西維來司他鈉對LPS誘導大鼠心肌細胞損傷的保護作用

【摘要】 目的：探討西維來司他鈉對脂多糖（LPS）誘導的大鼠心肌細胞損傷的保護作用。方法：海南省人民醫院于2021年7月—2022年2月采用LPS建立大鼠H9c2心肌細胞損傷模型，分為對照組、LPS組、西維來司他鈉+LPS組。其中西維來司他鈉+LPS組分為高濃度組（LPS+high，10 μg/mL）、中濃度組（LPS+medium，4.8 μg/mL）、低濃度組（LPS+low，1.6 μg/mL）。LPS誘導心肌細胞損傷6 h后，檢測心肌細胞上清液中的白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）的水平，對比各組上述因子水平的差異性。結果：與對照組比較，LPS組及低濃度組、中濃度組、高濃度組的IL-6、TNF-α、IL-1β、LDH水平均顯著升高，SOD均下降，差異均有統計學意義（Plt;0.05）；與對照組比較，LPS組及低濃度組、中濃度組的MDA水平均顯著升高（Plt;0.05）；與LPS組比較，低濃度組、中濃度組、高濃度組的IL-6、TNF-α、IL-1β、MDA、LDH均下降，SOD水平均升高，差異均有統計學意義（Plt;0.05）。結論：西維來司他鈉可減少LPS誘導的心肌細胞炎癥因子和氧化應激因子的產生，減輕心肌細胞損傷，從而起到保護心肌細胞的作用。

【關鍵詞】 膿毒癥 膿毒癥心肌病 炎癥因子 氧化應激 西維來司他鈉

Protective Effect of Sivelestat Sodium on LPS-induced Myocardial Cells Injury in Rats/GAO Xiaoxin， ZHANG Rujun， TIAN Jia， LEI Zhenlin， CHEN Qing’an. //Medical Innovation of China， 2024， 21（33）： -174

[Abstract] Objective： To investigate the protective effect of Sivelestat Sodium on lipopolysaccharide （LPS）-induced myocardial cells injury in rats. Method： The rat H9c2 myocardial cells injury model was established by LPS in Hainan General Hospital from July 2021 to February 2022， which were divided into control group， LPS group， and Sivelestat Sodium + LPS group. Among them， Sivelestat Sodium + LPS group were divided into high concentration group （LPS + high， 10 μg/mL）， medium concentration group （LPS + medium， 4.8 μg/mL） and low concentration group （LPS+low， 1.6 μg/mL）. The levels of interleukin-6 （IL-6）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， malondialdehyde （MDA）， lactate dehydrogenase （LDH） and superoxide dismutase （SOD） in the supernatant of myocardial cell were detected after 6 h of LPS-induced myocardial cell injury. The differences of the above factors in each group were compared. Result： Compared with control group， the levels of IL-6， TNF-α， IL-1β and LDH in LPS group and low concentration group， medium concentration group and high concentration group were significantly increased， and SOD were decreased， the differences were statistically significant （Plt;0.05）. Compared with control group， the levels of MDA in LPS group and low concentration group， medium concentration group and high concentration group were significantly increased， the differences were statistically significant （Plt;0.05）. Compared with LPS group， IL-6， TNF-α， IL-1β， MDA and LDH in low concentration group， medium concentration group and high concentration group were decreased， and SOD levels were increased， the differences were statistically significant （Plt;0.05）. Conclusion： Sivelestat Sodium can reduce the production of inflammatory factors and oxidative stress factors in LPS-induced induced myocardial cells， alleviate the injury of myocardial cells， and thus play a role in protecting myocardial cells.

[Key words] Sepsis Sepsis-induced cardiomyopathy Inflammatory factors Oxidative stress Sivelestat Sodium

First-author's address： Department of Intensive Medical Unit， Hainan General Hospital （Hainan Affiliated Hospital of Hainan Medical University）， Haikou 570311， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.33.041

膿毒癥已成為臨床上常見的危重癥疾病，是導致重癥監護病房患者死亡的主要原因之一。流行病學研究顯示，目前全球膿毒癥患者病死率仍處于較高的水平，約為20%[1]。隨著對膿毒癥的研究和深入了解，大多數學者認為，膿毒癥是宿主對感染反應失調而出現的危及生命的多器官功能障礙[2]，常繼發于全身各部位的感染、嚴重創傷、燒傷等，嚴重時可進展為膿毒癥休克，具有較高的病死率[3]。膿毒癥的發病機制非常復雜，至今仍未明確，可能是在致病因素的作用下導致宿主體內出現炎癥反應級聯風暴，誘發氧化應激損傷、免疫細胞凋亡和功能障礙等，最終導致機體出現多個器官、系統的功能衰竭甚至死亡。

心臟是膿毒癥發生時容易累及的靶器官之一，有40%～60%的膿毒癥患者在膿毒癥基礎上合并心功能障礙[4]，稱為膿毒癥心肌病（sepsis-induced cardiomyopathy，SIC），其是在感染基礎上出現的心臟收縮和/或舒張功能障礙，表現為左右心室舒張和/或收縮功能障礙、左心室射血分數下降，為可逆性的心肌抑制性損傷[5]。SIC的發生加速了心血管系統的功能障礙，加重各器官的灌注不足和功能衰竭，導致膿毒癥患者的死亡率明顯升高，影響著膿毒癥患者的生存和預后，亦是亟待解決的重要社會公共衛生問題[6]。目前對于該疾病的治療主要是藥物干預和各器官功能支持，包括使用增強心肌收縮力藥物、有創或無創呼吸機支持及連續性血液濾過等，但是治療效果、患者的疾病結局和預后并不樂觀[7]。SIC的病理生理機制復雜多樣，仍處于探索的階段。目前研究表明，SIC可能是線粒體功能障礙、氧化應激、細胞凋亡等多種因素共同作用下發生的結果[8]。中性粒細胞彈性蛋白酶可促進血管內皮細胞損傷、增加血管通透性，導致心肌細胞損傷的發生。西維來司他鈉作為該酶的抑制劑，是否可以通過抑制某些炎癥因子、減少心肌細胞的損害，降低SIC的發生率，少有文獻報道。本研究觀察西維來司他鈉對LPS誘導的大鼠心肌細胞損傷的保護作用，探索可能的機制，以期能夠尋找到SIC有效的預防和治療措施。

1 材料與方法

1.1 材料

研究時間為2021年7月—2022年2月。大鼠H9c2心肌細胞（武漢普諾賽公司），H9c2（2-1）細胞專用培養基（武漢普諾賽公司，CM-0089），注射用西維來司他鈉（生產廠家：蘇州二葉制藥有限公司，上海匯倫江蘇藥業有限公司，批準文號：國藥準字H20203093，規格：0.1 g）。ELISA試劑盒：白介素-6（IL-6，聯科生物，EK306/3-96）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α，聯科生物，EK382/3-96）、白介素-1β（IL-1β，聯科生物，EK301B/4-96）；丙二醛測定試劑盒（MDA，南京建成生物工程研究所，A003-1-2，TBA法）、乳酸脫氫酶測定試劑盒（LDH，南京建成生物工程研究所，A020-2-2，微板法）、超氧化物歧化酶測定試劑盒（SOD，南京建成生物工程研究所，A001-3-2，WST-1法）。本研究經海南省人民醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 心肌細胞培養 將大鼠H9c2心肌細胞在H9c2（2-1）細胞專用培養基中培養，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的恒溫密閉培養箱中進行培養，2～3 d更換培養基1次，每日在光學顯微鏡下觀察細胞的形態和生長情況。待細胞生長密度達到傳代要求后，給予0.25%胰蛋白酶消化，取消化完成的細胞進行離心，離心后將細胞分別接種于培養基中。

1.2.2 心肌細胞分組 將傳代后正常生長的大鼠H9c2心肌細胞接種在96孔板上，調整細胞密度為1.0×105個/mL，分為5組：對照組、LPS組、西維來司他鈉+LPS組，其中西維來司他鈉+LPS組分為高濃度組（LPS+high，10 μg/mL）、中濃度組（LPS+medium， 4.8 μg/mL）和低濃度組（LPS+low，1.6 μg/mL）。每組細胞分為5個孔。西維來司他鈉+LPS組細胞培養12 h后，先給予西維來司他鈉溶液預處理2 h，然后用1.0 μg/mL LPS分別刺激誘導6 h。

1.2.3 生物學指標檢測 LPS誘導6 h后（對照組無誘導）收集各組的心肌細胞上清液，離心后保存。檢測各組心肌細胞上清液中的IL-6、TNF-α、IL-1β、MDA、LDH、SOD濃度。

1.3 統計學處理

所有數據均采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用LSD-t檢驗，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 西維來司他鈉對心肌細胞炎癥因子的影響

與對照組比較，LPS組及低濃度組、中濃度組、高濃度組的炎癥因子水平均明顯升高（Plt;0.05）；與LPS組比較，低濃度組、中濃度組、高濃度組炎癥因子水平逐漸下降（Plt;0.05）。見表1。

2.2 西維來司他鈉對心肌細胞氧化應激的影響

與對照組比較，LPS組及低濃度組、中濃度組、高濃度組的LDH水平均顯著升高，SOD均下降（Plt;0.05）；與對照組比較，LPS組及低濃度組、中濃度組的MDA水平均顯著升高（Plt;0.05）；與LPS組比較，低濃度組、中濃度組、高濃度組的MDA和LDH逐漸下降，SOD均逐漸升高（Plt;0.05）。見表2。

3 討論

隨著全球醫療技術水平的快速發展，目前膿毒癥的治療措施和臨床治療效果已得到顯著改善，但是膿毒癥的發病率和死亡率仍居高不下，且對該病的認知仍然存有一定的局限。全球每年仍有數百萬新增膿毒癥患者，其中1/4以上的患者出現死亡，說明膿毒癥是導致普通人群死亡和重大疾病發生的主要原因[9-10]。對于有糖尿病、慢性腎臟病、免疫性疾病等慢性疾病的患者，膿毒癥造成的不良后果可能是致命性的。膿毒癥主要是在感染的誘導下導致宿主體內出現多種細胞因子和炎癥因子的釋放[11]，包括大量的活性氧類物質、促炎癥介質、腫瘤壞死因子等[12]，進而導致線粒體功能障礙、免疫功能異常、氧化應激損傷，從而出現多個器官或系統的功能障礙或衰竭[13]。膿毒癥與心肌損傷的發生密切相關，并發SIC的患者，死亡率明顯增加[14]。在膿毒癥基礎上引發的心功能障礙是可逆的病理過程[15]。有研究表明，線粒體損傷、功能缺陷導致的氧化應激增加是造成心肌損傷的重要原因之一[16]。研究發現，心肌細胞能量代謝異常是SIC發生的起始環節，包括心肌脂類和糖類代謝異常、線粒體損傷等[17]。SIC的主要臨床表現是心功能障礙，往往會出現心輸出量下降，甚至休克[18]，進一步導致全身各組織器官供血供氧不足，并且對液體復蘇和兒茶酚胺類藥物的反應明顯下降[19]。

氧化應激反應主要是由于體內活性氧（ROS）和活性氮（RNS）產生過多，引起氧化與抗氧化作用的失衡。在過氧化起主導作用的情況下，機體會出現免疫細胞凋亡、免疫調節系統失衡，引發多器官功能的損傷[20]。ROS主要包括了O2-、OH-和H2O2等自由基。心肌細胞線粒體產生的ROS過量可抑制氧化磷酸化，使ATP生成減少，心肌細胞能量代謝異常，出現心肌抑制[21]。另外，氧化應激還可以通過ROS依賴的通路激活細胞凋亡途徑，導致凋亡蛋白出現級聯反應，促進心肌細胞的凋亡[22-23]，導致心功能障礙。研究發現，在采用盲腸穿孔法制作小鼠膿毒癥模型時，氧化應激引起的脂質過氧化導致心肌細胞肌膜和肌層損傷[24]。此外，在膿毒癥發生時，ROS使心肌細胞線粒體膜通透性發生改變而引起心肌細胞凋亡，進而導致心臟功能障礙[25]。內毒素LPS是常見的介導炎癥的因子，在LPS的誘導下可使細胞出現炎癥損傷從而出現氧化和抗氧化反應的失衡，可以模擬動物體內炎癥反應機制，具有良好的效果[26]。

本研究發現經過LPS誘導的心肌細胞，可觀察到IL-6、TNF-α、IL-1β水平均明顯升高，但是在經過西維來司他鈉進行干預處理后，血清中的炎癥因子水平呈逐步下降的趨勢，與藥物劑量呈正相關。說明西維來司他鈉可以降低LPS誘導心肌細胞損傷后炎癥因子的分泌，降低心肌細胞損傷，對心肌細胞具有一定的保護作用。而在LPS的刺激下，心肌細胞產生的MDA和LDH均明顯升高，SOD均下降，說明在炎癥因子的刺激下細胞內出現氧化和抗氧化反應的失衡。在給予西維來司他鈉處理后，抗氧化因子SOD水平均明顯升高，氧化因子水平均下降，提示西維來司他鈉可以通過減少氧化應激反應減輕炎癥損傷從而達到保護心肌細胞的作用。但本研究存在一定的局限性，后期研究我們將通過結合臨床和動物體內實驗進一步探討西維來司他鈉對心肌細胞炎癥損傷的保護作用的相關機制，以期尋找出相關的靶基因位點，為疾病的治療提供更多的理論依據。

參考文獻

[1]袁瑩，邱建清，張洪光.膿毒性心肌病發病機制及其治療的研究進展[J].中國醫學創新，2023，20（20）：174-179.

[2] SINGER M，DEUTSCHMAN C S，SEYMOUR C W，et al.The third international consensus definitions for sepsis and septic shock （sepsis-3） [J].JAMA，2016，315（8）：801-810.

[3] VAN VUGHT L A，KLEIN KLOUWENBERG P M，SPITONI C，et al.Incidence， risk factors， and attributable mortality of secondary infections in the intensive care unit after admission for sepsis[J].JAMA，2016，315（14）：1469-1479.

[4] WANG X Y，DING Y，LI R，et al.N6-methyladenosine of Spi2a attenuates inflammation and sepsis-associated myocardial dysfunction in mice[J].Nat Commun，2023，14（1）：1185-1195.

[5] RAVIKUMAR N，SAYED M A，POONSUPH C J，et al.Septic cardiomyopathy： from basics to management choices[J].Curr Probl Cardiol，2021，46（4）：100767-100781.

[6] HOLLENBERG S M，SINGER M.Pathophysiology of sepsis-induced cardiomyopathy[J].Nat Rev Cardiol，2021，18（6）：424-434.

[7] L'HEUREUX M，STERNBERG M， BRATH L，et al.Sepsis-induced cardiomyopathy： a comprehensive review[J].Curr Cardiol Rep，2020，22（5）：35-47.

[8] CARBONE F，LIBERALE L，PREDA A，et al.Septic cardiomyopathy： from pathophysiology to the clinical setting[J].Cells，2022，11（18）：2833-2845.

[9]劉蕾，吳俊.中性粒細胞胞外誘捕網在血栓形成中發揮重要作用[J].中華檢驗醫學雜志，2020，43（8）：5-11.

[10] TAN C Y，AZIA M，WANG P.The vitals of NETs[J].J Leukoc Biol，2021，110（4）：797-808.

[11] WANG J，WANG X T，LIU D W，et al.Induction and deduction in sepsis-induced cardiomyopathy： five typical categories[J].Chin Med J （Engl），2020，133（18）：2205-2211.

[12] MONTEIRO V，REIS J F，SOUZA G R，et al.Dual behavior of exosomes in septic cardiomyopathy [J].Adv Exp Med Biol，2017，998：101-112.

[13] ARULKUMARAN N， DEUTSCHMAN C S，PINSKY M R，et al.

Mitochondrial function in sepsis[J].Shock，2016，45（3）：271-281.

[14] JACOBI J.The pathophysiology of sepsis - 2021 update： part 2， organ dysfunction and assessment[J].Am J Health Syst Pharm，2022，79（6）：424-436.

[15] LIMA M R，SILVA D.Septic cardiomyopathy： a narrative review[J].Rev Port Cardiol，2023，42（5）：471-481.

[16]李景萍.革蘭氏陰性細菌感染致膿毒癥患者血清免疫、炎性指標與心肌損傷的相關性[J].臨床醫學，2023，43（11）：55-57.

[17]陳群，李霖，李秀娟，等.解耦聯蛋白2對膿毒癥腹腔感染大鼠心肌細胞凋亡、氧化應激及PKR/Caspase-11蛋白的影響[J].中國老年學雜志，2023，43（17）：4322-4326.

[18]魏延煥，董慶林.膿毒癥心肌病的研究進展[J].中國醫學創新，2022，19（30）：178-183.

[19] STENGL M，PRUCHA M，MATEJOVIC M.Cytokines，heart and calcium current in sepsis. Mechanical stretch and cytokines[J].Springer Netherlands，2012：87-106.

[20] SU L J，ZHANG J H，GOMEZ H，et al.Reactive oxygen species-induced lipid peroxidation in apoptosis， autophagy， and ferroptosis[J].Oxid Med Cell Longev，2019，2019：5080843-5080857.

[21] CHENNA S，KOOPMAN W J H，PREHN J H M，et al.

Mechanisms and mathematical modeling of ROS production by the mitochondrial electron transport chain[J].Am J Physiol Cell Physiol，2022，323（1）：C69-C83.

[22] TAN Y，CHEN S N，ZHONG J K，et al.Mitochondrial injury and targeted intervention in septic cardiomyopathy[J].Curr Pharm Des，2019，25（18）：2060-2070.

[23] LIN Y，DING Y C，WU Y，et al.The underestimated role of mitochondria in vitiligo： from oxidative stress to inflammation and cell death[J/OL].Exp Dermatol，2024，33（1）：e14856-e14868（2023-06-20）[2024-01-11].https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37338012/.DOI：10.1111/exd.14856.

[24] LI J M，WANG L Y，WANG B，et al.NOX4 is a potential therapeutic target in septic acute kidney injury by inhibiting mitochondrial dysfunction and inflammation[J].Theranostics，2023，13（9）：2863-2878.

[25] XIN T，LU C Z.SirT3 activates AMPK-related mitochondrial biogenesis and ameliorates sepsis-induced myocardial injury[J].Aging （Albany NY），2020，12（16）：16224-16237.

[26] KELLUM J A，FORMECK C L，KERNAN K F，et al.Subtypes and mimics of sepsis[J].Crit Care Clin，2022，38（2）：195-211.

（收稿日期：2024-04-02） （本文編輯：陳韻）