冰片對巖黃連總堿在抑郁癥模型大鼠中藥效學和藥動學的影響

關鍵詞 巖黃連總堿；冰片；藥物相互作用；藥效學；藥動學；抑郁

抑郁癥作為一種常見的精神障礙，嚴重影響人們的身心健康。據世界衛生組織統計，全球約10 億人正遭受精神障礙的困擾。聯合用藥是臨床常采用的抑郁癥治療方式，而中醫藥在治療抑郁癥等精神類疾病方面歷史悠久、經驗豐富，其用藥強調身心合一的整體觀，作用更加持久、緩和、穩定，適用于抑郁癥的長期藥物調節[1―3]。

巖黃連為罌粟科植物石生黃堇Corydalis saxicolaBunting 的全草，性涼、味苦，清熱解毒、散瘀消腫[4]。巖黃連總堿為巖黃連藥材經75% 乙醇提取并經酸提堿沉法純化后所得的干燥粉末，總生物堿的含量不低于50%[4]。本課題組前期研究發現，巖黃連總堿的主要成分有脫氫卡維丁、延胡索乙素、黃連堿、巴馬汀、藥根堿、小檗堿、小檗紅堿、表小檗堿[5]，且可在一定程度上降低抑郁癥小鼠體內的炎癥水平[6]。傳統中醫藥理論認為，中藥冰片“引藥上行，獨行則勢弱，佐使則有功”[7]。現代藥理研究證實，冰片能夠抑制P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的活性[8―9]，可促進其他藥物透過血腦屏障及多種生物黏膜屏障，從而提高藥物生物利用度[10―11]，達到增強療效的目的。基于此，本實驗通過研究巖黃連總堿聯合冰片前后對脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導的大鼠抑郁樣行為的影響；建立同時檢測巖黃連總堿中脫氫卡維丁、延胡索乙素、黃連堿、巴馬汀、藥根堿、小檗堿、小檗紅堿及表小檗堿共8 種成分血藥濃度的超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜法，比較各成分在巖黃連總堿單用及與冰片聯用后在LPS 誘導的抑郁癥大鼠模型體內的藥動學參數，以期為巖黃連總堿聯用冰片在臨床試驗中的給藥方案設計和臨床合理用藥提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

XR-XQ202 型強迫游泳實驗箱、XR-XQ202 型SuperFst高通量強迫游泳實驗軟件、XR-XZ301 型曠場實驗箱（長、寬、高均為1 m）、XR-Xmaze+-SuperMaze+型高通量動物行為實驗分析軟件均購自上海欣軟信息科技有限公司；ExionLC AC 型高效液相色譜儀、Triple QuadTM5500+型三重四極桿質譜儀（配備Analyst 1.7.3 色譜工作站）購自美國SCIEX 公司；CPA225D型十萬分之一電子分析天平購自德國Sartorius 公司；D1524R 型高速冷凍離心機購自大龍興創實驗儀器（北京）股份公司；X0-800DT 型超聲波清洗機購自南京先歐儀器制造有限公司；MDF-U382VHE 型－80 ℃ 低溫冰箱購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；BCD-272WD型－20 ℃低溫冰箱購自中國海爾集團；Nikon Ti 型熒光顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 主要藥品與試劑

對照品脫氫卡維丁（批號111667-200401，純度97.5%）、延胡索乙素（批號110726-201617，純度99.80%）、氫溴酸右美沙芬（批號100201-201204，純度94.80%）均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品黃連堿（批號MUST-20051111，純度99.58%）、巴馬汀（批號MUST-20022610，純度98.75%）、藥根堿（批號MUST-20062609，純度98.62%）、小檗堿（批號20073011，純度98.96%）、小檗紅堿（批號MUST-20060701，純度98.71%）、表小檗堿（批號MUST-20082412，純度98.92%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司；巖黃連總堿（批號2102，總生物堿含量不少于50%）購自南京弘景醫藥科技有限公司，冰片（批號220501）購自江蘇省醫藥有限公司；氟西汀（批號D1823052）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LPS（批號L2880）購自美國Sigma 公司；大鼠血清白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor- α，TNF- α）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（ 貨號分別為EK301BHS/2-AW1、EK306HS-AW1、EK382HS-AW1）均購自上海酶聯生物科技有限公司；蘇木素、伊紅試劑（批號分別為DH0006、DH0051）均購自北京雷根生物技術有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純，均購自德國Merck 公司。水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

SPF 級SD 雄性大鼠，30 只，體重（200±20） g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號為SCXK（浙）2019-0001。本研究經南京中醫藥大學附屬醫院實驗動物倫理委員會批準，批號為2023DW-048-01。所有大鼠均適應性飼養7 d，保持12 h晝夜節律。

2 方法

2.1 藥效學實驗

2.1.1 造模、分組與給藥

將雄性SD大鼠30 只按照隨機數字表法分為空白對照組、陰性對照組、陽性對照組、單藥組、聯合給藥組，每組6 只。其中，陽性對照組大鼠灌胃氟西汀10 mg/kg，單藥組大鼠灌胃巖黃連總堿210 mg/kg，聯合給藥組大鼠灌胃巖黃連總堿210 mg/kg+冰片50 mg/kg（各給藥組劑量依據前期預實驗得出）。實驗前大鼠正常供給飼料及飲水，并進行1% 蔗糖水訓練。適應7 d 后，采用LPS 誘導構建抑郁癥大鼠模型，即除空白對照組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水外，其余各組大鼠每天腹腔注射1 次LPS（0.5 mg/kg），持續7 d，進行行為學實驗。確認造模成功后[12]，各給藥組大鼠按10 mL/kg 灌胃相應藥液，其間空白對照組及陰性對照組大鼠灌胃等體積溶解藥物的溶劑，連續15 d；給藥期間仍需每天腹腔注射1 次LPS造模。由于陽性對照藥的作用機制已比較清楚，后文僅用于大鼠抑郁樣行為學檢測。

2.1.2 大鼠抑郁樣行為學檢測

（1）體重：實驗開始前，記錄大鼠體重；實驗過程中，每2 d 稱重并記錄一次大鼠體重，用以分析造模和給藥期間大鼠的體重變化。（2）糖水偏好實驗：造模前，對大鼠先進行3 d 的糖水偏好適應性訓練。糖水測試前禁水不禁食12 h，進行行為學測試時，所有大鼠置于單籠，每籠籠蓋上放一瓶1%（m/V）蔗糖水溶液和純水，測試時間為4 h，中間每2 h 時交換水瓶位置。測試結束前后分別稱量水瓶質量，計算糖水偏好率[糖水偏好率（%）＝糖水消耗量/（糖水消耗量+純水消耗量）×100%]。（3）曠場實驗：各組大鼠在給藥2 周時進行曠場實驗。開始之前，將大鼠挪至行為學房間，關燈適應1 h。測試時，將大鼠背對實驗者輕輕置于長、寬、高均為1 m的實驗箱中央自由探索5 min，使用攝像機記錄各大鼠在箱內的運動軌跡，用動物行為學軟件分析大鼠曠場運動總路程。（4）強迫游泳實驗：將大鼠放入透明的有機玻璃圓筒（直徑20cm，高50 cm）中，設置水深40 cm，水溫20～25 ℃。使用動物行為學軟件記錄6 min 內的后4 min 大鼠的游泳不動時間（大鼠在水中停止掙扎，一動不動呈漂浮狀態，或只有細小的肢體運動以保持頭部浮在水面上，認為其是靜止不動的[13]）。

2.1.3 大鼠血清炎癥因子水平檢測

末次給藥后，于各組大鼠腹主動脈取血，靜置30min，以4 000 r/min 離心10 min，分離上層血清，根據ELISA 試劑盒說明書操作，以酶標儀檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

2.1.4 大鼠海馬組織病理形態學變化觀察

末次給藥后，每組隨機取2 只大鼠麻醉后用生理鹽水灌注，再用多聚甲醛灌注至頭部及四肢，待肌肉僵硬后，迅速斷頭取腦，將腦組織置于4% 多聚甲醛固定液中保存，待用。取上述腦組織，進行常規石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色后，使用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察其海馬區病理形態學變化并拍照。

2.2 藥動學實驗

2.2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（100 mm×3.0 mm，3.5 μm）；流動相為0.3% 甲酸溶液（含1 mmol/L甲酸銨）-乙腈（60∶40，V/V）；柱溫為40 ℃；流速為0.5mL/min；進樣量為5 μL。

2.2.2 質譜條件

采用電噴霧離子源、多反應監測模式進行正離子掃描；離子源溫度為550 ℃；電噴霧電壓為5 500 V。各成分的質譜參數見表1。

2.2.3 對照品溶液

精密稱取脫氫卡維丁、延胡索乙素、黃連堿、巴馬汀、藥根堿、小檗堿、小檗紅堿、表小檗堿對照品適量，加甲醇溶解，定容，配制成質量濃度分別為4.00、2.00、0.80、0.80、0.80、1.00、1.00、0.80 mg/mL 的對照品儲備液。分別精密吸取對照品儲備液適量，加50% 甲醇逐級稀釋制成8 個不同質量濃度的混合對照品標準曲線工作液。精密吸取各儲備液適量，用50% 甲醇稀釋成低、中、高質量濃度（脫氫卡維丁0.060、1.260、7.200 ng/mL，延胡索乙素0.045、1.680、9.600 ng/mL，黃連堿0.006、0.210、1.200 ng/mL，巴馬汀0.030、0.210、1.200 ng/mL，藥根堿0.030、0.210、1.200 ng/mL，小檗堿0.024、0.280、1.600ng/mL，小檗紅堿0.009、0.210、1.200 ng/mL，表小檗堿0.030、0.210、1.200 ng/mL）的質控工作液。上述溶液均于4 ℃下保存，備用。

2.2.4 內標溶液

精密稱取適量氫溴酸右美沙芬對照品，加甲醇溶解并定容，配制成質量濃度為2.11 mg/mL 的內標儲備液。精密吸取上述儲備液適量，加50% 甲醇稀釋，得質量濃度為15.0 ng/mL的內標工作液，于4 ℃下保存，備用。

2.2.5 血漿樣品處理

精密吸取血漿樣品50 μL，依次加入內標工作液5 μL、乙腈110 μL，渦旋3 min，于4 ℃下以12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液60 μL，再次于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，取5 μL上清液進樣[14]。

2.2.6 方法學考察

（1）專屬性考察：分別取大鼠空白血漿、空白血漿+對照品+內標、大鼠給藥后45 min 的血漿+內標，按照“2.2.5”項下方法處理，并按“2.2.1”“2.2.2”項下條件進樣分析，記錄色譜圖。

（2）標準曲線與線性范圍考察：精密吸取空白血漿50 μL，加入系列濃度的混合對照品溶液5 μL，按“2.2.5”項下方法處理，并按“2.2.1”“2.2.2”項下條件進樣分析，記錄峰面積。以血漿中各成分質量濃度為橫坐標（X）、相應成分峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標（Y），采用加權最小二乘法（權重系數為1/X2）進行線性回歸。

（3）準確度與精密度考察：精密吸取空白血漿50 μL，加入定量下限、低、中、高質量濃度的質控工作液5 μL，得到待測成分定量下限、低、中、高質量濃度的質控血漿樣品，每個濃度平行制備6 份，3 d 內連續制備3 批，每批隨行一條標準曲線。按“2.2.5”項下方法處理，并按“2.2.1”“2.2.2”項下條件進樣分析，記錄色譜圖。以各質控樣品的實測濃度相對其理論濃度的準確度（RE）和各質控樣品實測濃度的相對標準偏差（RSD）來表示日內、日間準確度及精密度水平。

（4）基質效應考察：精密吸取空白血漿50 μL（不加內標），按“2.2.5”項下方法處理，離心后取上清，即為空白基質。分別精密吸取低、高2 個質量濃度的質控工作液及內標各5 μL，再加入空白基質50 μL、50% 甲醇110μL，渦旋3 min，吸取30 μL 于進樣小瓶中，按“2.2.1”“2.2.2”項下條件進樣分析，記錄待測物峰面積A和內標峰面積C（每個濃度平行3 個樣品）。分別精密吸取低、高2 個質量濃度的質控工作液及內標各5 μL，再加入50% 甲醇160 μL，渦旋3 min，吸取30 μL 于進樣小瓶中，按“2.2.1”“2.2.2”項下條件進樣分析，記錄同一濃度樣品各待測物峰面積的均值A1（n＝3）及低、高2 個濃度樣品內標峰面積的均值C1（n＝6）。待測物基質效應因子（MEs）＝A/A1×100%，內標基質效應因子（MEi）＝C/C1×100%，內標歸一化的基質效應因子（ME）＝MEs/MEi×100%，計算ME的RSD。

（5）提取回收率考察：精密吸取空白血漿50 μL，按“2.2.5”項下方法處理，制備成低、中、高3 個質量濃度的質控樣品，并按“2.2.1”“2.2.2”項下條件分析，每個濃度平行6 個樣品。記錄待測物峰面積A3。另取空白血漿50 μL，按“2.2.5”項下方法處理空白血漿（不加內標），離心后上清為空白血漿溶液。分別加入低、中、高3 個質量濃度的質控工作液及內標工作液5 μL，再加入空白血漿溶液50 μL、50% 甲醇110 μL，渦旋3 min，吸取30 μL于進樣小瓶中，按“2.2.1”“2.2.2”項下條件分析，每個濃度平行6 個樣品。記錄待測物峰面積A4 以及同一濃度樣品各待測物峰面積的均值A5（n＝6）。各成分的提取回收率＝A3/A5×100%。

（6）穩定性考察：精密吸取空白血漿50 μL，加入低、高2 個質量濃度的質控工作液，每個濃度平行制備3 份，分別考察室溫下放置6 h、在自動進樣器放置24 h、－20 ℃放置72 h、反復凍融3 次、－80 ℃放置30 d后的穩定性。

2.2.7 藥動學分析

單藥組與聯合給藥組大鼠于于第15 天給藥后0、0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10、12、24 h 眼眶采血約0.3 mL于含肝素鈉抗凝劑的離心管中，以3 500 r/min離心10 min，取上層血漿，置于－80 ℃冰箱保存，備用。取上述血漿樣品，按“2.2.5”項下方法處理后，按“2.2.1”“2.2.2”項下條件進樣分析，記錄峰面積，以內標法計算大鼠血漿樣品中各成分的血藥濃度。以時間為橫坐標（X）、大鼠血藥濃度為縱坐標（Y）作圖，得各成分的平均血藥濃度-時間曲線，通過DAS 3.2.2 軟件處理，采用非房室模型計算各成分的藥動學參數，其中血藥濃度-時間下面積（area under the curve，AUC；包括AUC0-t 和AUC0-∞）采用梯形面積法計算，半衰期（t1/2）利用血藥濃度-時間曲線計算，藥峰濃度（cmax）和達峰時間（tmax）為實測值。

2.3 統計學分析

采用SPSS 23.0 軟件進行統計分析，采用GraphpadPrism 9.0 軟件繪圖。數據滿足正態分布以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗。不滿足正態分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用非參數秩和檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 藥效學實驗結果

3.1.1 各組大鼠抑郁樣行為參數比較

給藥2 周后，與空白對照組比較，陰性對照組大鼠體重、糖水偏好率、曠場運動總路程均顯著降低或縮短，游泳不動時間顯著延長（P＜0.05）；與陰性對照組比較，陽性對照組、單藥組和聯合給藥組大鼠體重、糖水偏好率、曠場運動總路程均顯著升高或延長，游泳不動時間顯著縮短（P＜0.05）；與單藥組比較，聯合給藥組大鼠抑郁樣行為參數變化差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表2。

3.1.2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

與空白對照組比較，陰性對照組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）；與陰性對照組比較，單藥組、聯合給藥組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05）；與單藥組比較，聯合給藥組大鼠血清炎癥因子水平差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表3。

3.1.3 各組大鼠海馬組織病理形態學比較

空白對照組大鼠海馬組織整體結構基本正常，神經元排列整齊緊密，神經元數量未見明顯減少。陰性對照組大鼠海馬組織整體結構異常，神經元排列整齊緊密，少量神經元核固縮。單藥組大鼠海馬組織整體結構輕度異常，神經元排列整齊緊密，個別神經元核固縮。聯合給藥組大鼠海馬組織整體結構輕度異常，神經元排列整齊緊密，極個別神經元核固縮。結果見圖1。

3.2 藥動學實驗結果

3.2.1 方法學考察結果

（1）專屬性：內標（氫溴酸右美沙芬）、脫氫卡維丁、延胡索乙素、黃連堿、巴馬汀、藥根堿、小檗堿、小檗紅堿、表小檗堿保留時間分別為1.14、1.91、1.01、1.05、1.19、1.01、1.24、1.04、1.01 min，各待測成分和內標未受到血漿中雜質及內源性物質的干擾，色譜峰良好，表明所建立的方法專屬性良好。結果見圖2（只展示了脫氫卡維丁和延胡索乙素，其余略）。

（2）標準曲線與線性范圍：結果顯示，血漿樣品中各成分在其線性范圍內線性關系良好，詳見表4。

（3）準確度與精密度：脫氫卡維丁等8 種成分的日內和日間各實測濃度的RSD 均小于15%，RE 均在±15%范圍內，符合2020 年版《中國藥典》（四部）“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的相關規定。

（4）基質效應：在低、高質量濃度下，ME的RSD 均小于15%（n＝6），表明待測成分受內源性物質影響較小，符合相關指導原則要求。

（5）提取回收率：各成分的提取回收率RSD不超過15%，說明該提取方法結果穩定，適用于本實驗中生物樣品處理。詳見表5。

（6）穩定性：血漿中各成分在5 種儲存條件下的準確度RE均在±15% 以內，RSD均不超過15%，說明血漿樣品在5 種條件下均穩定，符合相關指導原則要求。

3.2.2 藥動學研究結果

實驗結果表明，與單藥組比較，聯合給藥組大鼠體內黃連堿AUC0-t，藥根堿AUC0-t、AUC0-∞、tmax、cmax，小檗紅堿AUC0-t、AUC0-∞、t1/2、cmax，表小檗堿AUC0-t，脫氫卡維汀cmax，巴馬汀cmax均顯著升高（P＜0.05）。結果見圖3（僅展示部分成分結果）和表4。

4 討論

本實驗采用腹腔注射LPS構建大鼠急性抑郁模型。腹腔注射LPS 具有大鼠死亡率低及實際操作性強的特點，造模成功率高。炎癥水平增加是抑郁癥發生的重要機制之一。大量實驗證據表明，神經炎癥可誘導抑郁，致炎細胞因子水平與抑郁嚴重程度呈正相關[15―16]。IL-1β、IL-6 和TNF-α是抑郁癥發病和療效評估的重要生物標志物[17]，因此，本研究選取以上3 個指標進行檢測。本實驗結果表明，LPS 腹腔注射制作抑郁大鼠模型成功。通過大鼠抑郁樣行為學實驗、炎癥因子水平檢測和海馬組織病理形態學觀察結果表明，冰片與巖黃連總堿聯用后，能夠有效增強巖黃連總堿的抗抑郁效果，減輕血清炎癥因子，保護海馬神經元，但與單用巖黃連總堿比較，并未表現出明顯差異。

本實驗建立了超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜法同時測定大鼠血漿樣品中脫氫卡維丁、延胡索乙素、黃連堿、巴馬汀、藥根堿、小檗堿、小檗紅堿、表小檗堿8 種成分的分析方法。為了考察巖黃連總堿在大鼠體內的藥動學，本文以巖黃連總堿中的脫氫卡維丁等8 種成分為檢測指標，通過不同色譜條件對比改進后，確定以甲酸溶液- 乙腈（60∶40，V/V）為流動相，又比對了0.1%、0.2%、0.3%、0.4% 的甲酸溶液-乙腈，最終確定以0.3% 甲酸溶液（含1 mmol/L 甲酸銨）-乙腈（60∶40，V/V）為流動相等度洗脫。在此條件下，該方法基質效應較低，空白血漿中無明顯干擾，分析物峰形良好，通過了完整的方法學驗證，符合生物樣品的定量分析要求，表明本實驗所建立方法的靈敏度高、專屬性強。

藥動學結果表明，小檗堿等吸收難的結果與文獻報道一致，但冰片與巖黃連總堿聯用后，對黃連堿、小檗紅堿、藥根堿和表小檗堿等的吸收產生了顯著影響，說明冰片一定程度上提高了巖黃連總堿在大鼠體內的生物利用度，促進巖黃連總堿吸收的作用顯著。Brzozowska等[18]研究發現，抑郁狀態下P-gp 的下調會導致生物堿血漿暴露量增加。有文獻報道小檗堿可能是P-gp 的底物[19]，而冰片作為P-gp 抑制劑抑制了P-gp 活性[20]，從而影響小檗堿等生物堿的體內濃度，這為冰片與巖黃連總堿聯用于臨床治療抑郁癥提供了一定的依據。

綜上所述，巖黃連總堿單用及與冰片聯用均能改善抑郁癥大鼠模型抑郁樣行為，減輕血清炎癥因子水平，保護海馬神經元；冰片一定程度上提高了巖黃連總堿中藥根堿、黃連堿等生物堿在大鼠體內的暴露量，提高其生物利用度，促進了巖黃連總堿的吸收，有利于巖黃連總堿發揮抗抑郁作用。