玉米抗莠去津相關性狀的全基因組關聯分析及候選基因預測

關鍵詞：玉米；莠去津；全基因組關聯分析；候選基因；分子標記

中圖分類號：S513：Q78 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）11-0028-08

玉米（Zea mays L.）作為主要的糧食、飼料和能源作物，在保證國家糧食安全和民生發展方面發揮著不可替代的作用。玉米生長受雜草危害嚴重，雜草與玉米在地上激烈爭奪光照資源，并影響通風，在地下爭奪養分與水分，嚴重影響玉米的生長發育。此外，雜草還是一些病蟲害的傳播媒介，易引發蚜蟲、病毒病等病蟲害。化學除草是當前玉米生產中廣泛應用的除草方式，具有效果好、成本低等優勢。然而，目前玉米生產中使用的除草劑種類繁多，如酰胺類、磺酰脲類、磺酰胺類、脲類、苯氧羧酸類和有機雜環類等，它們的作用方式、除草效果以及殘留等存在一定差異。莠去津（atrazine）作為三嗪類除草劑，屬選擇性內吸傳導型除草劑，苗前、苗后均可使用，其通過抑制Di蛋白的活性，干擾光合作用過程中的電子傳輸系統，從而阻礙植物生長發育，達到除草效果。由于莠去津的殺草功效好且價格較低，在世界各地迅速得到了應用和推廣，成為使用最廣泛使用的除草劑之一。莠去津一般在玉米3～5葉期、雜草2～4葉期時施藥，對玉米較為安全。但是，不同玉米材料對莠去津也存在藥害差異，有的材料抗性較好，而有的材料則表現出藥害較重的現象，如噴施莠去津后呈褪綠斑、變黃、部分苗葉緣皺縮、葉片卷縮成筒狀等癥狀。而對造成這種抗性差異的遺傳機制的認知還存在局限。因此，解析玉米種質抗莠去津差異的遺傳機制，選育出有耐／抗除草劑內源基因的玉米種質資源，可減少莠去津除草劑對玉米雜交后代的藥害程度。在保證除草效果的基礎上，篩選出耐除草劑玉米種質資源并深入解析其遺傳基礎對玉米抗莠去津除草劑種質創新具有重要意義。

迄今為止，連鎖分析與關聯分析方法均被證明是復雜數量性狀遺傳基礎解析的有效方法。國內外學者利用上述兩種分析方法對作物抗除草劑性狀進行QTL（quantitative trait locus，數量性狀基因座）定位研究。通過QTL連鎖定位，Bhoite等以小麥W7984×Westonia重組自交系為材料，苗期使用三嗪類除草劑處理，以相對葉綠素含量為評價指標，共檢測到4個QTLs，其中4A染色體上2個，2D染色體和1A染色體上各1個；Javid等以豌豆Kaspa×PBA的重組自交系為材料，在除草劑脅迫條件下，以豌豆受藥害綜合評級為表型，檢測到16個抗莠去津除草劑相關QTLs；張銳劍以CA19×浙粳22重組自交系群體F_4：5的158個株系為材料，在三葉期噴濃度為2g/L的草甘膦溶液，以枯死時間、存活率和枯死指數3個性狀作為評價指標，共檢測到3個耐草甘膦相關QTLs。但是，針對玉米抗莠去津差異QTL定位的研究較少。

本研究以包含234份玉米自交系關聯群體為材料，基于前期包含56000個SNPs（single nucle-otide polymorphism，單核苷酸多態性）芯片的基因型鑒定結果和該群體抗莠去津表型評價數據，利用全基因組關聯分析，規模化鑒定控制玉米抗莠去津相關性狀變異的QTNs（ quantitative trait nu-cleotides，數量性狀遺傳位點）。在此基礎上，利用生物信息學分析方法，挖掘相關候選基因，為解析玉米抗莠去津變異的遺傳基礎提供理論支持，為培育抗除草劑玉米種質資源提供科學支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料和田間設計

試驗選用包含234份玉米自交系的關聯群體為材料，其中溫帶自交系96份，熱帶自交系138份，均種植于貴陽市花溪區貴州省農業科學院旱糧研究所溫室大棚內。玉米種子播于蛭石和營養土按照1：1比例混合的基質內，每份自交系播5粒種子，重復3次。溫室培養條件為：晝、夜溫度分別為30、26℃，自然光照。玉米二葉期噴施生產上常用的38%莠去津除草劑（12mL/L），對照組噴施清水。

1.2葉綠素含量（SPAD）測定及分析

根據《除草劑防治轉基因耐除草劑玉米田雜草田間藥效實驗準則》，于噴藥后第15天，使用攜便式葉綠素儀檢測每株幼苗第2片葉的葉綠素含量。

利用Microsoft Excel 2016整理數據，利用IBM SPSS Statistics 27.0.1軟件進行基本描述、方差等數據分析。

1.3關聯群體抗藥性調查與分析

噴施莠去津后15天，按照除草劑藥害癥狀分級標準（表1）進行藥害分級調查，根據抗性評價分級標準（表2）確定玉米對莠去津的抗藥級別。玉米受害率計算公式為：X（%）=[∑（N×S）/（T×M）]×100。其中：X為受害率，N為同級受害株數；S為級別值；T為總株數；M為最高級別。

1.4基因型鑒定與分析

基因型鑒定工作項目組前期已經完成。即采用CTAB法提取基因組DNA，用紫外分光光度計進行DNA濃度和純度檢測。將質檢合格的DNA原液一部分稀釋至100ng/μL送康普生物（北京）科技有限公司進行基因型數據測定，一部分-20℃保存備用。利用MaizeSNP50芯片對關聯群體進行基因型鑒定，剔除數據缺失頻率gt;20%、最小等位基因頻率lt;5%的SNP標記，剔除無明確位置的SNP標記，獲得高質量的SNP標記，用于全基因組關聯分析。

1.5全基因組關聯分析

結合已有的基因型和表型評價結果，使用R軟件GAPIT（genome associated prediction integrat-ed tool）程序包，對SPAD以及玉米受害率進行全基因組掃描，顯著性閾值設置為Plt;0.001。根據項目組前期的研究結果，該群體的平均LD（link-age disequilibrium，連鎖不平衡）距離為50kb。根據Wu等描述的方法，參照各SNP在基因組中的物理位置，利用MaizeGDB（https：//www.maizegdb.org/genome/）、NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Uniprot（https：//www.uniprot.or）等數據庫，對顯著性SNP位點上、下游各50kb區段內的基因進行候選基因篩選及功能注釋。

2結果與分析

2.1噴施莠去津對玉米葉片葉綠素含量的影響

由表3可見，玉米噴施莠去津處理組與對照組SPAD值有較大差異，組間變異系數為4.05%。從直方圖擬合曲線上看，關聯群體處理與對照的SPAD均符合正態分布。方差分析發現，關聯群體噴藥處理組與對照組葉綠素含量呈極顯著差異（圖1）。

2.2玉米幼苗莠去津抗性鑒定結果

玉米對莠去津除草劑抗感數量和比例均呈偏正態分布趨勢（圖2），其中，高抗的材料較少，感的材料較多，其次分別為中抗、抗以及高感材料。受害率≤10%的高抗材料有20份，占8.55%：受害率gt;10%～30%的抗性材料有40份，占17.09%：受害率gt;30%～50%的中抗材料54份，占比23.08%：受害率gt;50%～70%的感的材料有91份，占38.89%；受害率gt;70%的高感的材料有29份，占12.39%。48.72%的材料表現出中抗及以上，感及高感材料共占51.28%。

2.3玉米葉片SPAD值及玉米受害率全基因組關聯分析

全基因組關聯分析結果（圖3、圖4）顯示，共檢測到62個莠去津藥害脅迫下與SPAD值和受害率顯著相關的QTNs。與SPAD值相關的顯著QTNs有35個，分別位于玉米的1、3、4、5、6、7、8、9號染色體上，其中1號染色體上有10個，3號和6號染色體上各有5個，4號染色體上有8個，5、8號和9號染色體上各有2個，7號染色體上有1個。與玉米受害率顯著相關的QTNs位點有27個，分別位于玉米的1、2、3、4.8、9、10號染色體上，其中1號染色體上有7個，2、8、9號染色體上各有3個，3號染色體上有2個，4號染色體上有5個，10號染色體上有4個。其中PZE-104041162和PZE-104041163為兩性狀中均定位到的QTNs位點。

2.4玉米抗莠去津相關候選基因預測

針對鑒定出的62個玉米抗莠去津除草劑相關性狀顯著性QTNs位點，分別在目標位點上、下游各50 kb范圍內篩選候選基因。結合基因功能注釋，共挖掘出57個與玉米抗莠去津相關的候選基因，其中，與SPAD值相關的基因23個，與玉米受害率相關的基因34個，含未知功能基因19個。其中，候選基因GRMZM2C030768由共定位QTNsPZE-104041162和PZE-104041163共同篩選到，編碼SWI/SNF及基質相關的肌動蛋白依賴性染色質亞家族A成員3-樣3調節因子：候選基因GRMZM2C311465編碼超敏反應蛋白2（HIR2），GRMZM2C017536編碼DUF4378結構域蛋白，GRMZM2G172826編碼細胞色素P45071A1，GRMrZM2G129431編碼鋅指相關蛋白，GRMZM2G334791編碼絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（SAPK4）、GRMZM2G177878編碼SR01蛋白，這些基因主要參與植物生長發育、植物免疫、植物激素信號傳導的調節，生物脅迫以及非生物脅迫響應過程等；GRMZM2C064962、GRMZM2C457309、GRMZM2G157010等19個功能基因未知。各候選基因信息見表4。

3討論與結論

本研究共鑒定出62個與玉米抗莠去津除草劑相關性狀顯著關聯的QTNs（Plt;0.001），分析獲得相關候選基因57個。其中候選基因GRMZM2G311465編碼HIR2蛋白，參與植物免疫反應、花青素合成、生物脅迫以及非生物脅迫應答等過程。Nadimpalli等在玉米中發現Zm-HIR2與植物抗病反應相關，參與植物防御；在擬南芥中，AtHIR2參與RPS2復合物的形成、RPS2介導的ETI反應，以及對丁香假單胞菌的抗性：在蘋果中，MdHIR2與MdJA22互作可增強JAZ蛋白的穩定性從而抑制花青素的合成。候選基因GRMZM2G017536在擬南芥中參與脫落酸信號傳導調控，Koops等發現其參與擬南芥的激素調控應答，不僅多方面調控植物發育，還參與植物對溫度、干旱、滲透和鹽脅迫的應答。候選基因GRMZM2G172826編碼細胞色素P45071A1，植物細胞色素P450主要參與生物合成與生物解毒途徑。CYP71A1的首次報道是在鱷梨中，編碼一個與果實成熟相關的酶，Chen等研究發現水稻在使用五氟磺草胺除草劑后45071A1被過表達和誘導。候選基因GRMZM2G129431編碼光系統Ⅰ的PSI-H亞基，Lunde等研究表明在缺乏PSI亞基PSI-H的情況下，捕光天線蛋白無法將能量轉移到光系統Ⅰ，并且狀態轉換受損。Varotto等發現敲除PSI-H的擬南芥葉片較野生型顏色淺，其葉綠素含量相對減少，生長速度顯著降低，在逆境脅迫下可能導致植物受到更嚴重的影響。候選基因GRMZM2G334791編碼的SAPK4是響應代謝、生物和非生物脅迫信號轉導的關鍵元件。Diedhiou等通過培養過表達SAPK4的轉基因水稻發現，誘導SAPK4的表達可以促進鹽脅迫下種子的萌發與成熟植株的生長發育。鹽脅迫下，過表達SAPK4的水稻Na+和Cl-積累量減少，光合作用改善。候選基因CRMZM2G177878在植物的生長發育，應對干旱、冷、氧化、鹽堿以及重金屬等非生物脅迫中發揮著重要作用。候選基因GRMZM2G030768編碼SWI/SNF及基質相關的肌動蛋白依賴性染色質亞家族A成員3-樣3調節因子，屬于SWI/SNF蛋白家族，與染色體重塑相關，主要參與植物營養生長、生殖發育、植物激素信號傳導的調節以及非生物脅迫響應過程，其具體功能尚未可知。這些QTNs可作為后續玉米種質抗莠去津改良的分子標記，所分析的基因可能是影響玉米對莠去津抗性的重要候選基因，為開發玉米抗莠去津分子標記、深入研究基因功能等提供重要靶標。