包裝飲用水中銅綠假單胞菌的污染情況分析

郭焜鵬，何 娟，張海韻，高 晗，楊 滔，宋 晟

（湖南省產商品質量檢驗研究院，食品安全監測與預警湖南省重點實驗室，湖南長沙 410000）

1 背景信息

《食品安全國家標準 包裝飲用水》于2015年5月24日起正式實施，標準刪除了菌落總數、霉菌等項目，保留了大腸菌群檢驗項目的同時，新增了銅綠假單胞菌檢驗項目[1]。

銅綠假單胞菌又稱為綠膿桿菌，是一種革蘭染色陰性菌，具有單根鞭毛的細小桿菌，在土壤、空氣、地表水及污水等中廣泛存在，可通過水源、土壤、工器具、接觸等多種途徑傳播，是水質污染的指示菌，對化學藥劑的抵抗力比普通革蘭氏陰性菌強，而且易產生耐藥性。銅綠假單胞菌對常規水質消殺處理技術如紫外線、臭氧和二氧化氯等，均有很強的抵抗力，故單純用大腸菌群作為瓶裝水常規污染指示菌，并不能充分反映水質污染程度。《歐盟飲用水水質指令》（98/83/EC）也規定，瓶裝或桶裝飲用水中銅綠假單胞菌的指標值為0個/250 mL。美國、加拿大、巴西、日本等均限制瓶裝飲用水（包括天然礦泉水水源）中銅綠假單胞菌的MPN＜3/L或每250 mL中不得檢出[2]。

2 銅綠假單胞菌檢出情況分析

廣東省疾病預防控制中心2013—2015年在廣東省21個地級市及順德區共檢測桶裝水樣品1 901份，檢出銅綠假單胞菌陽性樣品112份，陽性率為5.9%[3]。大理州疾病預防控制中心2014年至2015年對大理州內各桶裝水品牌的送水銷售站的66份桶裝水進行檢測，銅綠假單胞菌陽性檢出率為6.06%[4]。河南省口岸食品檢驗檢測所2016—2019年抽檢的1 875批次的包裝飲用水中，71批次檢出綠假單胞菌，檢出率為3.78%，432批10 L以上桶裝水中檢出62批，檢出率為14.35%，312批礦泉水中檢出2批，檢出率為0.64%[5]。

本研究對長沙、株洲、岳陽、邵陽、懷化、湘西、永州和張家界等地的桶裝飲用水進行三級采樣，每批次5個獨立樣品，依據《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016）進行檢測，量取250 mL水樣用抽濾泵過濾，濾膜貼于CN培養基上36 ℃培養24～48 h后取疑似陽性菌進行生理生化鑒定，共收集26株銅綠假單胞菌，并選取18株進行生物信息學分析，即對純化菌株提取DNA后，基因組測序，分析相關基因。

3 銅綠假單胞菌的危害

銅綠假單胞菌有多種毒素因子，主要包括綠膿素、粘附素、肉毒素、彈性蛋白酶、多糖莢膜和磷脂酶C等多種外毒素、內毒素等致病因子，是導致急性腸道疾病和皮膚炎癥的食源性致病菌。國內已有因銅綠假單胞菌污染飲用水導致中毒事件發生的報告。因其具有天然耐藥能力，在特定條件下，它還可引起繼發感染或混合感染的慢性炎癥，引發肺炎、腦膜炎、敗血癥等嚴重急性感染的報道也屢見不鮮。

飲用水中的有機物質含量雖然極低，剛出廠時的桶裝水中銅綠假單胞菌數量也較少，但包裝水消費周期較長，保質期也至少在30 d以上，對有機營養物要求較低的銅綠假單胞菌可迅速增殖，達到104CFU·mL-1。夏季高溫導致包裝飲用水消費量最大，而氣溫更是接近于銅綠假單胞菌的最適生長溫度區間，所以夏季是人感染銅綠假單胞菌的高峰期。一旦受感染，微生物將在宿主體內大量繁殖。

中國細菌耐藥性監測網作為一個權威的微生物耐藥監測系統在2017年對全國29所綜合性醫院及5所兒童醫院收集到的16 562株銅綠假單胞菌的耐藥性進行了分析，發現其對所測試的環丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星、哌拉西林、頭孢吡肟和兩種酶抑制劑復合劑的耐藥率小于20%[6]；在2018年對全國44所醫院收集到的23 431株銅綠假單胞菌對所測試的慶大霉素、左氧氟沙星、兩種酶抑制劑復合制劑、環丙沙星、哌拉西林和頭孢吡肟的耐藥率均≤21%[7]。

4 銅綠假單胞菌的抗消毒劑、致病性和耐藥性

隨著消毒劑在醫療衛生、生產包裝水行業中的廣泛應用，銅綠假單胞菌的抗消毒劑的特性也展現出來。深入研究后發現，銅綠假單胞菌存在多種耐消毒劑基因，對季胺鹽類、雙胍類、酚類、醇類和碘類等都有一定的抗性。目前關于銅綠假單胞菌耐消毒劑基因研究最多的就是qac基因家族，其可以使銅綠假單胞菌對季胺類（如苯扎溴銨）、雙胍類（如氯已定）等消毒劑產生抗性[8]。

隨著生物信息學的發展，研究人員通過對眾多銅綠假單胞菌的基因組測序，經過分析發現有數以百計的基因編碼毒力相關因子。經研究，部分致病途徑有：①通過鞭毛及其他如Ⅳ型菌毛等與宿主細胞或蛋白發生粘附作用，在此基礎上產生相應致病效應；②通過群體感應發揮致病作用，如調控毒素基因的表達以及形成生物膜等[9]。而生物膜又是引起飲用水企業生產質量不達標的關鍵因素。

魏磊等[10]對湖北、云南等全國9個省36家水廠進行采樣，在采集的108個樣本中分離36株銅綠假單胞菌，以P.aeruginosaATCC 15442為陽性對照，Escherichia coliATCC 25922為陰性對照，ecfX為對照基因，分別檢測exoU、exoS、phzM、toxA和lasB在36株銅綠假單胞菌中的存在情況，毒力基因exoU、exoS、phzM、toxA和lasB在分離到的36株銅綠假單胞菌中的檢出率高，但分離到的菌株對所選取的14種抗生素均無耐藥性。

銅綠假單胞菌的耐藥機制比較復雜。其主要因素有：①細菌產生抗菌活性酶，如β-內酰胺酶，能水解β-內酰胺類抗生素，導致藥物失活；②突變抗菌藥物作用的靶位，如DNA旋轉酶等結構發生靶位改變，從而逃避抗菌藥物；③外膜的微孔蛋白發生結構改變或數量減少，使外膜通透性降低，很多藥物將不易進入細菌；④生物膜的形成，作為由胞外多聚物所構筑的膜樣結構物理屏障，可以有效延緩或阻止大部分臨床抗菌藥物的滲入菌體；⑤主動泵出系統，主要功能是將菌體毒素排出體外[11]。

5 飲用水微生物污染控制

國內桶裝飲用水生產過程中造成銅綠假單胞菌污染的主要風險有：①生產企業的水源和源水池的保護不當，使細菌大量繁殖；②儲水器、水處理相關設備、輸水和灌裝線的管材被細菌污染；③水體消毒殺菌不徹底；④生產及運輸過程中相關人員管控不到位，操作不規范；⑤灌裝車間環境未監測、環境消殺不到位；⑥設備老舊、清洗消毒工位人員不足；⑦包材儲存車間環境不規范，包材被污染；⑧回收桶消毒不徹底，清潔后堆放不規范；⑨消毒劑的配制和使用不科學；⑩缺少出廠檢驗和關鍵點風險監控[12]。

6 生產過程控制

①水源監測。企業要注意對生產飲用水的水源進行保護，定期監測。②水處理工藝。水處理裝置應定期維護，如更換濾膜和濾料、檢查濾膜性能，確保過濾及純化裝置的正常運轉。③空氣潔凈度。灌裝車間空氣潔凈度應滿足《食品安全國家標準 包裝飲用水生產衛生規范》（GB 19304—2018）中的要求，設置空氣凈化和消毒設施，空氣清潔度應達到10 000級，罐裝局部可達到100級為宜。④包裝材料。不潔的包裝材料是銅綠假單胞菌的重要傳播媒介。加強回收桶的清潔消毒，尤其是對其內部的清洗[13]。⑤人員管理。人員操作不當會造成二次污染，是引起桶裝飲用水銅綠假單胞菌污染的又一類突出原因。強化操作人員衛生意識，杜絕人為污染[14]。

7 結語

目前我國在基因層面研究涉及食源性或水源性銅綠假單胞菌耐藥性的研究。因此，有必要評估通過全基因組測序和生物信息學進行初步研究水源性銅綠假單胞菌的相關特性基因，從而可以分析其耐藥特征及變化趨勢，并通過監測飲用水中銅綠假單胞菌的污染情況，為后期溯源性分析提供數據支撐，從而保障廣大消費群體的飲水安全。