褪黑素對干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發及幼苗生理特性的影響

摘要：為探究褪黑素預處理對紫花苜蓿（Medicago sativa L.）幼苗抗旱性的影響，本試驗以‘中苜一號’紫花苜蓿為材料，設置4個聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）濃度和5個褪黑素濃度進行發芽試驗，分別篩選出最佳的PEG和褪黑素濃度來處理紫花苜蓿幼苗，觀測處理前后紫花苜蓿幼苗的表型及生理指標。結果表明，50 μmol·L-1和100 μmol·L-1褪黑素預處理能有效提高10% PEG模擬干旱脅迫下紫花苜蓿種子的發芽率、幼苗鮮重及根長；50 μmol·L-1褪黑素預處理顯著提高了干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗的葉片含水量、可溶性糖含量和脯氨酸含量，另外，電解質滲透率和丙二醛含量均顯著降低，抗氧化酶合成相關基因的表達水平顯著上調，抗氧化酶活性增強。本研究驗證了適宜濃度的褪黑素處理能有效緩解干旱脅迫對紫花苜蓿幼苗造成的損傷，增強紫花苜蓿幼苗的抗旱性，為褪黑素在紫花苜蓿耐旱栽培中的合理使用提供了一定的參考。

關鍵詞：褪黑素；干旱脅迫；紫花苜蓿；生理響應

中圖分類號：S541.9""" 文獻標識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）08-2575-09

Effect of Melatonin on Seed Germination and Physiological

Characteristics of Alfalfa Seedlings under Drought Dress

HUANG Jie-qiong， ZHAI Jia-xing， WANG Ying， CEN Hui-fang*，

ZHU Hui-sen*， XU Tao， XIA Fang-shan

（College of Grassland Science， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China）

Abstract：To explore the impact of melatonin pretreatment on the drought resistance of alfalfa （Medicago sativa L.） seedlings，this experiment used ‘Zhonglu No.1’ alfalfa as the material，and set up 4 concentrations of polyethylene glycol and 5 concentrations of melatonin for germination experiments. Select the optimal concentrations of PEG and melatonin to treat alfalfa seedlings，and observe the phenotype and physiological indicators of alfalfa seedlings before and after treatment. The results showed that the seed germination rate，fresh weight and root length of seedlings were improved with 50 μmol·L-1 and 100 μmol·L-1 melatonin pretreatments under drought stress simulated by 10% PEG. Pretreatment with 50 μmol·L-1 melatonin significantly increased the leaf water content，soluble sugar content and proline content of alfalfa seedlings under drought stress. Additionally，the electrolyte leakage and malondialdehyde content were significantly decreased，and the expression levels of genes related to antioxidant enzyme synthesis were significantly upregulated，leading to enhanced antioxidant enzyme activity. In this study，we verified that melatonin pretreatment at appropriate concentrations could effectively alleviate the damage caused by drought stress on alfalfa seedlings and enhance the drought resistance of alfalfa seedlings，which might provide a certain reference for the rational use of melatonin in drought-tolerant cultivation of alfalfa.

Key words：Melatonin;Drought stress;Alfalfa;Physiological response

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）作為一種多年生豆科牧草，具有蛋白質含量高、適口性強、易于消化吸收等優點［1-2］，可以用作重要的蛋白質飼料，因此被廣泛種植于美國、歐洲以及亞洲等地區，對畜牧業發展具有非常重要的意義［3］。然而紫花苜蓿的生長發育往往會受到環境的影響，干旱、鹽堿、高溫及重金屬離子等非生物脅迫均會導致紫花苜蓿品質和產量的下降，這給苜蓿產業化發展帶來了巨大的阻礙［4-6］。在我國，紫花苜蓿的主要種植區集中于華北、西北等地，這些地區干旱少雨，水分成為影響紫花苜蓿生長發育的首要因素。當干旱脅迫達到一定閾值時，會顯著抑制作物種子萌發和幼苗生長，嚴重的情況下會導致作物大幅減產，甚至發生植株死亡的現象［7］。因此，提高紫花苜蓿的抗旱性，降低干旱脅迫對其生長發育的影響一直是促進紫花苜蓿種植業發展的一個重要研究方向，對實際生產有著舉足輕重的意義。

褪黑素（Melatonin，MT）又稱褪黑激素、松果體素等，是一種生命必需的小分子吲哚胺類物質，在植物中作用十分廣泛，它能夠調節植物的生長發育，提高植物抗逆性，維持細胞膜完整性，防止葉綠素降解，調節植物晝夜節律、光周期等［8］。據報道，褪黑素引發能夠顯著提高棉花（Gossypium hirsutum L.）種子在干旱條件下的發芽率，提高幼苗對干旱脅迫的抗性［9］；在NaCl脅迫下，外源褪黑素能夠增強老芒麥（Elymus sibiricus L.）的抗氧化酶活性，并清除體內過量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），抑制細胞膜質過氧化，以此提高老芒麥幼苗的耐鹽性［10］。褪黑素處理能夠上調高溫脅迫下多年生黑麥草（Lolium perenne L.）根系褪黑素合成基因表達，提高內源褪黑素含量，增強抗氧化酶活性，降低多年生黑麥草在高溫脅迫下受到的氧化損傷，同時提高滲透調節能力以增強多年生黑麥草的耐熱性［11］。鋁脅迫會使紫花苜蓿幼苗的根系受損傷而產生大量丙二醛（Malondialdehyde，MDA）和過氧化氫（H2O2），影響紫花苜蓿幼苗的正常生長，研究發現使用100～800 μmol·L-1褪黑素溶液處理能夠有效緩解鋁脅迫對紫花苜蓿幼苗造成的損傷，增強紫花苜蓿幼苗抵抗鋁脅迫的能力［12］。外源噴施0.2 mmol·L-1褪黑素能有效緩解干旱脅迫下煙草幼苗受到的脅迫損傷，能夠通過增強光合碳同化酶活性，調節葉片內源激素和碳水化合物的代謝，從而緩解干旱脅迫對植物造成的傷害，增強煙草幼苗的抗旱性［13］。另外，外源噴施50 μmol·L-1褪黑素能夠有效調節玉米幼苗地上部和地下部的抗氧化酶活性和滲透調節能力，同時提高玉米幼苗地上部和地下部的生物量和伸長量，減輕干旱脅迫對玉米根系構型的影響［14］。

近年來，已經有許多研究探索了提高紫花苜蓿抗旱性的各種途徑，但關于外源褪黑素對干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發及幼苗生理特性影響的報道較少。本研究以‘中苜一號’紫花苜蓿為材料，探索外源褪黑素預處理對干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發及幼苗抗氧化特性的影響，以期為后續褪黑素在紫花苜蓿耐旱栽培中的合理使用提供一定的參考，也為紫花苜蓿的抗旱育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選取‘中苜一號’紫花苜蓿為材料，種子由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所提供。

1.2 干旱脅迫下紫花苜蓿種子的萌發情況

選取大小相似、籽粒飽滿的紫花苜蓿種子，使用75%乙醇浸泡消毒1 min，蒸餾水沖洗3～5次，于濾紙上自然晾干。使用聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）溶液處理紫花苜蓿種子來模擬干旱脅迫，分別設置濃度為0，5%，10%，15% 的PEG-6000溶液，以雙層濾紙為發芽床進行發芽試驗，分別使用上述濃度的PEG溶液浸潤濾紙后鋪入一次性培養皿中，均勻地擺放50粒種子，每個處理設置3次重復，放置于光照培養箱中培養（恒溫20℃、16 h光照/8 h黑暗，光照強度12 000 Lux）。每天定時稱重補充水分，記錄10 d內種子的發芽情況。

1.3 褪黑素預處理對干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發的影響

選取大小相似、籽粒飽滿的紫花苜蓿種子，使用75%乙醇浸泡消毒1 min，蒸餾水沖洗3～5次，分別使用0，50，100，500，1000 μmol·L-1的褪黑素溶液低溫（4℃）浸泡12 h，蒸餾水沖洗3～5次，于濾紙上自然晾干。以雙層濾紙為發芽床進行發芽試驗，使用10%的PEG-6000溶液浸潤濾紙后鋪入一次性培養皿中，均勻擺放50粒種子，以蒸餾水浸潤濾紙作發芽床為對照CK，每個處理設置3次重復，放置于光照培養箱中培養（恒溫20℃、16 h光照/8 h黑暗，光照強度12 000 Lux）。每天定時稱重補充水分，保持PEG濃度相對穩定，記錄10 d內種子的發芽情況。

1.4 褪黑素處理對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗生長的影響

選取健康飽滿的紫花苜蓿種子種植于混合營養土（營養土∶沙∶蛭石= 2∶1∶1）中，于溫室中恒溫培養［（25±2）℃，16 h光照/8 h黑暗］至株高約20 cm。設置四個不同處理：葉面噴施0.4%乙醇后正常條件培養（WT）；葉面噴施0.4%乙醇后干旱培養（D）；葉面噴施50 μmol·L-1褪黑素（使用0.4%乙醇溶解）后正常條件培養（MT）；葉面噴施50 μmol·L-1褪黑素后干旱培養（MT+D）。每個處理設置5個重復。乙醇溶液及褪黑素溶液于每天18：00進行噴施，每組噴施量均為50 mL，使苜蓿葉片均勻掛珠，共處理3天，期間各組正常澆水，噴施結束后，CK和MT處理正常條件培養，D及MT+D處理停止澆水，培養至各組間出現較明顯差異。

1.5 指標測定

1.5.1 種子萌發相關指標的測定 以胚根大于種子長度1/2為發芽標準，直到第10 d發芽試驗結束，每個重復隨機取10株幼苗測量根長及鮮重并計算平均值。按照以下公式計算發芽勢、發芽率和發芽指數。

發芽勢=第4 d正常發芽種子數/供試種子數×100%；

發芽率=第10 d正常發芽種子數/供試種子數×100%；

發芽指數=∑（Gt/t），Gt為在第t日的發芽數，t為相應天數。

1.5.2 幼苗生理指標的測定 相對含水量（Relative water content，RWC）測定采用稱重法，取紫花苜蓿葉片稱取鮮重（Fresh weight，FW）、干重（Dry weight，DW）及飽和鮮重（Saturated fresh weight，SFW），相對含水量=（鮮重-干重）/（飽和鮮重-干重）［15］。

電解質滲透率（Electrolyte leakage，EL）測定采用電導儀法，取紫花苜蓿葉片約0.2 g，加入蒸餾水后搖床震蕩24 h測定初始電導率；130℃高溫處理20 min后搖床震蕩24 h測定終電導率［16］，電解質滲透率=初始電導率/終電導率×100%［16］。

可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法，取紫花苜蓿葉片約0.5 g制備勻漿，95℃水浴后室溫離心取上清為提取液，加入蒽酮乙酸乙酯溶液和濃硫酸在95℃下水浴10 min，冷卻至室溫后在620 nm波長下測定吸光值［16］。

脯氨酸含量測定采用茚三酮比色法，取紫花苜蓿葉片約0.5 g，用磺基水楊酸進行提取，與冰醋酸及酸性茚三酮反應后使用甲苯進行萃取，取上層紅色液體在520 nm波長下測定吸光值［16］。

MDA含量、H2O2含量、過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性及過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性均使用試劑盒（A003-1-2；A007-1-1；A084-3-1；A001-1-2；A007-1-1）進行測定，上述試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.5.3 干旱響應相關基因表達分析 干旱脅迫后，選取0.1 g各處理下紫花苜蓿幼苗相同部位的成熟葉片提取總RNA，所用通用型植物RNA提取試劑盒（ZH120）購自北京華越洋生物科技有限公司，利用Nanodrop2000檢測提取出的RNA的質量，反轉錄為cDNA后，以紫花苜蓿Actin為內參基因，進行實時熒光定量PCR檢測基因表達情況，所用反轉錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent kit with gDNA Eraser（Code No. RR047A）及熒光定量試劑盒Takara TB Green Premix Ex TaqTM II （Tli RNaseH Plus）（Code No. RR420A）均購自寶日醫生物技術有限公司（TAKARA），反應體系及程序參考試劑盒所附使用說明書。每個樣品設置3個重復，使用2-ΔΔCT方法計算各基因的相對表達量，所用到的引物序列見下表1。

1.6 數據分析

使用Microsoft Excel 2016軟件對數據進行整理和計算，使用SPSS 18.0進行數據統計分析，使用GraphPad Prism 9.5.1進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度PEG對紫花苜蓿種子萌發的影響

在使用不同濃度PEG-6000模擬的干旱脅迫下對紫花苜蓿種子進行發芽處理。如圖1所示，在10%和15%的PEG溶液處理下，紫花苜蓿種子的發芽率、發芽勢、發芽指數及幼苗鮮重、根長相較于對照組均顯著降低（Plt;0.05）；在5%的PEG溶液處理下，紫花苜蓿種子的發芽指數、幼苗鮮重和根長較對照組顯著降低（Plt;0.05），發芽率和發芽勢與對照組相比無明顯變化。其中，在10%的PEG溶液處理下，紫花苜蓿種子的發芽率為58.67%，相較對照組降低了41.33%，而15%的PEG溶液處理下，紫花苜蓿種子的發芽率僅為30%，因此選用該濃度作為后續紫花苜蓿種子發芽過程中模擬干旱脅迫的最適濃度。

2.2 外源褪黑素對干旱脅迫下紫花苜蓿種子萌發的影響

如圖2所示，不同濃度褪黑素預處理對PEG模擬干旱脅迫下紫花苜蓿種子的萌發存在不同程度的影響。在10%的PEG溶液處理下，紫花苜蓿種子的發芽率、發芽勢、幼苗鮮重和根長與對照組相比顯著降低（Plt;0.05），但經過不同濃度（50，100，500，1000 μmol·L-1）的褪黑素溶液預處理后，紫花苜蓿種子的發芽率、發芽勢、鮮重及根長均有顯著提升（Plt;0.05），其中，50 μmol·L-1褪黑素溶液預處理后紫花苜蓿種子在干旱脅迫下的發芽率、發芽勢及根長達到最高；100 μmol·L-1褪黑素溶液預處理后幼苗鮮重達到最高。因此，選用50 μmol·L-1作為后續干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗褪黑素預處理的最佳濃度。

2.3 外源褪黑素預處理對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗生長發育的影響

據報道，褪黑素能夠調節植物的生長發育，提高植物抗逆性，減輕植物在逆境脅迫下受損傷的程度。本研究發現在干旱脅迫處理前，外源噴施褪黑素對紫花苜蓿幼苗的生長無明顯影響，而在干旱脅迫10 d后，未經褪黑素預處理（D）的紫花苜蓿幼苗葉片明顯萎蔫、干枯，經過外源褪黑素預處理（MT+D）的紫花苜蓿幼苗植株萎蔫程度明顯較輕（圖3A）。測定干旱脅迫10 d后各組紫花苜蓿幼苗的葉片相對含水量，發現褪黑素預處理（MT+D）組植株葉片相對含水量為65.91%，顯著高于未經褪黑素處理（D）組植株的24.89%（Plt;0.05）；而正常培養條件下褪黑素預處理對紫花苜蓿幼苗的葉片含水量無顯著影響（圖3B）。

2.4 外源褪黑素預處理對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗膜透性的影響

干旱脅迫會導致植物細胞膜透性增加，造成電解質外滲。可溶性糖和脯氨酸作為滲透調節物質，有助于維持細胞的滲透平衡，緩解植物受到的損傷。本研究發現，干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗的電解質滲透率和脯氨酸含量較正常條件顯著增加。在干旱脅迫下，經過褪黑素預處理能夠顯著降低紫花苜蓿幼苗的電解質滲透率，MT+D組紫花苜蓿幼苗的電解質滲透率為13.97%，顯著低于D組的29.16%（Plt;0.05）（圖4A）；褪黑素預處理能夠顯著提高紫花苜蓿在干旱脅迫下的可溶性糖和脯氨酸含量，干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗的可溶性糖含量較正常條件顯著降低，而經過褪黑素預處理后紫花苜蓿幼苗的可溶性糖含量與正常條件差異不顯著（圖4B），干旱脅迫下經過褪黑素預處理的紫花苜蓿幼苗脯氨酸含量為309.07 μg·g-1 FW，顯著高于D組的253.33 μg·g-1 FW（Plt;0.05）（圖4C）。

2.5 外源褪黑素預處理對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗抗氧化特性的影響

干旱脅迫會引起植物體內活性氧的過量積累，導致細胞膜脂過氧化。通常植物會通過增加抗氧化酶的活性來清除過量的活性氧，以減輕細胞的氧化損傷，從而適應干旱環境。本研究發現，在干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗的丙二醛和過氧化氫含量較正常條件顯著增加（Plt;0.05）。干旱脅迫下，紫花苜蓿幼苗的丙二醛含量為5.58 μmol·g-1 FW，經過50 μmol·L-1褪黑素預處理后紫花苜蓿幼苗的丙二醛含量顯著降低，僅為3.53 μmol·g-1 FW（圖5A）。同樣，在干旱脅迫下，紫花苜蓿幼苗的H2O2含量為11.21 μmol·g-1 FW，經過褪黑素預處理后紫花苜蓿幼苗的H2O2含量顯著降低，僅為7.70 μmol·g-1 FW（Plt;0.05）（圖5B），說明褪黑素處理能顯著降低紫花苜蓿在干旱脅迫下的膜脂過氧化程度，減少活性氧的積累。在干旱脅迫下，紫花苜蓿幼苗的CAT，SOD，POD等抗氧化酶活性較正常條件顯著提高，但經過褪黑素預處理后的紫花苜蓿幼苗的CAT，SOD，POD酶活性均顯著高于未經褪黑素預處理的紫花苜蓿植株，分別提高了43.17%，13.45%和21.06%（Plt;0.05）（圖5C-5E）。

2.6 外源褪黑素預處理對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗干旱響應相關基因表達的影響

為進一步研究褪黑素對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗抗逆性的影響，采用實時熒光定量PCR分析不同處理下紫花苜蓿幼苗葉片中編碼抗氧化酶的基因及褪黑素生物合成相關基因的表達情況。研究發現，在干旱脅迫下，50 μmol·L-1褪黑素預處理能夠使紫花苜蓿中CAT，CuZn-SOD，APX基因表達水平與對照組相比，均顯著上調，分別上調了39.73%，38.16%和17.31%，褪黑素合成相關基因TDC基因表達量上調23.65%（Plt;0.05）（圖6）。

3 討論

水是植物生長發育的基礎，能夠為植物提供所需的養分、維持植物細胞的結構和功能、參與植物的新陳代謝、調節植物的溫度，對植物的生命活動至關重要。植物在生命活動過程中水分供應不足會嚴重影響種子的萌發及幼苗的生長發育，導致植株萎蔫甚至死亡［17］。大量研究表明，外源施加特定的植物激素或生長調節劑有助于緩解植物在逆境條件下受到的損傷，增強植物對各種非生物脅迫的耐受性。外源0.125 mmol·L-1水楊酸（Salicylic acid，SA）引發能夠有效促進干旱脅迫下甜高粱（Sorghum bicolor L.）種子的萌發［18］；使用赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（indole-3-acetic acid）及6-芐基氨基嘌呤（6-BA）引發處理能有效提高干旱脅迫下玉米（Zea mays L.）種子的發芽率［19］。20 μmol·L-1褪黑素處理有助于促進低溫脅迫下棉花種子萌發和胚根伸長，提高抗氧化酶活性，減少MDA和H2O2的積累，降低細胞膜脂過氧化程度，增強棉花對低溫環境的抵抗能力［20］。與這些研究一致，本研究中使用50 μmol·L-1褪黑素對紫花苜蓿種子進行預處理，有效促進了種子在干旱脅迫條件下的萌發以及幼苗的生長；另外，使用50 μmol·L-1褪黑素對2月齡紫花苜蓿幼苗進行噴施處理，發現經過褪黑素預處理的紫花苜蓿幼苗在干旱脅迫下的萎蔫程度明顯小于未經處理的幼苗，葉片含水量也有顯著的提升。在干旱脅迫下維持細胞膜的完整性和穩定性是植物抗旱性體現的重要組成部分，為了減緩細胞干旱條件下失水導致的細胞膜結構破壞，植物體內會產生大量滲透調節物質來維持細胞內外的滲透平衡［21］。本研究中，在干旱脅迫下，經過50 μmol·L-1褪黑素溶液預處理的紫花苜蓿幼苗體內累積大量可溶性糖和脯氨酸，顯著降低了葉片的電解質滲透率，表明外源施加褪黑素可以通過增加紫花苜蓿體內滲透調節物質的含量來維持細胞內外的滲透平衡，進而提高紫花苜蓿幼苗對干旱脅迫的耐受性。

植物抗氧化酶系統是植物體內的一種保護機制，用于清除持續的干旱脅迫在植物體內累積的活性氧分子，防止其對細胞和組織造成損傷。在環境脅迫下，植物可以通過調控基因表達來增加抗氧化酶的產量，增加抗氧化酶的合成和活性［22］。隨著干旱程度的增加，大豆（Glycine max L.）植株中POD，CAT活性呈先升后降的趨勢，復水后又逐步下降至對照組水平［23］。對甜高粱幼苗的研究表明，褪黑素可顯著降低干旱脅迫下甜高粱葉片MDA含量，積累更多滲透調節物質，提高葉片含水量，顯著提高葉片POD和硝酸還原酶活性，通過增強植物的抗氧化酶活性，從而提高了其對干旱脅迫的抵抗力［24］。本研究中，在干旱脅迫下，使用50 μmol·L-1褪黑素預處理后，紫花苜蓿幼苗葉片中MDA含量顯著下降，H2O2積累量減少，抗氧化酶（CAT，POD及SOD）的活性較對照顯著提高。此外，實時熒光定量PCR分析結果顯示，干旱脅迫下，外源褪黑素能夠誘導紫花苜蓿中編碼抗氧化酶合成的基因CAT，CuZn-SOD，APX及褪黑素合成關鍵基因TDC的上調表達，表明褪黑素能夠通過提高干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗編碼抗氧化酶生物合成基因的表達，增強抗氧化酶活性，提高紫花苜蓿幼苗的抗旱性。本研究篩選出了外源噴施較為適宜的褪黑素濃度，能夠為提高紫花苜蓿抗旱性提供一定的參考依據，為后續深入研究褪黑素在紫花苜蓿培育中的應用奠定基礎。

4 結論

在PEG模擬的干旱脅迫下，‘中苜一號’紫花苜蓿種子發芽率、發芽勢、發芽指數和鮮重隨著PEG濃度的升高而降低，使用不同濃度（50，100，500，1000 μmol·L-1）褪黑素溶液對紫花苜蓿種子進行浸種處理均能緩解干旱脅迫對紫花苜蓿種子萌發的影響，其中褪黑素溶液濃度為50 μmol·L-1時效果最佳。葉面噴施50 μmol·L-1褪黑素能夠通過增加植物體內滲透調節物質的含量維持滲透平衡，并通過調控紫花苜蓿幼苗抗氧化酶生物合成基因表達水平，增強抗氧化酶活性，進而提高紫花苜蓿幼苗對干旱脅迫的耐受性。本研究為褪黑素在紫花苜蓿耐旱栽培中的合理運用提供理論依據。

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（責任編輯 閔芝智）