運動發酵單胞菌益生拮抗效應的研究現狀及展望

摘要：運動發酵單胞菌（Zymomonas mobilis）是一種唯一通過ED途徑兼性厭氧發酵葡萄糖的微生物食品安全級菌株（GRAS），具有許多獨特的生理特征與優良的工業生產特性.基于合成生物學方法和代謝工程改造，綜述運動發酵單胞菌獨特的生理特性及其在食品、醫藥等不同領域的應用，重點介紹運動發酵單胞菌益生效應因子及其涉及的拮抗效應、群體感應等方面的研究進展及瓶頸.同時探討持續開發、完善高效精準的基因編輯技術、理性和非理性設計代謝途徑定向調控方法及高通量篩選手段，在運動發酵單胞菌益生特性的發現以及生物治療與固氮等方面的突破，推動合成生物學理論研究和實踐生產的發展.

關鍵詞：運動發酵單胞菌; 益生效應; 群體感應; 底盤細胞; 合成生物學

中圖分類號：Q939.97

文獻標志碼：A

文章編號：1001-8395（2025）01-0015-13

doi：10.3969/j.issn.1001-8395.2025.01.002

運動發酵單胞菌是一種革蘭氏陰性兼性厭氧細菌，可將葡萄糖、果糖和蔗糖作為碳源進行發酵.該菌微好氧生長，大多呈直桿狀，尾端呈圓形或卵圓形，有1～4根鞭毛，常成對存在，但很少集結成短鏈狀;兼性厭氧條件生長，在無氧條件下生長最佳，有氧條件下也可生存;正常發酵溫度為30～37 ℃，在60 ℃下5 min可滅活.運動發酵單胞菌高度耐酸，可在pH3.5～7.5環境下生長，而pH值5.0～5.5的環境適合該菌發酵產乙醇[1].相對于釀酒酵母，運動發酵單胞菌因其基因組小、乙醇發酵速率高和對糖表觀收率高、乙醇耐受性好，以及生物安全性等獨特的生理特性受到研究人員的重視[2-3].近年來，運動發酵單胞菌作為纖維素類生物質生物煉制能源的細胞工廠受到重視，是美國能源部國家可再生能源實驗室（NREL）研究的主要底盤細胞之一.

除了用于纖維素乙醇及平臺化合物生產，運動發酵單胞菌具有益生元的特性和功能且副產物低等優點，在食品、醫藥等領域也逐漸受到重視（圖1）.傳統上，南美洲人習慣喝一種運動發酵單胞菌制成的飲料“Aguamiel”，主要用于治療腎臟和代謝疾病.早期Lindner[4]報道顯示，這種新鮮濃縮的龍舌蘭汁在熱帶地區相當于西方國家的益生菌飲料;并進一步報告了運動發酵單胞菌成功應用于治療牛的幾種疾病以及人類的化膿性癤和傷口.運動發酵單胞菌還可作為食品發酵烘焙領域中釀酒酵母的替代菌株，在釀酒酵母不耐型患者群體中具有潛在的應用價值[5].自20世紀初分離獲得該菌以來，研究人員已在生態學、生理生化、分子生物學、發酵動力學、基因組、轉錄組及蛋白質組學等方面做了大量的研究[6-11].研究報道表明，運動發酵單胞菌對許多細菌、絲狀真菌均具有明顯的拮抗作用，可有效治療慢性小腸結腸炎、慢性膀胱炎以及婦科感染引起的炎癥等細菌性疾病[1].

盡管目前研究人員針對運動發酵單胞菌已開展了一系列包括生理、遺傳及代謝工程改造方面的研究，特別是拓寬了其底物利用范圍及產物生成種類，但是與模式微生物菌株相比，運動發酵單胞菌

在益生特性及其效應因子的挖掘與定量、生物元件組裝、代謝路徑構建與時空調控以及基因組編輯與優化等領域才剛剛起步.本文綜述了運動發酵單胞菌作為一種生物安全性益生菌實現工業產品生產的獨特生理特性，重點介紹了其在食品、醫藥等領域的應用，總結了運動發酵單胞菌益生效應因子及其涉及的拮抗效應、合成與分泌等代謝機制的研究進展，同時探討了運動發酵單胞菌在遺傳學方法、基因編輯技術與工具等方面的進展及瓶頸，以及進一步開發運動發酵單胞菌成為優良的細胞工廠，推動基于運動發酵單胞菌底盤細胞的合成生物學理論研究在食品、醫藥等領域的應用.

1"運動發酵單胞菌的益生特性及應用

運動發酵單胞菌已被證實具有良好的益生元和益生菌特性與功能，在食品、醫藥等領域具有很大的應用潛力.在食品發酵領域中，釀酒酵母細胞壁成分被認為是引起炎癥性腸病或克羅恩病的抗原，為了避免酵母不耐癥患者食用含酵母的面包引起過敏型應激反應，亟需尋找一種可代替面包酵母的食品級安全菌株應用于面包發酵[12].運動發酵單胞菌具有許多獨特的生理特性和優良的工業生產特性，如高糖吸收率[13]、高乙醇產量[14]及良好的環境適應性[15]，且在釀造和發酵工業中顯示出與酵母相當的優勢[16].由于野生型運動發酵單胞菌無法利用麥芽糖進行小麥面粉發酵，起初研究人員將運動發酵單胞菌作為食品添加劑與其他可食用發酵微生物共發酵，評估了運動發酵單胞菌在面包發酵中的糖利用效率和發酵效果[17-19].針對野生型運動發酵單胞菌無法利用麥芽糖的問題為運動發酵單胞菌與異型發酵型乳酸菌（Lactobacillus sanfranciscensis）摩爾比1∶1比例混合發酵提供了另一個策略[20].Musatti等[18-20]通過代謝組學對運動發酵單胞菌發酵小麥面團時產生的揮發性組分進行了檢測分析，結果表明運動發酵單胞菌能產生乙醇、乙酸、4-羥基-2-丁酮等類似傳統發酵劑的揮發性化學物質，但發酵中添加NaCl會降低面團發酵效率與性能.Oda等[17]分別報道了面粉中蔗糖添加質量比1∶20時運動發酵單胞菌表現出良好的發酵性能，可以有效地發酵面團，產期率和保留率分別為80%和85%，顯著地提高了最大面團高度2.6倍，這為無酵母發酵產品開發提供了新的途徑.此外，我們前期研究工作中利用ARTP誘變獲得的一株運動發酵單胞菌D95突變菌株與安琪酵母進行面包發酵性能比較分析試驗，結果表明單一運動發酵單胞菌可以實現代替釀酒酵母發酵面包，運動發酵單胞菌發酵面包含水量比酵母面包提高了1.63%，面包組織松軟潤口，具有良好的口感與烘培品質[21].這些研究進一步為運動發酵單胞菌在食品發酵烘培中的應用奠定了基礎.雖然運動發酵單胞菌的呼吸鏈速率很高，比常見的模式微生物大腸桿菌和釀酒酵母要高，但其生物學功能尚未完全解析.

近年來，運動發酵單胞菌益生元和益生菌的特性與功能在人類健康中的應用也受到了越來越多的重視并取得了一定的突破[22]，表現出很大的應用潛力.運動發酵單胞菌最初是從墨西哥的龍舌蘭酒（pulque）中分離獲得的[1]，可利用自身攜帶的果聚糖蔗糖酶（sacB）生成果聚糖（levan）和果寡糖（FOS）[23].果聚糖是一種天然的高分子多聚合物，在食品和醫藥上具有多重功效，如抗腫瘤、降血壓或發揮益生元功能[24-25].此外，果聚糖作為FOS的前體，經酸水解可轉化為1-酮糖（1-kestose），6-酮糖（6-kestose）及耐斯糖（nystose）等低聚果糖，刺激內生雙歧桿菌生長[26-27].除此之外，果聚糖還展現出能夠黏附胃黏膜、清除DPPH自由基，減少炎癥介質分泌等益生功效[28-30].FOS也是一種益生元，具有調控腸道微生物菌群組成與活性發生特定改變的功能而有益于宿主健康[31-32].而最近研究報道表明，利用sacB酶還可以生產另一種益生元蔗果三糖的功能性產品[33].運動發酵單胞菌與酵母共發酵產生低酒精度碳酸飲品的開菲爾酒（Kefir）也是一種功能性保健飲品，又稱“菌菇（tibicos）”，中國天山地區tibicos單分子測序的研究結果表明，運動發酵單胞菌是其中的一種主要益生菌[34].除了龍舌蘭酒、開菲爾酒外，運動發酵單胞菌還可應用于藍莓酒、蜂蜜酒等.利用運動發酵單胞菌D95發酵的藍莓酒含有豐富的萜烯類風味物質（約占70%）和山梨醇（質量濃度33.94 g/L）[35].研究人員利用山梨醇飼喂小鼠，顯著地提高小鼠血漿胰島素濃度，降低空腹血糖水平，并改善了小鼠腸道微生物群落結構，其中雙歧桿菌（Bifidobacterium）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、凸腹真桿菌（Eubacterium ventriosum）、分段絲狀細菌（Candidatus arthromitus）、瘤胃球菌（Ruminococcus torques）顯著降低，螺桿菌屬（Helicobacter）、泰勒菌（Tyzzerella）、另枝菌屬（Alistipes）、普雷沃氏菌屬-9（Prevotella 9）含量增加[36].此外，臨床實驗觀察了便秘患者連續15 d服用運動發酵單胞菌發酵液后腸道功能與脂質狀況，結果表明運動發酵單胞菌展現出有效降低膽固醇和血脂，促進腸道蠕動的益生功效[37].研究人員通過大鼠模型試驗評估了Z. mobilis UFPEDA-202的益生菌特性與生物安全性，結果表明運動發酵單胞菌是無致病性的安全食用菌株，對小鼠免疫功能具有明顯的改善調節作用[38].最近一項研究報道也進一步表明，飼喂外源性Z. mobilis可以緩解右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導的小鼠結腸炎癥狀，如體重減輕、疾病活動指數、結腸重量/長度比顯著降低和組織病理學改善[39].此外，運動發酵單胞菌攜帶L-天門冬酰胺酶基因，其合成的L-天冬酰胺酶對白血病細胞具有毒性和抑制作用[40].運動發酵單胞菌這些益生特性推動了開發其成為益生菌的商業化生產，標準化發酵的運動發酵單胞菌原料可用于制備藥用膠囊型益生菌[41-42].

運動發酵單胞菌與其他微生物之間的拮抗作用的研究報道，該菌對多種革蘭氏陰性與陽性菌以及真菌具有廣譜的抗菌活性，其中包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、滕黃微球菌、黃曲霉菌等[43].大多數針對運動發酵單胞菌拮抗效應的研究報道都集中在人類疾病與炎癥治療方面，而僅一項研究表明運動發酵單胞菌對柑橘病原體黃單胞菌有抑制作用[44].一些研究表明，運動發酵單胞菌不僅可用于治療婦科疾病感染（如陰道炎），而且對引起腸道疾病感染的腸炎沙門氏菌、痢疾志賀氏菌和大腸桿菌等也具有明顯的拮抗活性，其發酵液可作為小腸結腸炎、膀胱炎的治療劑，起到緩解炎癥癥狀的作用[45-46].最近研究報道顯示，Z. mobilis可以改善小鼠腸道菌群，增加阿克曼氏粘桿菌（Ackermansia mucophilus）豐度，減少大腸桿菌積累，起到緩解結腸炎癥狀的作用[39].因此，運動發酵單胞菌對疾病感染的臨床應用表明，這種抗菌活性能夠在體內發揮益生效果.運動發酵單胞菌能夠產生抗菌物質的事實也推動了對其在臨床治療潛力的研究.另外，運動發酵單胞菌拮抗效應也在釀酒發酵過程中發揮了積極作用.在棕櫚酒生產中，由于運動發酵單胞菌在整個釀酒發酵過程中占主導地位，腸桿菌在發酵初期就處于一個低水平的狀態，且隨著發酵的進行而持續減少[47].此外，病原性細菌單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、血清型傷寒沙門氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）、索尼氏志賀氏菌（Shigella sonnei）以及金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）也被證明在生產龍舌蘭酒pulque過程中死亡[48].在所有這些情況下，抑制效應可能不僅是由于pH值降低、酒精積累上升等因素，運動發酵單胞菌產生的拮抗因子也發揮了一定的作用.發酵初期，運動發酵單胞菌數量增加45 d達到峰值，占總細胞數的60%;并伴隨著酵母豐度的上調而減少[1].這表明酵母活性可能對無糖條件下的運動發酵單胞菌具有拮抗作用，但具體機制仍有待闡明.

2"運動發酵單胞菌的拮抗因子及其群體感應

早期研究報道表明，運動發酵單胞菌可以抑制大腸桿菌交配伴侶的生長和結合能力，并在其治療應用潛力的研究與共培養過程中觀察到該菌可能產生一些未知的抗菌活性物質[43].Lima等[45]推測Z. mobilis可能產生一種抗菌肽（Zymocins），但沒有對其進行純化和表征.此外，研究人員也通過一些實驗驗證過氧化氫、乳酸或抗生素是否與拮抗活性有關，然而這些研究均未取得成功.盡管自20世紀以來運動發酵單胞菌對治療疾病感染的拮抗效應已被證實，但仍未有證據表明運動發酵單胞菌能產生類似細菌素的多肽或化學物質.近期一項研究報道表明，運動發酵單胞菌的拮抗活性分子排除其細菌素樣肽的性質，而是一種在好氧條件下通過呼吸鏈進行合成的耐熱低分子量（低于3 kDa）化合物，且對蛋白酶處理具有耐受性[47].其中丙酸鹽和醋酸鹽在運動發酵單胞菌抗菌活性中起核心作用.然而，運動發酵單胞菌基因組并不攜帶產丙酸鹽的琥珀酸、丙烯酸酯、1，2-丙二醇或檸檬酸途徑的完整基因，以及其編碼參與醋酸合成的脫氫酶基因仍需要被識別[49].另外，研究結果也未完全排除呼吸系統分解代謝中一些未知的低分子量抑制副產物的參與.

細菌之間主要通過被定義為自誘導劑（AI）的化學信號分子進行相互交流，而產生和釋放的小分子通常被認為是“話語”，可以到達其他細胞并引出“答案”，這個過程稱為群體感應（QS）[50-51].這些“話語”分子一般包括革蘭氏陰性菌的N-酰基高絲氨酸內酯（AHLs）和革蘭氏陽性菌的寡肽（Oligopeptides）[52].另外，許多細菌可以使用一種與寡肽和AHLs自誘導劑（具有物種特異性結構和活性）相反的QS信號分子自誘導劑II（AI-2）[53-55].AI-2是由S-核糖素同型半胱氨酸酶（LuxS）和5’-甲基硫腺苷/S-腺苷同型半胱氨酸核苷酶（Pfs）介導的兩步合成反應產生的甲基循環副產物[56]，可以觸發革蘭氏陰性和陽性菌的QS反應，并被認為構成一個跨物種特異性的細菌交流系統，甚至能影響自身不能產生自誘導劑的細菌.與Pfs和LuxS介導的兩步法不同，運動發酵單胞菌采用一步法水解方式分解S-腺苷-l-同型半胱氨酸（SAH）完成甲基循環，從而導致細胞無法產生AI-2[57-58].運動發酵單胞菌作為一個生物燃料工業生產的候選菌株，具有一系列Mo依賴性生物固氮系統，能夠在不影響乙醇的情況下進行有效地固氮[59-60].研究報道表明，雖然Z. mobilis細胞不能產生AI-2，但能對外源自誘導劑AI-2作出響應，其生長速度與基因表達譜均發生顯著性變化[52]，這可能是為了適應固氮的高能量需求.另外，AI-2依賴性QS的激活會直接影響運動發酵單胞菌葡萄糖攝取、生物固氮、相對乙醇產量及生物量積累等重要生物學過程，誘導Z. mobilis細胞的代謝通量更傾向于乙醇的產生而不是生物量的積累.這種獨特的糖代謝途徑可能和運動發酵單胞菌能量產生與生長部分耦聯現象相關，即其能量的產生率和利用率之間不完全關聯.因此，運動發酵單胞菌可以利用氮氣作為氮源取代工業肥料，并伴隨葡萄糖-生物量的減少和葡萄糖-乙醇轉化率增加，預計可為纖維素乙醇生產節省超過100萬美元/年的經濟效益[59].然而，目前關于運動發酵單胞菌生物固氮的調控機制知之甚少.我們前期研究工作在N2固定條件下對Z. mobilis進行了蛋白質組和蛋白質乙酰化的高通量分析發現，蛋白乙酰化在調控運動發酵單胞菌生物固氮代謝的各方面發揮重要作用[61].此外，運動發酵單胞菌作為釀酒酵母生產纖維素乙醇的潛在替代品，具有輔助因子平衡的優勢，但其對木質纖維素水解產物中副產物和抑制劑的耐受性較低，這也限制了其應用.最近一項研究報道通過Z. mobilis ZM4細胞中異源共表達大腸桿菌（Escherichia coli）Pfs/LuxS蛋白酶產生AI-2信號分子，以達到促進運動發酵單胞菌產生更多的生物膜，提升運動發酵單胞菌對乙酸脅迫的耐受性的效果[62].與之前研究報道相矛盾的是，該研究結果顯示內源或外源性AI-2并不影響運動發酵單胞菌ZM4的生長、生物膜形成、運動性及抗逆性，但單獨表達Pfs蛋白酶卻可以顯著地提高生物膜形成與細菌運動性.這可能是由于Pfs利用低濃度SAH抑制了甲基化DNA積累.

3"運動發酵單胞菌底盤細胞構建與合成

運動發酵單胞菌具有基因組小、遺傳操作工具基本完備、安全性高、環境脅迫耐受性強及副產物低等獨特的生理特征，除有利于其在食品、醫藥等生產領域中的應用外，已作為底盤細胞用于開發多種平臺化合物生產，有助于理解微生物底盤細胞代謝的精準調控.碳、氮元素是地球生物化學循環的重要組成部分，與地球的能源與環境息息相關，利用微生物進行碳、氮固定具有重要意義.運動發酵單胞菌具備一系列完整的Mo固氮酶系統，能夠在N2為唯一氮源進行固氮的前提下，通過合成生物學手段引入外源的固碳途徑，構建出目前自然界尚不多見的微生物工程菌，將有可能實現氮氣和二氧化碳的共同利用.然而，固氮過程受復雜的調控作用，并進化出了自身獨特的氧保護機制，目前關于固氮過程的合成生物學取得了一定的研究進展，但仍處于理論探索階段.此外，碳，氮的固定過程都需要很高的能量消耗，盡管運動發酵單胞菌可以利用F型ATP合成酶（F0F1-type ATPase）通過質子梯度產生ATP，但其較低的氧化磷酸化產能效率是一個富有挑戰性的難點.早期Amador-Noguez等[63]提出了運動發酵單胞菌的固氮調控機制，為固氮調控機制的深入研究奠定了理論基礎.基于運動發酵單胞菌全基因組小、可操作遺傳體系成熟、安全性等優勢，利用內，外源性CRISPR-Cas基因編輯、熒光報告基因元件等遺傳轉化方法與技術，將其作為底盤細胞推動生物固氮系統中氧保護機制、固氮基因簇簡化、固氮催化元件及調控元件的挖掘與鑒定等固氮代謝機制的研究，是未來合成生物學值得拓展的研究方向，在利用二氧化碳和氮氣發酵生產目標化合物具有很大的應用潛力.

3.1"運動發酵單胞菌遺傳改造工具包

目前針對非模式菌運動發酵單胞菌已開發了多種基因組編輯的遺傳改造工具，分為隨機突變（物理誘變、化學誘變、轉座子突變及適應性進化）和理性設計.早期研究通過亞硝基胍（NTG）化學誘變劑成功獲得了運動發酵單胞菌高乙酸耐受菌株AcR與具有絮凝性狀的菌株ZM401[64-65].同時，Typas等[66]利用自殺型載體攜帶的微型轉座子對運動發酵單胞菌染色體進行定向突變，成功地獲得了穩定的運動發酵單胞菌營養缺陷型菌株，隨后Tn5、Tn10、Tn951等轉座子及ISZm1068插入元件也相繼被開發應用[67-68].何明雄團隊[69]在前期工作中將ARTP介導的誘變方法應用于運動發酵單胞菌，篩選獲得了一株可耐受pH3.5的突變菌株PH1-29，該方法具有安全、有效等優點.此外，適應性進化（ALE）作為提高馴化菌株性狀最有效的誘變方法之一，可以提高馴化菌株耐受能力或魯棒性，在運動發酵單胞菌中已被廣泛應用.在運動發酵單胞菌對乙酸和糠醛耐受性上，我們研究工作利用基因組改組技術通過ALE篩選獲得了耐受質量分數7 g/L的乙酸和3 g/L的糠醛的突變菌株[70].最近，Das課題組[71]利用ALE技術篩選出了一株葡萄糖與木糖共利用效果最好的菌株AD50.

理性設計借助認知或系統生物學數據學習進行推測，利用穿梭質粒過表達或基因編輯等技術手段將目標生物元件、設計理念及代謝通路導入底盤細胞或直接對底盤細胞進行遺傳改造.目前研究人員已在運動發酵單胞菌中構建了一系列穿梭質粒，并成功地表達目的基因，建立了成熟的相關質粒構建組裝方法，如Gibson和BioBrick組裝方法[3].運動發酵單胞菌最常使用的質粒主要包括：一是在大腸桿菌-運動發酵單胞菌之間存在并復制繁殖的穿梭質粒[72-73]，這種質粒往往骨架太大，導致轉化效率偏低;二是基于革蘭氏陰性細菌宿主的廣譜性質粒，這類質粒包含宿主識別的復制子與mob基因，一般采用結合轉化法轉化至運動發酵單胞菌中，如pBBR1MCS-2質粒[74-75].何明雄團隊[76]利用Golden Gate方法通過限制內切酶識別將含酶切序列的特異性接頭序列連接在啟動子Padh2、終止子序列Tpdc及綠色熒光報告基因gfp序列兩側，成功地構建了綠色熒光蛋白表達的定向組裝與表達的“One-POT”多DNA片段無痕連接組裝方法，這為實現運動發酵單胞菌中多基因多途徑組裝奠定了基礎.隨著質粒及抗性基因的深入研究，質粒大小越來越小，目前廣泛應用的pEZ15Asp穿梭質粒骨架大小只有3 kb，含有大腸桿菌和運動發酵單胞菌體內復制的復制子、壯觀霉素抗性篩選標記及BioBrick酶切位點[77]，這也有利于遺傳操作與構建代謝通路.此外，同源重組作為運動發酵單胞菌中基因插入失活或基因替換的常用方法之一，已被應用于目的基因失活菌株的構建，如ndh-1菌株、sacC-1菌株及限制修飾系統（R-M）失活菌株[78-81].同時，研究人員利用FLP重組酶或sacB篩選方法也成功消除了質粒上引入的抗性基因[3，82-83].運動發酵單胞菌中除了常用的篩選標記壯觀霉素（Spectinomycin）、四環素（Tetracycline）、氯霉素（Chloromycetin）及卡那霉素（Kanamycin），運動發酵單胞菌ZM4的泛酸營養缺陷型標記的發現也有助于在運動發酵單胞菌中通過營養缺陷型標記篩選目標突變菌株[84].Kiley課題組[75]開發出基于同源重組和質粒丟失的兩步無痕編輯技術，成功地敲除了乳酸脫氫酶基因ldh和纖維素合成酶操縱子bcsABC，并插入了鏈孢紅素操縱子，實現無抗性基因菌株的構建.然而，這些方法步驟較為繁雜，時間周期長，而且編輯效率不高.

簇狀規律間隔短回文重復序列CRISPR系統廣泛存在于原核生物中，提供宿主抗病毒感染的適應性免疫[85].目前，研究人員已在運動發酵單胞菌中開發了多種基于CRISPR的基因編輯技術，極大推動了運動發酵單胞菌底盤細胞開發.2017年，Cao等[86]將CRISPR-Cas9引入運動發酵單胞菌，構建pSUZM2a-Cas9質粒表達來自于化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9基因，并在T7啟動子帶動表達的單鏈RNA介導下成功地消除運動發酵單胞菌的內源性質粒.Shen等[87]利用鏈霉菌（Francisella novicida）中Cas12a（Cpf1）蛋白在運動發酵單胞菌ZM4中構建了誘導表達Cpf1蛋白的基因編輯重組菌株，引導RNA在雙鏈DNA靶位點進行切割，實現運動發酵單胞菌中內源性質粒消除、基因缺失及堿基替換等基因編輯操作，為運動發酵單胞菌的功能基因組研究和菌株改良提供了一種普適性的基因組編輯工具.同時，該工具還被用于精準調控代謝工程，建立了運動發酵單胞菌ZM4中乳酸生物合成途徑.另外，研究人員利用一種可編程的基因沉默系統CRISPR干擾（CRISPRi），精確調控基因抑制的時機和程度，并探究了運動發酵單胞菌生長必需、糖酵解，以及異丁醇耐受性相關基因的功能，使基因功能研究更加便捷[88].由于外源性編輯酶的CRISPR-Cas系統對宿主細胞有一定的毒性副作用，開發內源性CRISPR-Cas系統是有效解決這一障礙的方法.不同于異源表達外源Cas蛋白，內源性CRISPR-Cas系統如I-F型CRISPR-Cas系統也同樣表現出優異的基因編輯能力，可以有效地實現基因敲除、替換、原位核苷酸修飾等基因編輯方式，提高了運動發酵單胞菌中基因編輯效率，為構建合成生物學底盤細胞提供有力的技術支撐[89].Geng等[90]利用內源性I-F型CRISPR-Cas系統成功敲除了運動發酵單胞菌的4個內源性質粒，并進一步研究結果顯示突變菌株ZMNP比野生型表現出更好的脅迫耐受能力.此外，研究人員[91]在內源性I-F型系統的基礎上，開發了一種CRSPR-Cas3基因編輯方法，在原位引入Cas3突變體能夠引發雙鏈斷裂從而達到實現目標基因編輯.我們團隊與華中農業大學彭楠課題組[92-93]合作研究發現，運動發酵單胞菌可以利用微同源介導的末端連接（MMEJ）途徑修復了I-F型CRISPR-Cas系統介導的DNA斷裂，在此基礎上開發了一種簡單且有效的聯合內源性I-F系統和MMEJ修復方式的新型基因編輯工具.然而，近期何明雄團隊[94]在運動發酵單胞菌中利用CRISPR系統對基因進行編輯時發現存在基因逃逸現象，這也表明充分的驗證方法對于獲得目標陽性菌株至關重要.

利用CRISPR-Cas技術進行目標基因編輯后，質粒的快速消除是不可或缺的一環，也是制約多輪基因編輯的一個重要瓶頸.傳統常用的質粒消除策略基于編輯質粒具有一定毒性副作用及質粒之間不相溶性，通過無抗性培養基連續傳代培養，最終獲得質粒消除的基因編輯菌株，但操作繁瑣、效率低且耗時長，制約了CRISPR-Cas系統的高效、快速及連續應用.為了解決這一問題，溫敏型復制子替換是策略之一，通過溫度升高抑制溫敏型復制子輔助編輯質粒的消除[95].近期，何明雄團隊[96]開發了基于茶堿依賴型核糖開關D（RSD）的編輯質粒消除策略，在37 ℃下進行液態和固態培養基交替培養可以高效消除編輯質粒.反篩標記也能用來輔助編輯質粒消除.運動發酵單胞菌中苯丙氨酸-tRNA合成酶的α亞基PheS，能夠氨酰化苯丙氨酸，而其突變體PheS*則氨酰化有毒苯丙氨酸類似物P-氯苯丙氨酸（4-CP）.由強啟動子Pgap驅動的PheS表達可以誘導運動發酵單胞菌對4-CP產生足夠的敏感性，借此能輔助運動發酵單胞菌基因編輯后質粒的快速消除[97].此外，利用邏輯線路誘導調控編輯質粒gRNA表達也是實現質粒消除的可行性策略，且已被應用于枯草芽孢桿菌中[98]，但目前該誘導型啟動子系統存在不同程度的滲漏.因此，篩選適用于運動發酵單胞菌且更加嚴謹的或新的誘導型啟動子，以及構建結合轉錄與翻譯水平多層面調控的邏輯路線，可能是更加有效地實現編輯質粒快速消除的策略.

另外，限制修飾R-M系統是一種保護宿主細胞免于外來DNA入侵的免疫系統，可以破壞細菌體內外源性DNA，改變細菌對外源性DNA的攝取能力.前期研究結果表明，運動發酵單胞菌中限制修飾R-M系統可以通過調控內源R-M系統或外源性DNA甲基化狀態影響外源質粒的電轉化率.運動發酵單胞菌中IV型R-M系統編碼甲基轉移酶和限制性內切酶的基因mrr（ZMO0028）失活，可提高甲基化質粒的電轉化效率60倍，而且不影響宿主細胞的生長率與生物量;而R-M系統I型負責識別非甲基化或錯誤甲基化修飾DNA的S亞基編碼基因ZMO1933失活雖然也可提高非甲基化質粒的電轉化效率30倍，但會影響細胞生長[81].何明雄團隊[79]前期研究結果也顯示，在運動發酵單胞菌突變菌株Zm1933和Zmmrr中甲基化質粒pBRR1MCS-tet電轉化率分別提高了2和17倍.另外，楊世輝團隊[89]研究發現，相對于野生型菌株，基因敲除的菌株ΔZMO0028中pEZ15Asp質粒電轉化率提高了90倍，同時ZMO0028基因敲除前提下所有基因編輯操作效率均得到了明顯的提升：單基因敲除效率達100%，10 kb以上的DNA片段編輯效率從12.5%提升至50%，這表明運動發酵單胞菌中限制修飾R-M系統不僅影響外源性DNA的轉化效率，而且影響CRISPR-Cas編輯工具的效率.此外，白鳳武團隊[83]在運動發酵單胞菌中雙敲除ZMO0028和ZMO1933基因，在不影響菌株生長、乙醇產量及絮凝性能的情況下大幅提高了甲基化和非甲基化質粒轉化效率.

3.2"運動發酵單胞菌底盤細胞工廠構建

高通量快速篩選得到目的菌株是合成生物學細胞工廠邏輯設計研究的關鍵環節[99].傳統篩選方法通常以目標代謝產物為主線，通量少、效率低及時間與人力成本高，而構建高通量自動化篩選平臺技術不僅能夠提高篩選效率，還可以減少人為誤差與提高準確度.目前，基于Bioscreen C的高通量微量生長篩選系統已應用于運動發酵單胞菌，可以同時檢測200種不同篩選條件對菌株生長的影響[100].此外，基于高通量微生物液滴微控流平臺（MMC）的全自動傳代篩選技術也被用于遺傳改造后優勢菌株的快速自動化馴化篩選[101].近年來，除了基于表型篩選技術，江南大學研究人員[102]利用赤蘚糖醇應答轉錄因子EryD開發了動態特異性響應的傳感器-調節器系統，構建了基于赤蘚糖醇生物傳感的高通量篩選與鑒定方法.此外，趙惠民團隊[103]實現了利用釀酒酵母關鍵代謝產物丙二酰輔酶A傳感器FapR與相應的操縱子fap檢測細胞內丙二酰輔酶A水平轉換為熒光信號的強度.然而，目前運動發酵單胞菌中仍缺乏這些基于生物傳感器的高通量篩選技術，因此建立相關方法可應用于運動發酵單胞菌突變體文庫的篩選、微生物生理代謝、發酵工藝優化及適應性馴化研究，促進生物元件預測、邏輯路線設計、代謝工程改造以及細胞工廠構建與性能評估.

原核生物通過多種精細代謝調控機制，包括基因、轉錄及翻譯與翻譯后水平的調控等，使其能更加良好地適應環境.傳統代謝工程中通常無需感知細胞內外環境，直接采用特定強度的組成型啟動子元件和核糖體結合位點RBS對特定基因在轉錄與翻譯水平上進行調控，這類代謝調控一般稱為靜態調控[104].目前關于運動發酵單胞的菌靜態調控研究與應用相對較多，如常用的強啟動子gap、pdc、eno、adhB等通過過表達或抑制目的基因，調控目標代謝產物的產量或增強抑制物耐受性[3，105].此外，Contreras等[106-107]利用生物信息學方法對轉錄組數據進行生物元件挖掘與鑒定，發現了運動發酵單胞菌中存在與遺乙醇、乙酸及木糖脅迫相關的36個5’UTR，其中UTR_ZMO0347被證實在乙醇脅迫條件下具有調控下游基因hfq表達下調的功能，這為脅迫環境中運動發酵單胞菌應答調控網絡的研究提供了新思路，首次提出了運動發酵單胞菌中sRNA-sRNA及sRN-protein之間相互作用的調控網絡，并進一步解析了Zms4和Zms6兩個sRNA對乙醇生成的調控機制.然而，這些靜態調控過程可能會引起細胞內穩態平衡的絮亂且無法對外界環境的改變做出應激響應.因此，研究人員開發了基于動態調控策略的系統，即通過感應相關信號分子的改變，動態調控代謝途徑中關鍵基因的轉錄表達，在發酵工業中得到了良好的應用.這些系統包括乳糖操縱子、色氨酸操縱子及λ噬菌體中T7轉錄系統及PLPR-Clts857溫敏型啟動子等.曹志軍團隊[108]通過兩步法利用PLPR-Clts857溫敏型啟動子系統發酵生產丙酮酸，發酵前期在40 ℃打開noxE基因的表達閥，隨后在34 ℃關閉該啟動子抑制細胞生長，從而將丙酮酸產量提高到93.0 g/L.此外，陳國強團隊[109]研究開發了一種利用熱失活蛋白酶和冷失活REV敏感轉錄因子在轉錄翻譯水平上調控特定基因表達的系統，并引入專一性水解殘留或泄漏表達蛋白的水解酶模塊進一步加強該系統的嚴謹性，嚴格調控基因表達，使得該系統在基礎研究、生物醫學及工業領域應用具有巨大的潛力.除上述兩種動態調控系統之外，細胞自主誘導型調控系統也被關注與開發應用.中山大學劉建忠團隊[110]利用群體感應（QS）系統動態調控4-羥基苯乙酸代謝途徑，將產量提高至（17.39±0.26） g/L.Tsuge課題組[111]開發了乳酸脫氫酶基因ldhA厭氧誘導性啟動子調控碳代謝流的系統，有氧條件下碳流重定向至磷酸戊糖途徑（PPP）生成大量的NADPH，實現了1，5-戊二胺生產的有氧響應開關，顯著地提高了其生產速率，而在進入厭氧階段后使得碳流重新轉向糖酵解途徑，繼續生產琥珀酸，使得單一菌株通過兩步分階段發酵生產不同代謝產物成為可能，降低了成本.目前關于運動發酵單胞菌動態調控系統的研究較少，已有成功應用的案列“四環素誘導型啟動子Ptet”.運動發酵單胞菌中首次將該誘導型啟動子應用于2，3-丁二醇的代謝調控，并隨后被應用于構建雙熒光報告基因及異丁醇代謝途徑的調控[112-113].此外，Landick等[114]在運動發酵單胞菌中利用lacIq基因與PT7Al-O34啟動子通過誘導性調控丙酮酸脫羧酶Pdc基因的轉錄表達，實現了運動發酵單胞菌碳代謝流的定向控制.因此，通過構建精準代謝調控，有利于更好地在時空序列上調控運動發酵單胞菌中靶向途徑的代謝通量，發揮底盤細胞工廠的優勢性能.

4"展望

總而言之，基于安全、環境適應性強、有益生元功能特性以及副產物低等優勢特點，運動發酵單胞菌不僅已在食品、醫藥及工業領域等取得了一系列相關成果.而相對于大腸桿菌、釀酒酵母等模式菌株，運動發酵單胞菌基因組小、代謝途徑單一及攜帶獨特的生物固氮能力，已開發出了一系列包括CRIPSR-Cas基因編輯系統在內的遺傳工具包及系統與生物合成學研究方法，積累了大量的轉錄組、蛋白組及代謝組等生理生化及系統生物學信息，有望開發成一個高效且安全的商業化底盤細胞工廠，尤其是生產乳酸、果聚糖等益生元的高效細胞工廠;還能結合其拮抗效應拓展運動發酵單胞菌在生態農業領域中的研究與應用.此外，我們對于運動發酵單胞菌生物固氮及益生拮抗效應機制還了解較少，在基因轉錄時空表達網絡與動態調控機制等基礎研究、高通量基因編輯與代謝精準調控以及智能發酵工藝與模塊化控制等方面將是今后重點研究方向.研究內容包括解析制約遺傳轉化效率的分子機制及解決方案與策略，結合系統生物信息學與人工智能學習等方法對多組學數據進行剖析，挖掘生物功能元件，優化包括雙報告基因系統在內的定量檢測體系，構建生物元件、邏輯路線及代謝通量組裝與性能檢測等模型，建立防泄漏生物安全體系等，為最終構建高效且安全的底盤細胞工廠的理性設計與應用提供指導與支撐.

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The Probiotic Antagonistic Effects of Zymomonas mobilis：

Current Advance and Perspectives

HE Mingxiong1，2，"ZHUANG Yong1，"CHEN Mao1，"LI Jianting1，"WU Bo1，

GONG Guiping1，"QIN Han1，"LIU Linpei1，"TAN Furong1

（1. Biomass Energy Technology Research Centre， Biogas Institute of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Chengdu 610041， Sichuan;

2. Key Laboratory of Development and Application of Rural Renewable Energy， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Chengdu 610041， Sichuan）

Zymomonas mobilis， as a food-safe strain generally regarded as safe （GRAS）， uniquely ferments glucose via Entner-Doudoroff （ED） pathway under anaerobic conditions. It possesses many unique physiological characteristics and excellent industrial production properties. Based on synthetic biology methods and metabolic engineering， this paper reviewed the unique physiological characteristics of Zymomonas mobilis and its applications in different fields such as food and medicine. It focused on the research progress and bottlenecks of probiotic effectors in Zymomonas mobilis， including their involvement in antagonistic effects and quorum sensing. Additionally， it also discussed the continuous development and improvement of high-efficiency and precise gene editing technologies， rational and irrational design methods for directional regulation of the metabolic pathway and high-throughput screening methods. These advancements aim to promote breakthroughs in the probiotic characteristics of Zymomonas mobilis， as well as in its application areas such as biomedicine and nitrogen fixation， thereby driving the development for theory research and practical production of the synthetic biology.

Zymomonas mobilis; probiotic effects; quorum sensing; chassis cells; synthetic biology"（編輯"周"俊）