酵不完全導致乳酸菌所產的胞外多糖不足，乳酸菌分泌的胞外多糖作為一種天然的增稠劑和穩定劑被廣泛應用于發酵乳結構質地的改善，因此缺乏胞外多糖使發酵乳體系缺少黏性，導致發酵乳體系水分析出過多，水相分離嚴重，影響體系的穩定性，進而使口感不佳。因此，純植物基核桃發酵乳的最適發酵時間為12 h。

2.3.5 菌種接種量對純植物基核桃發酵乳品質的影響

不同菌種添加量對發酵乳產品持水性和感官評分的影響見圖6。

由圖6可知，在制作純植物基核桃發酵乳時接種1.5%～4.5%的菌種，發酵乳的感官評分和持水性隨之增加；當接種4.5%的菌種時，感官評分和持水性均達到最高值，分別為86分和58.6%；當菌種接種量超過4.5%后，感官評分下降，持水性也緩慢下降。因為保加利亞乳桿菌具有較強的產酸能力，嗜熱鏈球菌有較強的產黏能力，當菌種接種量過少時，發酵不充分，發酵乳的酸度和體系黏度不足，導致風味和口感不佳；菌種接種量過大時，產酸過多，導致發酵乳的酸味過重，發酵乳體系酸度過高使水分析出嚴重，導致發酵乳呈豆腐渣狀和團塊狀，對發酵乳的呈香呈味產生負面影響。因此，最適菌種接種量為4.5%。

2.4 響應面優化試驗設計和結果分析

2.4.1 建立回歸模型和方差分析

在單因素試驗結果的基礎上，選取發酵溫度（X₁）、發酵時間（X₂）、菌種接種量（X₃）3個因素，以感官評分（Y）為響應值，采用響應面試驗對核桃發酵乳加工工藝進行優化，試驗設計和結果見表6，方差分析結果見表7。

使用Design-Expert 8.0.6軟件對表6中數據進行多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：Y=89.28+1.42X₁+0.36X₂+2.71X₃-0.67X₁X₂+1.33X₁X₃-0.10X₂X₃-5.11X₁²-5.19X₂²-7.34X₃²。

由表7可知，該試驗感官評分二次多元回歸模型的P值＜0.000 1，說明該回歸模型極顯著（P＜0.01）。此外，回歸模型失擬項的P值為0.252 9（Pgt;0.05），表明該回歸模型的失擬結果不顯著，綜上可得，該回歸模型方差分析結果與實際結果非常接近，因此，此二次多元回歸模型適用于擬合試驗。通過進一步分析該回歸模型可得，模型的決定系數R²=0.993 1，說明該模型能夠解釋99.31%的響應值變化，存在0.69%的總變異，表明該模型的擬合度好、可信度高，試驗的誤差較小，因此可應用于純植物基核桃發酵乳的感官評價。模型響應值Y的變異系數（coefficient of variation，C.V.）是標準值與平均值的比值，C.V.可以直接反映出試驗的精準度，且與試驗的精準度和重復性成反比，其值越大代表可靠性越差，本試驗感官評分擬合中的C.V.=0.94%＜5%，表明試驗的精準度和重復性都較高，且可信度較高。

由P值可知，一次項X₁、X₃，二次項X₁²、X₂²和X₃²之間的交互作用均極顯著（P＜0.01），對純植物基核桃發酵乳感官評分的影響較大；交互項X₁X₃對結果的影響顯著（P＜0.05）；交互項X₁X₂和X₂X₃對結果的影響不顯著（P＞0.05），對純植物基核桃發酵乳感官評分的影響較小。3個因素對純植物基核桃發酵乳感官評分的影響程度為菌種接種量（X₃）＞發酵溫度（X₁）＞發酵時間（X₂）。

2.4.2 各因素間交互作用的影響

響應面陡峭越明顯、等高線越密集且呈橢圓形，表明兩因素的交互作用對試驗結果的影響越顯著。因此，兩因素具有非常明顯的交互作用時，等高線的形狀為橢圓形或馬鞍形，沒有顯著的交互作用時，等高線的形狀為圓形。通過Design-Expert軟件中的響應面優化分析方法得出純植物基核桃發酵乳的發酵溫度、發酵時間、菌種接種量各因素交互作用對感官評分影響的響應面圖和等高線圖，見圖7～圖9。交互項X₁X₃的曲面傾斜度較大、坡度較陡，且等高線呈橢圓形、較密集，說明其交互作用顯著，與方差分析結果一致。

2.4.3 最佳發酵條件的確定和驗證試驗

通過Design-Expert軟件分析得到最佳工藝條件為發酵時間12.05 h、發酵溫度36.33℃、菌種接種量4.8%，在此優化條件下，感官評分理論值達到89.7分。為了驗證模型的精準性，考慮到現有設備的參數和發酵乳產品制作的實際操作，根據可行性最終將發酵工藝條件參數調整為發酵時間12 h、發酵溫度36℃、菌種接種量4.5%，采用此工藝條件進行3次平行驗證試驗，此時感官評分達到89.4分，與預測值相近，說明該模型適用于純植物基核桃發酵乳發酵工藝的優化，具有良好的應用價值。

2.5 純植物基核桃發酵乳理化指標和微生物指標分析

由表8可知，酸度為（76.4±2.2）°T，蛋白質含量為（4.16±0.15） g/100 g，乳酸菌含量為1.68×10⁹ CFU/g，大腸桿菌和致病菌均未檢出，理化指標和微生物指標均符合標準T/WSJD 12—2020《植物蛋白飲料 植物酸奶》的相關要求。該發酵乳是一款美味營養、健康安全、天然無添加的純植物基發酵乳產品。

3 結論

本研究通過篩選合適的發酵菌種對核桃原漿進行發酵，制備純植物基核桃發酵乳，緩解了原核桃發酵乳存在的口感粗糙、風味不佳的問題。以持水性和感官評分為指標，在單因素試驗的基礎上進行響應面優化試驗，確定了最佳發酵工藝條件為料液比1∶5、蔗糖添加量7%、發酵溫度36℃、發酵時間12 h、菌種接種量4.5%。在此條件下純植物基核桃發酵乳口感細膩、香味濃郁、結構穩定，感官評分達到89.4分，相關理化和微生物指標均符合國家相關標準要求。該發酵乳是一款風味獨特的純植物基發酵乳新產品，對核桃資源的利用和滿足消費者對純植物基發酵乳的多元化選擇具有一定促進作用，并為后續純植物基發酵乳的發酵劑復配提供了一定的理論基礎。

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