寒邪對大鼠腰椎間盤突出癥機體影響的實驗研究

摘要：目的" 探討寒邪在大鼠腰椎間盤突出癥模型中的影響。方法" 將30只SD級大鼠按照隨機數字表法隨機分為實驗組、對照組和空白組，各10例。實驗組和對照組通過自體髓核移植至L4、L5神經根建立大鼠腰椎間盤突出癥模型，空白組不做處理，實驗組和空白組連續7 d每天12∶00-16∶00將大鼠置于溫度為（4±0.5）℃、濕度為50%±2%的人工氣候箱中飼養4 h，其余時間按常規室溫飼養。對照組放置于（25±0.5）℃、濕度為50%±2%的常溫中標準化飼養1周。觀察三組大鼠生存質量、髓核中PLA2含量、血清炎癥因子TNF-α、IL-6含量變化、椎間盤病理切片情況。結果" 造模完成后，三組大鼠全部存活，無死亡、癱瘓、感染案例，但于實驗第3天，三組大鼠均有明顯癥狀，神經功能評分均在3級以上。實驗第7、14天，實驗組神經功能評分均高于對照組和空白組（P＜0.05）；實驗組實驗第14天與第7天神經功能評分比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；而對照組、空白組實驗第14天與第7天神經功能評分，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗第14天血清TNF-α、IL-6水平均低于實驗第7天，但實驗組實驗第7、14天血清TNF-α、IL-6水平高于對照組和空白組（P＜0.05）。三組實驗第14天大鼠髓核中PLA2含量均低于實驗第7天，但實驗組實驗第7、14天大鼠髓核中PLA2含量高于對照組和空白組（P＜0.05）。結論" 寒邪作用于大鼠腰椎間盤突出癥模型能降低大鼠生存質量，提高髓核中PLA2含量及血清炎癥因子TNF-α、IL-6表達，為腰椎間盤突出癥的重要發病因素。

關鍵詞：腰椎間盤突出癥；寒邪；TNF-α；IL-6；PLA2

中圖分類號：R681.5+3" " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.14.017

文章編號：1006-1959（2024）14-0090-06

Experimental Study on the Effect of Cold Pathogen on Lumbar Disc Herniation in Rats

XU Li1，LI Xiao-lin2，ZHANG Chao-ju1，PENG Chang-hua1，CHEN Hong-wei1，WU Lei-lei1，HE Chuan1

（1.Orthopedics Department of Jingzhou Institute of Traditional Chinese Medicine/Jingzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，

Jingzhou 434000，Hubei，China;

2.Medical College of Yangtze University，Jingzhou 434000，Hubei，China）

Abstract：Objective" To investigate the effect of cold pathogen on rat model of lumbar disc herniation.Methods" Thirty SD rats were randomly divided into experimental group， control group and blank group according to the random number table method， with 10 rats in each group. The experimental group and the control group were transplanted with autologous nucleus pulposus to L4 and L5 nerve roots to establish a rat model of lumbar disc herniation. The blank group was not treated. The experimental group and the blank group were placed at 12∶00-16∶00 every day for 7 consecutive days. The rats were raised in an artificial climate box with a temperature of （4±0.5）℃ and a humidity of 50%±2% for 4 h， and the rest of the time was raised at room temperature. The control group was placed in a room temperature of （25±0.5）℃ and a humidity of 50%±2% for standardized feeding for 1 week. The quality of life， the content of PLA2 in nucleus pulposus， the content of serum inflammatory factors TNF-α and IL-6， and the pathological section of intervertebral disc were observed in the three groups.Results" After the completion of the modeling， all the three groups of rats survived without death， paralysis， and infection. On the third day of the experiment， the three groups of rats had obvious symptoms， and the neurological function scores were all above grade 3. On the 7 th and 14 th day of the experiment， the neurological function scores of the experimental group were higher than those of the control group and the blank group （Plt;0.05）， there was no significant difference in neurological function score between the 14th day and the 7th day in the experimental group （Pgt;0.05）， while the neurological function scores of the control group and the blank group on the 14th and 7th days of the experiment were statistically significant （Plt;0.05）. The levels of serum TNF-α and IL-6 on the 14th day of the experiment were lower than those on the 7th day of the experiment， but the levels of serum TNF-α and IL-6 on the 7th and 14th days of the experiment in the experimental group were higher than those in the control group and the blank group （Plt;0.05）. The content of PLA2 in the nucleus pulposus of rats on the 14th day of the three groups was lower than that on the 7th day of the experiment， but the content of PLA2 in the nucleus pulposus of rats on the 7th and 14th days of the experiment in the experimental group was higher than that in the control group and the blank group （Plt;0.05）.Conclusion" The cold pathogen acting on the rat model of lumbar disc herniation can reduce the quality of life of rats， increase the content of PLA2 in the nucleus pulposus and the expression of serum inflammatory factors TNF-α and IL-6， which is an important pathogenic factor of lumbar disc herniation.

Key words：Lumbar disc herniation;Cold pathogen;TNF-α;IL-6;PLA2

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation）是由于腰椎間盤不同程度的退行性改變后，在外力因素的作用下，椎間盤的纖維環破裂，髓核組織從薄弱處突出累及椎管，導致相鄰脊神經根遭受刺激或壓迫，引起的腰痛、下肢放射痛、麻木等一系列癥狀，是臨床多發病和常見病，發病率高達20%～30%，全球約9.4%的人群受其困擾[1]。早在1934年，Mixter WJ等[2]就對腰椎間盤突出癥做了相關報道，現如今已然成為世界性的公共衛生問題。近年來，國內外研究人員進行了大量實驗，認為腰椎間盤突出癥的發病機制主要與機械壓迫學說、炎癥刺激學說、自身免疫學說有關。隨著人們生活方式的改變，腰椎間盤突出癥的發病率也在逐年升高，一旦發生腰椎間盤突出癥，將會嚴重影響人們的工作和生活質量。該疾病治療方法較多，但大多只能不同程度的緩解癥狀，尚未發現能夠根治本病的方法。腰椎間盤突出癥屬祖國醫學“腰痹病”范疇，其發作多與受涼、受寒有關，其癥狀表現為腰腿部怕冷、畏風，受涼后癥狀加重。中醫學認為這是外界寒邪作用的結果，因寒邪凝滯收引，易困阻脈絡而引發疼痛。從疾病的本質來看，寒邪與腰痹病的致病機理、發病機制有待現代醫學驗證，目前缺乏中醫致病因素高相關性及可比性的腰椎間盤突出癥動物模型，因此建立一種理想的動物模型對于研究本病與中醫致病因素的關系具有重要意義，同時也為探索各種治療方法提供良好的實驗載體[3]。本研究旨在通過建立腰椎間盤突出癥的大鼠模型并給予外界寒邪刺激，探討寒邪在腰椎間盤突出癥發病中的機理，現報道如下。

1材料與方法

1.1動物" SPF級Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，體質量（200±20）g，共30只。由長江大學醫學院實驗動物中心提供。本動物實驗經荊州市中醫醫院倫理委員會審查通過。

1.2試劑" 注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號：20200815）；10%水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，批號：20210303）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測試劑盒（深圳雷杜生命科學股份有限公司，批號：202103）。

1.3儀器" MP5001電子天平（上海舜宇恒平有限公司）；Motic B5顯微攝像系統（麥克奧迪實業集團公司）；SL系列手術放大鏡（SLE2542，蘇州捷美醫療器械有限公司）；LEICA DMLB2雙目顯微鏡（德國LEICA公司）；LG10-2.4A高速離心機（北京醫用離心機廠）；Shandon325型石蠟切片機（英國 Shandon公司）；RT-6000酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）。

1.4方法

1.4.1動物分組" 30只SPF級SD雄性大鼠按照隨機數字表法分為實驗組、對照組和空白組，各10例。

1.4.2造模" 實驗組和對照組大鼠參照自體髓核移植法[4]進行造模，適應性飼養1周后將大鼠稱重后用腹腔注射10%水合氯醛（3.5 ml/kg）進行麻醉，麻醉生效后俯臥位固定大鼠，L4～L6棘突偏右側術前備皮，沿L4～L6棘突偏右側縱行切口，逐層分離皮膚、筋膜層，鈍性分離椎旁肌，暴露L4、L5乳狀突、椎板，行L4乳狀突、后關節突、部分椎板與L5的乳狀突、前關節突、部分椎板切除術，暴露硬膜及L4、L5背根神經節，在傷口處覆蓋浸有生理鹽水的紗布保濕。在尾部距肛門1 cm處截斷尾巴，然后縱行切口切開尾部皮膚暴露尾椎，切開纖維環共取4到5個髓核，將髓核輕輕放置在L4、L5背根神經節上形成壓迫，然后逐層縫合傷口，再次消毒傷口，造模后將大鼠放置在室溫下復蘇，蘇醒后單籠飼養。造模后，連續3 d腹腔注射青霉素鈉20萬單位/（只·d）以預防傷口感染。于造模術后第3天觀察大鼠的行為表現，觀察精神，有無煩躁，后肢有無跛行，飲食、飲水，大便等。實驗大鼠在造模前后及實驗干預期間的進食，精神狀態，休息等一般行為學指標為判定造模是否成功提供參考。采用神經功能判斷六級分法[5]進行評分（表1），神經功能評分超過2級提示造模成功。空白組同期飼養，不做造模處理。

1.4.3模擬外寒影響實驗" 實驗組：每天中午12∶00-16∶00將大鼠置于溫度為（4±0.5）℃、濕度為50%±2%的人工氣候箱中飼養4 h，其余時間按常規室溫飼養，連續1周。對照組：放置于（25±0.5）℃飼養，每天中午12∶00-16∶00將大鼠置于溫度為（4±0.5）℃、濕度為50%±2%的人工氣候箱中飼養4 h，其余時間按常規室溫飼養。連續1周。

1.4.4標本采集" 分別于實驗第7、14天隨機選取各組5只大鼠，使用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）進行腹腔內注射麻醉，麻醉完成后，按原手術位置逐層打開，暴露L4、L5背根神經節，將移植的髓核組織標本取出保存于-80 ℃的冰箱，樣本在60 ℃水浴30 min后冷卻，置4 ℃冰箱備用。實驗組、對照組、空白組三組標本分開標注并保存。打開大鼠胸腔，暴露心臟行心臟采血3～5 ml，放置于血漿抗凝管中，置于室溫30 min后，用高速冷凍離心機3000 r/min離心10 min，分離血清，放置于-20 ℃的冷藏柜中待用，實驗組、對照組、空白組三組標本分開標注并保存。最后進行心臟灌注，用灌注針頭（由50 ml針頭改制）從心尖插入，通過左心室進入主動脈，固定針頭，打開灌注裝置（由輸液器改制），剪開右心耳，先用灌注生理鹽水至肺與肝臟顏色由深紅逐漸變白，血色變淡，再灌注400 ml含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH約為7.4）進行固定，先快速灌注，觀察大鼠抽搐等情況，待抽搐結束，轉為慢速滴入，灌注約30 min。灌注結束后，大鼠軀體僵硬，按原手術位置逐層打開，暴露L4、L5背根神經節，將背根神經節、神經根、椎間盤取出后放入4%多聚甲醛中常溫保存備用，實驗組和對照組兩組標本分開標注并保存。

1.5觀察指標

1.5.1神經功能評分" 實驗組和對照組在術后第3、7、14天，空白組在實驗的第7、14天參照神經功能判斷六級分法進行評分，評分由課題組2人完成，取平均值。

1.5.2血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）測定" 嚴格按照ELISA法試劑盒說明書步驟測定三組大鼠血清TNF-α、IL-6含量：將三組留存備用的血清標本用RT-6000酶標儀于450 nm波長測定血清樣本吸光度值，根據標準品濃度及對應的吸光度值，計算標準曲線的直線回歸方程，再根據樣本的吸光度值，在回歸方程上計算出對應的血清TNF-α、IL-6含量。

1.5.3髓核中磷脂酶A2（PLA2）含量" 將三組留存備用的髓核標本取出，各取2只25 ml燒杯分別作為A管和B管。B管加入8 ml底物緩沖液，1.1 ml乙二胺四乙酸，樣本0.4 ml；8 ml A管加入底物緩沖液，0.2 ml CaCl2溶液，樣本0.4 ml。37 ℃水浴后，B管加入0.2 ml CaCl2溶液，A管再加入1.1 ml乙二胺四乙酸，混勻后以高靈敏度pH計測量A管、B管的pH值，以微量吸槍吸取新標定的稀鹽酸，將B管的pH滴定至與A管的相同的pH值，PLA2的活力通過所消耗的鹽酸測定。

1.5.4組織形態學觀察" 將三組標本在甲醛固定液中固定48 h，各級酒精梯度脫水，石蠟包埋，石蠟切片機自神經根組織分叉近端開始切成厚度4 μm石蠟切片，將切片置于58 ℃烤箱中烘烤18 h，行H-E染色，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察神經根組織的病理改變，用Motic B5顯微攝像系統觀察并攝影記錄結果。

1.6統計學方法" 所有數據采用SPSS 22.0統計學軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗及方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1生存情況" 造模完成后，模型組大鼠全部存活，無死亡、癱瘓、感染案例，均納入結果統計分析，樣本無脫落。術后第3天，均有明顯癥狀，神經功能評分均在3級以上。

2.2三組大鼠神經功能情況比較" 從行為表現上看，實驗第7天，實驗組和對照組大鼠均有乏力、站立不穩的情況，但實驗組大鼠精神萎靡、目光呆滯、聲音低微等情況更明顯。實驗第14天，對照組明顯好轉，活動度明顯增加，后肢行走乏力、痿軟；實驗組后肢乏力，跛行明顯，經常有舔舐后肢等動作。空白組實驗第7、14天均無明確的行走受限，但第7天因寒冷環境下活動量減少，精神稍差。從具體評分來看，實驗第7、14天，實驗組神經功能評分均高于對照組和空白組（P＜0.05）；實驗組實驗第14天與第7天神經功能評分比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；而對照組、空白組實驗第14天與第7天神經功能評分，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.3三組大鼠血清TNF-α、IL-6比較" 三組實驗第14天血清TNF-α、IL-6水平均低于實驗第7天，但實驗組實驗第7、14天血清TNF-α、IL-6水平高于對照組和空白組（P＜0.05），見表3、表4。

2.4三組大鼠髓核中PLA2含量比較" 三組實驗第14天大鼠髓核中PLA2含量均低于實驗第7天，但實驗組實驗第7、14天大鼠髓核中PLA2含量高于對照組和空白組（P＜0.05），見表5。

2.5神經及神經節病理學改變" 造模術后第7天，對照組神經節及神經根周圍小血管擴張充血，神經組織內可見小靜脈擴張充血，神經組織水腫，炎性細胞浸潤，但未見神經束受壓表現。實驗組可見出血及炎癥細胞細胞浸潤，同時有神經受壓表現。造模術后第14天時，對照組出血及炎癥細胞細胞浸潤明顯好轉，神經元輕度水腫；實驗組顯示較明顯的炎性細胞浸潤，浸潤的炎性細胞以中性粒細胞、巨噬細胞為主，且神經組織腫脹明顯、神經髓鞘腫脹、碎裂，軸突腫脹或消失，許旺氏細胞自溶、軟化，見圖1。

3討論

腰椎間盤突出癥是骨科臨床中的常見病和多發病，是引起腰腿疼痛的主要病因，由于腰椎間盤的退行性改變導致脊柱內外生物力學失衡，在伴隨損傷或不伴損傷條件下出現纖維環破裂，髓核組織向后突出刺激或壓迫硬膜囊和神經根，引發一系列如腰部疼痛、下肢放射性疼痛、麻木、間歇性跛行等臨床癥狀[6-8]。中醫學將腰椎間盤突出癥歸納為腰痛、腰腿痛、痹證等范疇，《素問·刺腰痛篇》中記載：“衡絡之脈令人腰痛，不可以俯仰，仰則恐仆，得之舉重傷腰”。引起腰椎間盤突出癥的病因復雜，椎間盤退行性改變是基本因素，外界因素是加劇椎間盤變性突出的誘發條件。《素問·痹論》云：“痛者，寒氣多也”。寒邪所具有的凝滯致病特點而致氣血運行不暢，同時寒屬陰邪，易傷陽氣，陽氣損傷又可致內寒更甚，進而復傷陽氣，機體陽氣受損，不能溫運，全身的氣血津液則不能正常運行，這都導致氣血凝結阻滯于筋脈，不通則痛，便可見四肢疼痛、麻木等表現。寒性收引而表現為所累肢體拘急不利，故而可見腰椎間盤突出癥患者腰背屈伸不利、行走活動受限。以本實驗結果可見，實驗組和空白組大鼠在受寒后均不同程度表現后肢無力、行走不穩；從神經功能情況來看，實驗組實驗第7、14天神經功能評分高于對照組和空白組（P＜0.05），可見外界寒邪的刺激明顯改變和加重大鼠的神經功能。寒邪凝滯、瘀血內生，瘀血又作為一種致病因素和寒邪疊加致使癥狀加重，這也是實驗組神經功能評分較高的原因。瘀血一旦形成則較難去除，故可見實驗組在實驗第14天神經功能評分下降不明顯，和對照組及空白組比較仍有統計學差異，這也為臨床治療寒邪所致腰椎間盤突出癥在應用溫經驅寒藥物的同時要加用活血祛瘀藥物提供了實驗依據。

祖國醫學沒有腰椎間盤突出癥這一病名，其屬于“腰痹病”范疇，在臨床診治該病時，更注重的是其證型，其中寒凝血瘀證是該病的主要證型，其治療方法較多，無論是內治還是外治都是從其寒凝的本質出發，標本同治、療效顯著，多能緩解患者癥狀，改善其生活質量。但基礎研究尚顯不足，尤其是用于實驗研究的寒凝模型報道較少。本研究借鑒了其他疾病寒凝證動物模型的造模方法及腰椎間盤突出癥的大鼠自體髓核移植造模方法，結合應用兩種造模方法，利用大鼠尾椎椎間盤髓核放置于腰椎神經根處模擬椎間盤突出致神經的機械壓迫，同時利用低溫寒凝刺激模擬外感寒邪[9]，綜合作用而模擬腰椎間盤突出癥的寒凝證，從造模后實驗大鼠的神經學表現及神經功能評分來看，該方法是有效的，造模是成功的。該方法造模具有操作方便、可控性強、成功率高等特點，可被用于腰椎間盤突出癥寒凝證的相關研究。臨床研究發現[10-13]，腰椎間盤突出癥患者體內血清TNF-α與IL-1β、IL-6等細胞炎性因子有不同程度的升高。通過大量的動物實驗研究[14-16]，進一步表明腰椎間盤突出癥的發病與TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子有關。同時，P物質和降鈣素基因相關肽是痛覺傳導的神經遞質，有研究發現其在腰椎間盤突出癥患者血清中含量升高[17]。還有學者研究表明[18，19]，PLA2、IL-6、TNF-α具有誘導髓核細胞凋亡，加速纖維環變性破壞，導致椎間盤突出。而寒冷環境下可以使血漿中TNF-α、IL-6和PLA2等炎癥因子的濃度升高。Nie Y等[20]將小鼠暴露于4 ℃的低溫環境中飼養21 d，發現寒冷可以使血漿中TNF-α和IL-6水平升高；Sánchez-Gloria JL等[21]把大鼠分別置于（23.5±2）℃和（5.0±1℃）中10 d，對比得出寒冷刺激會加重TNF-α、IL-6等炎癥因子水平升高；董彥文等[22]研究寒冷刺激對急性心肌梗死患者內皮素、炎癥因子的影響，結果表明寒冷刺激可導致TNF-α、IL-6和PLA2等炎癥因子水平增加。本實驗研究中發現，實驗組大鼠在寒邪模擬環境下髓核中PLA2含量較對照組和空白組升高，血清中TNF-α、IL-6也較對照組和空白組升高，再次表明寒邪環境下可加速髓核變性突出。

本研究不足之處：本造模方法尚不能模擬單純的寒凝所致的腰椎間盤突出癥，雖然空白組大鼠在寒冷刺激后也表現出了一定的神經功能受損的表現，但缺乏腰椎間盤突出癥髓核突出的直接依據；寒邪刺激的溫度比較單一，尚未就不同溫度作對比研究；未深入探討寒邪促進TNF-α、IL-6和PLA2等炎癥因子表達的機制。

綜上所述，寒邪作用于大鼠腰椎間盤突出癥模型能降低大鼠生存質量，提高髓核中PLA2含量及血清炎癥因子TNF-α、IL-6表達，為腰椎間盤突出癥的重要發病因素。

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收稿日期：2023-08-18；修回日期：2023-09-01

編輯/杜帆