高效液相色譜測定維生素C方法的研究進展

朱佳，孫杰

（南京市產品質量監(jiān)督檢驗院，江蘇 南京 210028）

VC又稱作抗壞血酸，是維持機體正常生活活動所需要的一類小分子有機化合物，主要存在于新鮮蔬菜和水果及以其為原料的食品中。VC可促進膠原蛋白抗體，具有抗癌的作用；它能參與神經介質、激素的生物合成；能將膽固醇轉化為膽汁酸，使高膽固醇血癥患者的膽固醇下降；能將Fe3+還原為Fe2+，使其易于吸收，有利于血紅蛋白的形成。但人體自身不能合成VC，必須由食物中攝取。我國食品營養(yǎng)強化劑使用衛(wèi)生標準（GB 14880－1994）中，VC允許在水果、罐頭、果泥、飲料、硬糖、嬰幼兒食品等適量添加，各種強化和天然食品中的VC含量是食品檢測中的常規(guī)項目。因此，研究和掌握VC的性質，準確測定VC的含量,對飲食健康、醫(yī)療保健都具有十分重要的意義。

現有的VC的檢測方法有很多，一般如光度分析法、化學發(fā)光法、電化學分析法等，如國家標準中，GB/T 9695.29－1991《肉制品 維生素C含量測定》、GB/T 5413.18-1997《嬰幼兒配方食品和乳粉維生素C的測定》、SN/T 0869-2000《進出口飲料中維生素C的測定方法》，均采用熒光光度測定法；GB 7303－2006《飼料添加劑維生素C》和GB 14754－1993《食品添加劑維生素C》則采用碘量法，而GB/T 6195-1986《水果、蔬菜維生素C含量測定法》采用2，6－二氯靛酚滴定法。由于VC具有較強的還原性，在中性和堿性條件下不穩(wěn)定，遇熱容易破壞，上述方法一般具有試劑不穩(wěn)定，或操作步驟復雜、費時等缺點，在樣品處理過程中很容易使VC損失，因此在使用中有較大的局限性。

近幾年，維生素的檢測技術已經得到重大的發(fā)展，特別是現代分析儀器與電腦技術的高度結合。高效液相色譜法HPLC是目前最常用的分析手段，能進行快速、靈敏、準確測定，并可與其他分析技術聯用，需要的樣品量小，而且可配置不同的檢測器。近年來，用高效液相色譜測定VC含量已經有不少報道，但是實驗的色譜條件有很大差異（見表1）。本文對近年來有關VC的測定方法進行了比較，對色譜柱、浸提劑、流動相、流動相pH、流速、柱溫、檢測器等色譜測定條件進行討論，探索更確切的測定方法。

1 色譜測定條件

1.1 色譜柱的選擇

反相色譜柱具有非常廣泛的應用和較長的使用壽命，近年來有關液相色譜測定VC的方法多數采用反相色譜柱。C18和C8都適用于水溶性和脂溶性維生素的測定。離子交換色譜也可以用于維生素的測定，但與反相色譜相比，壽命較短。陳忠明的文獻中指出，離子交換色譜柱易于不可逆地吸附某些樣品浸出液中的雜質，導致柱性下降且難以再生[1]。

表1 部分HPLC方法測定VC的條件Table 1 Determination of Vitamin C by high performance liquid chromatography

1.2 浸提劑的選擇

VC易溶于水，對熱、堿性、氧、光都很敏感，但在干燥或酸性條件下卻較穩(wěn)定，所以宜用酸性水溶液作為浸提劑[1]。偏磷酸是VC的最佳穩(wěn)定劑，且具有沉淀蛋白質的作用[2]。但其價格較貴，在室溫下放置易轉化成正磷酸，降低對VC的穩(wěn)定性。草酸廉價易得，有與磷酸相近的穩(wěn)定性。但草酸對高蛋白質樣品，可能有過濾困難。根據樣品類型和色譜條件，也有用檸檬酸，醋酸等，對于飲料也有用蒸餾水直接稀釋的。

1.3 流動相的選擇

反相色譜的流動相通常以水作基礎溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調整劑，如甲醇、乙腈等。極性調整劑的性質及其所占比例對溶質的保留值和分離選擇性有顯著影響。通常多用緩沖鹽體系作為測定水溶性維生素的流動相。VC的出峰時間隨流動相中極性調整劑含量的降低而保留時間逐漸延遲。對于基體復雜的樣品而言，保留時間的推遲有利于組分的分離。雍莉文獻報道采用甲醇-或乙腈-KH2PO4作流動相測定飲料中VC，VC的保留時間短，對于組分較復雜的保健食品和果蔬樣品，VC的色譜峰往往不易與雜質峰分離而干擾測定[3]。

由于VC極性強，出峰早，易受早洗脫的雜質干擾，因此多在流動相中加入銨鹽作為離子對試劑以增進保留。王愛月的實驗結果表明，流動相中加入辛烷磺酸鈉，能夠抑制VC的離子化，改善峰形[4]。

也有試驗報道，用醋酸、草酸的稀釋液作為流動相，分離效果也比較好。胡志雄報道，采用2%醋酸溶液（pH 2.5）作流動相，對抗壞血酸進行反相色譜評價，結果表明抗壞血酸有較適當的色譜保留時間和很高的柱效，峰形對稱無拖尾[5]。王艷穎報道，用0.1%的草酸作為流動相測定VC，相關系數為0.9993，線性關系較好，回收率達到97.4%～102.1%[6]。

1.4 流動相pH的確定

控制流動相的pH可以調節(jié)流動相的電離，使其在色譜柱上有一定的保留，達到調節(jié)保留時間、控制分離度的目的。李連朝等報道，當流動相pH在2.0～3.0之間，VC峰的K較為理想，但為了使色譜柱有較長的壽命，故不選pH為2.0，因為當pH接近2.0時鍵合成反相固定相的硅膠和烷基化合物之間形成的化學鍵被酸解；另一方面，隨著pH的增大，VC在流動相中的穩(wěn)定性降低，而且VC峰的拖尾現象也愈來愈明顯[7]。

1.5 流速和柱溫選擇

流速過低，分析時間長，流速過高，泵壓升高影響儀器壽命。通常流速選擇為1 mL/min。

雍麗等報道，改變柱溫從10℃～40℃，結果表明VC的保留時間隨溫度增高而降低，柱溫在20℃～30℃范圍內VC的色譜峰面積最大[3]。

1.6 檢測器的選擇

對VC的檢測可以使用紫外可變波長檢測器、二極管陣列檢測器或電化學檢測器。紫外檢測器花費低，但只能通過保留時間確定，定性效果不好。二極管陣列檢測器，結合色譜的保留時間和光譜圖可以很好的對樣品進行定性分析，分析峰純度。電化學檢測器靈敏度高。

2 與國家標準的比較

與國家標準方法中VC的熒光光度測定法相比較，邵麗華的研究結果表明，其研究建立的HPLC法與國家標準的熒光法相對比，并經統(tǒng)計學分析，差異無顯著性，說明液相色譜的測定結果與國家標準方法一致[8]。

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[2]鮑士旦.土壤農化分析[M].北京:中國農業(yè)出版社,1980:359-364

[3]雍莉,黎源倩,李敏,等.高效液相色譜法快速測定保健食品和果蔬中的VitC[J].現代預防醫(yī)學,2005,32(3):247-248

[4]王愛月,張向兵,李發(fā)生.高效液相色譜法測定食品及保健品中維生素C含量的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2006,16(10):1175-1176

[5]胡志雄,張維農.HPLC-DAD測定果汁飲料中抗壞血酸總含量[J].武漢工業(yè)學院學報,2005,24(3):11-14

[6]王艷穎，姜國斌，胡文忠.高效液相色譜法測定草莓中維生素C含量[J].大連大學學報,2006,27(2):21-22

[7]李連朝,康靖全,楊德祥,等.用反相高效液相測定食物、藥物和生理液中的維生素C[J].色譜,1986,4(6):334-338

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[9]李小娟,楊潤.反相高效液相色譜法測定保健食品中維生素C[J].江蘇預防醫(yī)學，2004,15(1):63-64

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[11]丁健樺.HPLC法初步研究維生素C的穩(wěn)定性含量[J].食品工業(yè),2004(1):44-45

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