西瓜炭疽病的苗期抗性鑒定

摘" " 要：西瓜炭疽病對產業穩定發展構成嚴重威脅，是西瓜種植中急待解決的關鍵病害。為了鑒定西瓜炭疽病病原菌Colletotrichum orbiculare對不同西瓜種質資源的抗性，通過分離純化自江蘇鹽城的西瓜病瓜中的病原菌，利用多種培養基進行產孢培養，篩選出最優產孢培養基為燕麥培養基。通過點滴法和噴霧法接種不同濃度的孢子懸浮液，確定了噴霧法及1×105個·mL-1為最佳的接種方法和濃度。最后，對18份不同來源的西瓜種質資源進行苗期接種鑒定，篩選出高抗資源1份，抗病資源5份。研究結果在西瓜抗病育種中具有潛在的應用價值。

關鍵詞：西瓜；炭疽病；抗性；苗期

中圖分類號：S651 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）12-054-06

收稿日期：2024-04-19；修回日期：2024-08-27

基金項目：國家自然科學基金聯合項目（U21A20229）；中國農業科學院科技創新工程（CAAS-ASTIP-2022-ZFRI-09）

作者簡介：劉楓楠，男，在讀碩士研究生，研究方向為葫蘆科作物抗病遺傳。E-mail：82101225373@caas.cn

通信作者：康保珊，女，副研究員，研究方向為葫蘆科作物抗病遺傳。E-mail：kangbaoshan@caas.cn

Evaluation of watermelon for resistance to anthracnose at seedling stage

LIU Fengnan1， 2， SUN Chaoyi1， 3， GUO Zhen1， 4， LIU Liming1， WU Huijie1， GU Qinsheng1， KANG Baoshan1， 2

（1. Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences/Henan Key Laboratory of Fruit and Cucurbit Biology， Zhengzhou 450009， Henan， China; 2. Zhongyuan Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Xinxiang 453500， Henan， China; 3. College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， Jiangsu， China; 4. College of Bioengineering and Biotechnology， Tianshui Normal University， Tianshui 741001， Gansu， China）

Abstract： Watermelon anthracnose poses a critical challenge to the stable development of the watermelon industry， and is a key disease that urgently needs to be addressed. The aims of this study is to identify the resistance of different watermelon varieties to the watermelon anthracnose pathogen， Colletotrichum orbiculare. By isolating and purifying the pathogen from diseased watermelon fruits in Yancheng， Jiangsu， and using various culture media for sporulation， the optimal sporulation medium was determined to be oat medium. Through inoculation with different concentrations of spore suspensions using both the drop method and spray method， the spray method with a concentration of 1×105 spores·mL-1 was determined as the best inoculation method and concentration. Finally， 18 watermelon germplasm resources from different sources were inoculated at the seedling stage， and 1 highly resistant resource and 5 resistant resources were screened out. The research results have potential application value in watermelon disease-resistant breeding.

Key words： Watermelon; Anthracnose; Resistance; Seedling stage

炭疽病，作為西瓜生產中的重要真菌性病害，其病原主要歸屬于半知菌亞門刺盤孢屬真菌。炭疽病的侵襲范圍廣泛，能夠侵染西瓜的所有地上部分，包括至關重要的果實，一旦發生，不僅會在西瓜植株的葉片和莖蔓上形成黑褐色病斑，果實表面出現輪紋病斑，而且隨著病斑的不斷擴大，最終可能引發植株的干枯死亡或果實腐爛，從而嚴重影響西瓜的產量和品質[1]。此外，在西瓜的貯運過程中，炭疽病病菌使果實變得更為脆弱，易于腐敗，進而引發大批果實腐爛變質，失去其食用價值[2]。

目前，在西瓜的實際生產過程中，對炭疽病的防治仍主要依賴于化學藥劑。然而，長期使用化學藥劑不僅可能導致病原菌產生抗藥性，而且容易引發農殘含量超標的問題，且這些問題正日益凸顯。因此，為了從根本上解決炭疽病的威脅，選育具有抗性的西瓜品種顯得尤為重要。通過深入研究西瓜的抗病種質資源，可以為培育高效、安全的抗性品種奠定堅實基礎，從而為西瓜產業的可持續發展提供有力保障。

美國在19世紀末便著手西瓜抗炭疽病的育種研究，至20世紀50年代初便成功選育出Charleston Gray和Fairfax等既抗炭疽病又抗枯萎病的西瓜品種，以及僅抗炭疽病的Congo品種，這些品種迅速得到推廣與應用。20世紀80年代，美國又相繼培育出具有炭疽病抗性的西瓜多抗品種，如Au-Producer、Au-Jubilant和Icebox等[3]，為西瓜產業的健康發展做出了重要貢獻。

我國自1986年西瓜抗病育種協作小組成立以來，也積極投身于抗病品種的選育工作。經過不懈努力，先后育成了京抗2號、京抗3號、抗病948等優質抗性品種[4]，有效緩解了炭疽病對我國西瓜產業的威脅。然而，炭疽病病原菌種類繁多且易于變異，突破了一些西瓜品種的抗性，進而在生產中造成嚴重危害。因此，為了應對這一挑戰，必須不斷加強品種及種質資源的抗性鑒定工作，以豐富抗源，為培育出更多抗病新品種奠定堅實基礎。這不僅是確保西瓜產業持續健康發展的必然要求，也是維護我國農業生態安全的重要舉措。

關于西瓜炭疽病的抗性鑒定，多數研究主要依賴于苗期噴霧接種法[5-8]。此外，還有滴液法、菌餅打孔法、葉片涂刷接種法以及離體接種法等多種方法[9]。崔召明等[6]及羅婷[8]在鑒定西瓜炭疽病抗性時，均采用了濃度為1×106個·mL-1的孢子液，且均在西瓜苗達到2片真葉時進行接種，抗性調查則在接種后的7～10 d內進行。孫玉燕等[10]則運用點滴法，對西瓜離體葉片進行炭疽病抗性鑒定，接種時孢子液濃度為1×106個·mL-1，且選用4片真葉期的離體葉片，接種后5 d進行抗性評價。Sowell等[11]將孢子液濃度設定為2×104個·mL-1，接種后7 d進行抗性評估。Bhatta等[5]選擇接種濃度為1×105個·mL-1的孢子液，同樣在接種后7 d進行抗性評價。而Boyhan等[12]則使用濃度為5×104個·mL-1的孢子液接種西瓜幼苗，在接種15 d后進行抗性評價。

然而，由于前人研究中采用的接種方法不同，因此鑒定結果存在差異，進而影響了抗性資源的有效交流和利用。因此，筆者致力于通過比較不同苗期接種方法和孢子液濃度，探索出最適合西瓜苗期炭疽病抗性鑒定的接種方法，同時調查不同西瓜種質的抗性表現，旨在為西瓜炭疽病抗性品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

西瓜炭疽病病原菌：Colletotrichum orbiculare分離純化自2020年采集的江蘇鹽城西瓜病瓜，保存于中國農業科學院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控課題組。

供試西瓜種質資源：PI 244019、PI 482322、PI 482261、PI 500303、PI 482312、PI 595200、PI 386018、PI 542117、PI 357709、Sugarlee為野生種，由中國農業科學院鄭州果樹研究所西甜瓜種質資源中期庫提供；Z21-05、Z21-06、Z21-07、Z21-09、090為雜交種，由中國農業科學院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控課題組提供；金城五號、西農八號、早佳、華欣為F1代雜交種，購置于安徽荃銀高科瓜菜種子有限公司；紅和平為感病對照品種，購置于浙江浙農種業有限公司。試驗過程中使用90 mm一次性營養缽進行栽培。

1.2 方法

試驗于2022年8月在中國農業科學院鄭州果樹研究所綜合實驗室進行。

1.2.1" " 培養基" " 配制9種不同的培養基，其中參照羅婷[8]的方法配制PDA培養基、胡蘿卜培養基、菜豆培養基、西瓜皮培養基、西瓜汁培養基；參照唐爽爽[13]的方法配置西瓜莖葉煎汁培養基、番茄燕麥片培養基、燕麥片瓊脂培養基；燕麥培養基購置于索萊寶公司。

各培養基高溫滅菌后分裝倒入平板備用。接種15 d后觀察分生孢子的生長情況。

1.2.2" " 接種孢子懸浮液的制備" " 挑取保存在4 ℃ PDA斜面培養基上的瓜類刺盤孢菌至PDA平板上于27 ℃培養，待菌絲長出后，從菌絲邊緣用打孔器切取直徑0.5 cm的菌塊置于產孢培養基上，然后放置于27 ℃培養箱中黑暗培養，待產生分生孢子后，用無菌水清洗分生孢子，并經滅菌擦鏡紙過濾，用血球計數板鏡檢計數，分別制成濃度為1×106 、1×105、1×104個·mL-1的分生孢子懸浮液。

1.2.3" " 接種方法" " （1）點滴法：西瓜幼苗生長到3～4片真葉期時，使用移液槍分別將10 μL不同濃度的孢子懸浮液滴在西瓜真葉上，每片葉對稱接種4～6個點，每株接種2片真葉，每個濃度處理5株。接種后將西瓜植株放置于培養箱中黑暗培養24 h，溫度27 ℃，濕度100%，然后在培養箱中正常生長管理，培養條件為：25～27 ℃，黑暗10 h/光照14 h，濕度100%，接種后7～10 d測量每個接種點病斑的最大長度和最大寬度，記作縱徑和橫徑。病斑直徑為所有接種點病斑橫徑和縱徑的平均值，計算病情指數。

（2）噴霧法：西瓜幼苗生長到3～4片真葉期時，采用噴霧接種法將炭疽病孢子懸浮液均勻噴灑到西瓜真葉上，放置于培養室中黑暗培養24 h，溫度27 ℃，濕度100%；然后在培養室中正常生長管理，培養條件為：25～27 ℃，黑暗10 h/光照14 h，濕度100%，7～10 d后調查植株的病情指數。每個濃度處理5株，設3個重復。

1.2.4" " 不同西瓜種質資源的苗期人工接種鑒定試驗" " 根據1.2.3結果中篩選出的最優接種方法對供試的18份西瓜種質資源以完全隨機的試驗方法，進行苗期人工接種鑒定，每份種質接種15～20株，重復3次，10 d后調查植株病情指數。

1.2.5" " 病情指數與抗性評價" " 采用點滴法接種的植株，病情分級標準在孫玉燕等[10]的方法上稍作調整，具體如下：根據病斑直徑將植株抗性劃分為6個級別（圖1），0級：病斑直徑=0 mm；1級：病斑直徑≤0.50 mm；3級：0.50 mm＜病斑直徑≤1.50 mm；5級：1.50 mm＜病斑直徑≤2.00 mm；7級：2.00 mm＜病斑直徑≤3.00 mm；9級：病斑直徑 ＞3.00 mm。采用鋼質尺測量病斑直徑。每個葉片的病情級別為所有接種點病情級別的平均數。

病情指數（DI）計算公式： DI=Σ（各病情級別代表數值×各病情級別的葉片數）/（調查總葉片數×最高病情級別的代表數值）×100。

抗性分級標準為：DI=0，免疫；0＜DI≤10，高抗；10＜DI≤35，抗病；35＜DI≤55，中抗；55＜DI≤75，感病；DI＞75，高感。

發病率/%=發病點/總接種點×100。

采用噴霧法接種的植株，病情分級及抗性評價標準參考農業行業標準《黃瓜棒孢葉斑病、蔓枯病、炭疽病抗病性鑒定技術規程》[14]的方法進行，具體如下：以幼苗葉片出現病斑為感病指標，調查每個單株葉片病情級別，按照以下標準進行分級，0級：無病斑；1級：病斑面積小于5%；3級：病斑面積≥5%～10%；5級：病斑面積＞10%～25%；7級：病斑面積＞25%～50%；9級：病斑面積＞50%。

病情指數（DI）計算公式和抗性分級標準同點滴法。發病率/%=發病株數/總接種株數×100。

1.3 數據分析

采用 SPSS 16.0 軟件進行統計分析，應用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 產孢培養基的篩選

C. orbiculare菌在PDA培養基上不能產生分生孢子，為獲得足夠多的孢子接種液，筆者在本試驗中設置了9種不同的培養基，以期篩選出具有產孢能力的培養基。病原菌在培養基上生長20 d后，觀察菌絲生長及產孢情況，結果表明，菌絲在9種培養基上均可正常生長，狀態均勻致密，在燕麥培養基、西瓜莖葉煎汁培養基和西瓜汁培養基上產生橘紅色分生孢子團，在其余培養基上均不能產生，其中燕麥培養基產生的孢子量遠大于其余兩種培養基（圖2），刮取少量孢子鏡檢觀察，發現分生孢子呈現出C. orbiculare菌的典型特征，即無色，圓柱形或棒狀，一端圓形另一端較鈍，表明燕麥培養基可以作為 C. orbiculare的產孢培養基。

2.2 最適接種孢子液濃度篩選

采用噴霧法接種感病西瓜品種紅和平，7 d后接種濃度為1×104個·mL-1的植株發病率不足50%，表明此濃度不是有效接種濃度；而孢子濃度為1×106和1×105個·mL-1的植株發病率均達到100%，且接種葉片的病情指數差異不大，但孢子濃度越高，植株的莖蔓及葉柄發病越快，濃度為1×106個·mL-1時，莖蔓和葉柄在5 d時即溢縮腐爛（圖3），最后導致葉片干枯，植株萎蔫，無法準確評估葉片的病情指數；而濃度為1×105個·mL-1時，莖蔓及葉柄的病情發展相對較慢，葉片的病情指數不受莖蔓和葉柄病情的影響，可真實地反映植株抗性水平，因此采用噴霧法接種西瓜炭疽病病菌的最適孢子濃度為1×105個·mL-1。

采用點滴法接種時，3個濃度中只有1×106個·mL-1濃度的孢子液可以產生病斑，1×105個·mL-1和1×104個·mL-1濃度幾乎不產生病斑，因此點滴法中接種的最適孢子濃度為1×106個·mL-1。

2.3 最適接種方法

植株生長到3～4片真葉時，在噴霧法接種中，金城五號和090兩個品種發病率都為100%，抗性表現分別為感病（S）和高感（HS），而在點滴法接種中，兩個品種的發病率均未達到100%，其中金城五號的發病率為83.33%，表現為感病，而090的發病率為62.50%，表現為中抗（MR）（表1）。在兩種接種方法中，090的病情指數具有顯著差異。采用點滴法接種時，同一葉片每個接種點的病情等級差異較大，發病率不穩定，可能導致抗性評價結果與實際抗性產生較大偏差。在抗病品種選育過程中，要避免接種方法對抗性結果的影響，噴霧法的發病率更加穩定，因此后續選擇噴霧法進行接種。

2.4 不同西瓜品種資源的苗期鑒定試驗

根據上述試驗結果，在接種孢子濃度為1×105個·mL-1條件下，采用噴施法對供試的18份西瓜資源進行苗期接種鑒定。結果表明，接種后5 d感病對照品種紅和平葉片開始出現病斑，7 d時病情達到感病級別，10 d時病情指數為63.70，與7 d時的抗性水平一致。供試資源中大部分資源在接種7 d后病情發展變緩，但個別品種如西農八號在7 d時病情指數僅為35.00，但到第10天時病情指數達到70.79（圖4）。為保證所有資源的病情能充分發展，筆者選擇在接種后10 d調查植株的發病情況，結果如表2所示，不同資源對西瓜炭疽病病菌C. orbiculare的抗性不同。18份供試材料中，未發現對炭疽病免疫的資源，其中PI 244019表現高抗，PI 482261、PI 386018、PI 500303、PI 482312和華欣表現抗病，Sugarlee、PI 482322、PI 595200、 Z21-05、Z21-06和Z21-07表現中抗，西農八號、PI 542117、PI 357709和Z21-09表現感病，早佳表現高感。從表2數據中可以發現，栽培品種的表現比較多樣，既有抗病的華欣、Z21-06，中抗的Z21-05、Z21-07和Sugarlee，也有感病的早佳、西農八號、Z21-09。PI 244019、PI 482322、PI 482261、PI 500303、PI 482312、PI 595200、PI 386018、PI 542117、PI 357709、Sugarlee均為野生種，抗病表現比較穩定，除了PI 542117和PI 357709表現為感病外，其余資源均表現為中抗或抗病。

3 討論與結論

西瓜炭疽病的抗性鑒定主要采用室內離體或苗期鑒定法。其中，苗期鑒定法因能排除外部干擾、縮短周期且能精確控制條件，直觀展現品系間的抗性差異而備受青睞[15]。噴霧法因其高效、穩定而被研究者廣泛采用[7，16-17]。

孢子濃度、菌株致病力等因素可能影響鑒定結果。孢子液濃度的選擇存在差異，羅婷[8]發現106個·mL-1為最適濃度，而Shim等[18]則篩選出4×105個·mL-1為最佳濃度。筆者在本研究中發現，孢子濃度105個·mL-1能有效侵染西瓜葉片，展示不同資源間抗病性差異。但濃度升至106個·mL-1時，莖蔓和葉柄受害嚴重，難以區分抗性差異。因此，筆者選擇105個·mL-1為最適接種濃度。接種操作時要避免孢子直接噴于莖蔓和葉柄上，以提高鑒定準確性[19]。

不同研究中接種孢子液濃度的最佳取值差異，可能與病原菌致病力不同有關。在本試驗中，西農八號西瓜對炭疽病感病，但羅婷[8]的研究結果表明，西農八號高度抗病，這種差異可能是由不同病原菌的致病性差異造成的[9]。不同炭疽病菌致病力差異顯著，C. nymphaeae對葉片侵染弱但對果實侵染強，而C. magnum在無傷條件下對果實侵染力減弱[20]。

筆者在本試驗所篩選出的接種條件，主要是針對C. orbiculare這一復合種。該復合種在我國是引起西瓜炭疽病的優勢種[21]，能夠侵染西瓜的整個地上部分，且在西瓜的整個生育期內均具有侵染能力。然而，鑒于西瓜炭疽病病原菌的種類復雜多樣，在實際應用中，仍需要根據所使用的具體菌株，對接種條件進行適當優化，以確保獲得可靠且準確的試驗結果。

綜上所述，筆者通過篩選產孢培養基、接種孢子懸浮液濃度及接種方法，建立了針對西瓜炭疽病病原菌Colletotrichum orbiculare的苗期人工接種鑒定體系。噴霧法接種孢子濃度為1×105個·mL-1時效果最佳，能準確評估西瓜資源的抗病性，在18份供試材料中，鑒定出高抗、抗病、中抗、感病及高感品種。研究結果為西瓜抗病育種奠定了基礎。

參考文獻

[1] 李明桃．西瓜炭疽病的發生規律及其防治技術探討[J]．園藝與種苗，2013（9）：29-30．

[2] 陳廣仕．西瓜病蟲害防治技術[J]．中國農業信息，2016（19）：104．

[3] CRALL J M，ELMSTROM G W．Florida \"icebox\" cultivars as a factor in watermelon production in Florida and other producing states[J]．Proceedings，Soil and Crop Science Society of Florida，1986，45：132-134．

[4] 周鳳珍．抗枯萎病、炭疽病西瓜新品種京抗2號和京抗3號的選育[J]．中國西瓜甜瓜，1993（4）：4-8．

[5] BHATTA B P，CORREA E，PATEL T，et al．Data on inheritance of race 2 anthracnose resistance in watermelon （Citrullus spp．） biparental mapping populations[J]．Data in Brief，2022，44：108546．

[6] 崔召明，陳泉生．西瓜炭疽病苗期不同抗性鑒定方法的研究[J]．安徽農學通報，2009，15（15）：135-136．

[7] 劉莉，王鳴．西瓜種質資源苗期對炭疽病抗性的研究[J]．中國西瓜甜瓜，1990（1）：9-13．

[8] 羅婷．西瓜苗期炭疽病抗性鑒定方法及其抗病機理研究[D]．陜西楊凌：西北農林科技大學，2008．

[9] 郜森，王恩煜，楊小振，等．西瓜炭疽病及抗性育種研究進展[J]．中國瓜菜，2021，34（5）：1-7．

[10] 孫玉燕，范敏，何艷軍．西瓜炭疽病菌離體葉片接種鑒定技術[J]．浙江農業科學，2019，60（8）：1460-1462．

[11] SOWELL G J R，RHODES B B，NORTON J D．New sources of resistance to watermelon anthracnose[J]．Journal of the American Society for Horticultural Science，1980，105（2）：197-199．

[12] BOYHAN G E，NORTON J D，ABRAHAMS B R，et al．A new source of resistance to anthracnose （Race 2） in watermelon[J]．HortScience，1994，29（2），111-112．

[13] 唐爽爽，劉志恒，余朝閣，等．遼寧省西瓜炭疽病病原菌鑒定及生物學特性研究[J]．植物保護，2014，40（4）：38-44．

[14] 中華人民共和國農業農村部．黃瓜棒孢葉斑病、蔓枯病、炭疽病抗病性鑒定技術規程：NY/T 3864-2021[S]．北京：中國農業出版社，2021．

[15] 唐寧安．西瓜抗炭疽病基因的分子標記研究[D]．浙江金華：浙江師范大學，2013．

[16] 金巖．西瓜細菌性果斑病研究[D]．長春：吉林農業大學，2003．

[17] ZIVANOVIC M，WALCOTT R R．Further characterization of genetically distinct groups of Acidovorax citrulli strains[J]．Phytopathology，2017，107（1）：29-35．

[18] SHIM S A，JANG K S，CHOI Y H，et al．Resistance degree of cucurbits cultivars to Colletotrichum orbiculare[J]．Korean Journal of Horticultural Science and Technology，2013，31（3）：371-379．

[19] CORREA E，CROSBY K，MALLA S．Optimizing a seedling screening method for anthracnose resistance in watermelon[J]．Plant Health Progress，2021，22（4）：536-543．

[20] 郭珍．西瓜炭疽病病原菌種類多樣性及Colletotrichum magnum致病相關基因分析[D]．武漢：華中農業大學，2023．

[21] GUO Z，LUO C X，WU H J，et al．Colletotrichum species associated with anthracnose disease of watermelon （Citrullus lanatus） in China[J]．Journal of Fungi，2022，8（8）：790．