奶山羊睪丸支持細胞分離培養與鑒定

關鍵詞：奶山羊；睪丸支持細胞；分離培養方法；鑒定；超微結構

中圖分類號：S827 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）11-0141-07

奶山羊為重要的奶畜之一，近年來隨著人們對奶類食品需求的增加，奶山羊養殖業得到快速發展。據聯合國糧農組織（FAO）數據顯示，2020年全球奶山羊存欄量為220 92.14萬只，產奶量達206 2.96萬噸，而且增產增量趨勢明顯。改善雄性奶山羊繁殖性能對于加快遺傳改良、優化繁殖管理、提高產業經濟效益具有重要意義。

睪丸是哺乳動物雄性生殖系統的重要組成部分，睪丸曲細精管復層上皮是產生精子的部位，由生精細胞和支持細胞（Sertoli cells，SCs）構成，其中SCs可為生精細胞提供營養、支持和保護，對維持精子正常發生具有重要意義。體外分離培養SCs可以模仿睪丸內部生理條件，同時可避免與周圍細胞間相互作用，有助于更好地探究雄性生殖系統的生理過程及調控機制，目前已廣泛應用于生殖毒理學、生殖內分泌學、發育生物學等方面的研究。

目前關于SCs分離培養方法的報道主要集中在人、小鼠、豬以及牛中，關于奶山羊的報道較少，且已報道的奶山羊SCs分離培養方法存在分離步驟繁瑣、細胞純度較低以及培養狀態不穩定等問題，在一定程度上制約了對奶山羊雄性生殖系統的深入研究。因此，本研究以莎能奶山羊為實驗動物對其SCs進行分離培養，比較了三種常用酶消化法的分離效率，并采用形態學及分子生物學技術對培養效果進行評估，旨在尋求經濟、高效、可持續培養的奶山羊SCs分離培養方法，為深入開展奶山羊雄性生殖機能研究提供材料支撐。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 2023年3月在陜西省千陽縣種羊場選出6只2月齡、體重（10.33+1.00） kg、健康的雄性莎能奶山羊，用于睪丸采集。本研究經西北農林科技大學實驗動物倫理委員會審查批準（批準編號：DY2023033）。

1.1.2主要試劑 膠原酶Ⅳ、胰蛋白酶、透明質酸酶Ⅱ和DNase Ⅰ購自美國Hyclone公司；細胞專用培養基（DMEM-F12）購自美國Sigma公司；胎牛血清（FBS）購自美國Zeta Life公司；兔抗WT1、鼠抗Vimentin、DAPI購自美國Abcam公司；熒光標記二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司：臺盼藍染色液、三抗（青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合溶液）、細胞增殖毒性檢測試劑盒（cell counting

kit-8，CCK-8）、蘇木素-伊紅染色試劑盒、油紅0染色試劑盒、中性樹膠、抗熒光猝滅封片劑購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器 倒置熒光顯微鏡為德國Zeiss公司產品：研究級正置顯微鏡為日本Nikon公司產品：透射電子顯微鏡為美國FEI公司產品：自動熒光顯微鏡、超薄切片機為德國Leica公司產品；生物安全柜、細胞培養箱和CountessⅡ自動細胞計數儀均為美國Thermo Scientific公司產品。

1.2試驗方法

1.2.1奶山羊睪丸支持細胞的分離 取莎能奶山羊睪丸組織，立即放人含2%三抗的PBS中清洗2min，之后轉到生物安全柜中操作。剝離睪丸被膜后將其均等分成三份放人50mL離心管中，分別標為A、B、C三組，將每組的睪丸組織剪成約1mm3組織塊，放入含2%三抗的PBS中清洗2次，各組加入不同的酶進行消化。所有試劑均37℃預熱后使用。

A組（胰酶消化法）：將DMEM-F12培養基與0.25%胰酶等體積混合，配制0.125%胰酶消化液。睪丸組織加入0.125%胰酶消化液5mL，置于37℃振蕩水浴鍋中消化30 min。

B組（兩步酶消化法）：使用DMEM-F12培養基配制1mg/mL的膠原酶Ⅳ消化液。睪丸組織加入1mg/mL膠原酶Ⅳ消化液5 mL，置于37℃振蕩水浴鍋中消化40 min;隨后加入完全培養基（DMEM-F12培養基+10%胎牛血清+1%三抗，下同）清洗3遍，1000r/min離心5 min后加入0.25%胰酶，于37℃振蕩水浴鍋中消化15min。

C組（兩步混合酶消化法）：使用DMEM-F12培養基配制兩種酶混合液，酶混合液Ⅰ為1mg/mL膠原酶Ⅳ+1mg/mL透明質酸酶Ⅱ等體積混合，酶混合液Ⅱ為0.25%胰蛋白酶+5μg/mLDNase Ⅰ等體積混合。睪丸組織加入5 mL酶混合液Ⅰ，置于37℃振蕩水浴鍋中消化30 min;完全培養基清洗，1000r/min離心5 min后加入5mL酶混合液Ⅱ，于37℃振蕩水浴鍋中消化15min。

各組消化完成后，分別加入完全培養基終止消化，使用200目細胞過濾器過濾，1000r/min離心5 min，棄上清；用完全培養基重懸細胞，接種到培養皿中，置于細胞培養箱中培養（35℃，5%CO₂。下同）。

1.2.2細胞計數 取2.5mL剛分離的細胞懸液與2.5 mL 0.4%臺盼藍染色液混合均勻，倒置顯微鏡觀察并進行細胞計數。

1.2.3 CCK-8檢測細胞活率 將細胞懸液濃度調整為2xl05個/mL，接種于96孔板中，每孔100μL，每組設置5個重復，每間隔24 h進行一次CCK-8檢測。具體操作為：每孔加入CCK-8試劑10μL，置于細胞培養箱中孵育2h，用多功能酶標儀測定波長450 nm下的吸光度值。

1.2.4細胞純化 選擇B組分離的細胞進行培養，4h后棄掉培養液，加入新鮮的完全培養基，以去除精原細胞、間質細胞等雜細胞。于第一次傳代前加入20 mmol/L Tris-HCl低滲處理3 min，去除多余生殖細胞。

1.2.5細胞傳代培養 細胞鋪至70%～80%時，棄去培養液，PBS清洗2遍，加入0.25%胰酶，于顯微鏡下觀察，當大量支持細胞縮成圓形時加入完全培養基終止消化。收集細胞懸液，離心去除胰酶，加入完全培養基重懸細胞，調整細胞濃度至1x10⁶個/mL并接種至培養皿中，置于細胞專用培養箱中培養。

1.2.6細胞形態觀察 通過倒置熒光顯微鏡觀察培養0、3、5、7d以及傳代至第2、3、6代的細胞形態特征。

1.2.7 HE染色觀察 取分離培養并傳代至第3代的SCs接種到鋪有細胞爬片的12孔板中，待細胞鋪至70%～80%時，棄去培養基，PBS清洗3遍后用4%多聚甲醛固定液于室溫下固定15 min，PBS清洗3遍。HE染色，脫水，封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.8油紅O染色 用1.2.7中的方法制作細胞爬片，用60%油紅O染色液進行染色，蘇木素復染，自來水反藍，甘油封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.9免疫熒光染色 用1.2.7中的方法制作細胞爬片，0.1% Triton X-100室溫孵育30 min，PBS洗3遍；5% BSA室溫封閉30 min后，分別加入一抗Vimentin（1：500）和WT1（1：300），4℃過夜孵育；PBST清洗3遍，加入對應種屬的熒光二抗，室溫避光孵育2h;PBST清洗3遍，加入DAPI避光孵育5 min;抗熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.10透射電子顯微鏡 取傳代培養至第3代的SCs，1000r/min離心5 min清洗，2.5%戊二醛固定12h;PBS漂洗3遍，鋨酸固定4 h；梯度濃度乙醇脫水，梯度濃度LR White滲透并包埋：超薄切片機切取80 nm切片，并附于銅網上；鈾鉛染色，室溫干燥，透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.3數據統計分析

試驗數據以“平均值±標準誤”表示，使用SPSS 20.0軟件進行分析，獨立樣本t檢驗進行差異性比較，以Plt;0.05為差異顯著性判斷標準。

2結果與分析

2.1不同酶消化法分離的奶山羊睪丸支持細胞活性

分別采用胰酶消化法（A組）、兩步酶消化法（B組）和兩步混合酶消化法（C組）分離莎能奶山羊SCs，并利用臺盼藍染色法檢測三種分離方法獲得的細胞密度和活率。結果顯示：胰酶消化法獲得的細胞密度為（81.2+1.61） ×10⁵個/mL，顯著低于兩步酶消化法的（91.63+1.94）×10⁵個/mL和兩步混合酶消化法的（92.74+2.26）×10⁵個/mL（Plt;0.05）（圖1A）；兩步酶消化法和兩步混合酶消化法所獲細胞活率分別為（97.84+0.65）%和（97.38±0.88）%，均顯著高于胰酶消化法的（89.85±1.45）%（Plt;0.05）（圖1B）。進一步通過CCK-8法檢測三種分離方法所獲細胞的增殖能力，結果（圖1C）顯示，隨著培養時間延長，三種分離方法得到的SCs增殖曲線呈典型“S”形，符合正常細胞增殖規律：三種消化法分離獲得的細胞均于3d時進入對數生長期，6～7 d增殖速度減慢，進入生長平臺期，但相較于兩步酶消化法和兩步混合酶消化法，胰酶消化法獲得的細胞增殖活力較低。綜合來看，兩步酶消化法得到的細胞活力較好且步驟較為簡便，因此選擇兩步酶消化法進行后續SCs培養效果的評估。

2.2不同培養階段奶山羊睪丸支持細胞形態特征

利用差速貼壁法對兩步酶消化法獲得的SCs進行純化，并連續傳代培養，在第一次傳代前使用Tris-HCl緩沖液低滲處理進一步去除生殖細胞。倒置顯微鏡觀察不同時期細胞形態，結果顯示：剛分離的細胞呈圓形，體積較小，折光性強（圖2A）；第3天時，大部分細胞已貼壁，細胞呈梭形，體積增大，并有多邊形或星狀突起（圖2B）；第5天時，細胞已鋪滿培養皿底的95%，細胞形態為扁平狀，細胞質增多，體積增大，折光性減弱（圖2C）；第7天時，細胞已經完全鋪滿培養皿底，細胞形態與第5天時相似（圖2D）。傳代至第2代，細胞貼壁穩定，分布均勻，排列緊密，相互連接呈片狀（圖2E）；傳代至第3代，細胞貼壁速度變快，細胞形狀更為扁平（圖2F）；傳代至第6代，細胞貼壁速度變慢，細胞體積減小，細胞突起萎縮，部分細胞可見細胞質空泡化、細胞核固縮（圖2G）。

2.3奶山羊睪丸支持細胞HE、油紅O染色及免疫熒光染色

取傳代培養至第3代的SCs進行染色鑒定。HE染色結果（圖3A、B）顯示：細胞形狀不規則，具有一個或多個較粗的突起，且突起相互連接；細胞質豐富，細胞核呈圓形或橢圓形，位于細胞質中央，細胞核中可觀察到雙極小體。油紅O染色結果（圖3C、D）顯示：細胞質中分布大小不一的脂滴，多位于細胞核周圍或胞質兩極。免疫熒光染色結果（圖4）顯示：WT1蛋白特異性表達于SCs的細胞核中：Vimentin蛋白覆蓋細胞質，并環繞著細胞核，構成細胞骨架。細胞計數WT1和Vimen-tin抗體陽性率為（96.8±0.2）%。上述結果表明兩步酶消化法所獲細胞為SCs且純度高。

2.4奶山羊睪丸支持細胞超微結構

透射電鏡觀察第3代SCs，結果（圖5）顯示：細胞結構完整，呈不規則圓柱形。細胞質內細胞器豐富，線粒體呈管狀，嵴結構清晰，形態結構完整；內質網數量較多且結構完整，滑面型內質網和粗面型內質網相延續；溶酶體多有髓鞘樣結構；高爾基體發達，可見分泌囊泡。細胞核大且明顯，形狀不規則，染色質密度低，染色較淺，核仁明顯，具有睪丸SCs特有的結構——雙極小體。上述結果符合SCs超微結構特征。

3討論與結論

體外培養SCs是研究雄性生殖機理的基礎技術，為深入探究和闡明雄性生殖系統相關問題提供重要科研材料。本研究以2月齡雄性莎能奶山羊為試驗動物，比較不同酶消化法分離SCs的效率，并評估SCs培養效果，旨在選出一種經濟、高效的奶山羊SCs分離培養方法。

已有的SCs分離方法包括機械分離法和酶消化法兩種。機械分離法會對細胞膜造成嚴重損傷，且分離效率較低，因此很少使用。而酶消化法能夠利用酶特異性消化的特點溫和分離細胞，具有保持細胞較高活力和維持細胞膜完整性等優點，被廣泛使用。楊璐等采用胰酶消化法分離新生黑山羊SCs;Zhang等利用兩步酶消化法（膠原酶Ⅳ+胰酶）分離得到純度較高的山羊SCs;Su等通過更為復雜的兩步混合酶消化法（膠原酶Ⅳ與透明質酸酶混合液+胰酶與DNase Ⅰ混合液）成功分離了絨山羊的SCs.并用于長期培養與研究。本研究比較了上述三種酶消化法分離莎能奶山羊SCs的效果，結果表明，兩步酶消化法與兩步混合酶消化法所獲細胞數量、細胞活率和細胞增殖力均顯著高于胰酶消化法。而胰酶容易過度消化，破壞細胞膜表面的膜蛋白，對細胞造成較大損傷，這可能是單獨使用胰酶消化分離奶山羊SCs效果較差的原因。兩步酶消化法與兩步混合酶消化法分離奶山羊SCs的效果相似，但兩步混合酶消化法需要酶種類較多，成本較高，相比之下兩步酶消化法的可操作性與經濟性較好，為三種方法中的最佳方法。

剛分離的原代SCs常會有生殖細胞污染，需對其進行純化處理。常用的SCs純化方法有差速貼壁法和Tris-HCl低滲法兩種。差速貼壁法利用SCs貼壁能力較強的特性去除雜細胞，Tris-HCl低滲法則是利用其低滲耐受性去除生殖細胞。高藝等利用差速貼壁法獲得了純度較高的江香豬SCs，王亞營采用Tris-HCl低滲法去除了牦牛SCs中的生殖細胞：劉博通過差速貼壁法結合Tris-HCl低滲法獲得了高純度的小鼠SCs。本研究在原代SCs培養4h后使用差速貼壁法進行純化，并在第一次傳代前使用20 mmol/LTris-HCl（pH=7.4）處理，純化后的細胞經鑒定純度大于96%，表明該種方法可獲得高純度的奶山羊SCs。

形態學觀察是衡量SCs生長特性的重要方法。本研究利用倒置顯微鏡對兩步酶消化法分離的細胞進行觀察，發現分離的細胞具有典型SCs形態，且在連續傳代培養至第5代時仍保持正常SCs形態。鑒定SCs常用的方法有染色法和免疫學方法。HE染色后可明顯觀察到SCs形態和細胞核內深著色的雙極小體，油紅0染色能將富含脂滴的SCs與生殖細胞區分開，因此常采用HE和油紅O染色鑒定SCs。免疫學方法則是通過免疫組化或免疫熒光等手段檢測SCs的特異性標志蛋白，例如Wilms腫瘤蛋白1（WT1）和波形蛋白（Vimentin）等。本研究通過HE染色、油紅0染色以及WT1和Vimentin免疫熒光染色對傳代培養至第3代的SCs進行鑒定。HE染色和油紅O染色觀察到的細胞呈不規則形狀，細胞核內有雙極小體，細胞質中存在大小不一的脂滴等SCs典型特征。與王雪等的染色結果相似，WT1綠色熒光特異性表達于SCs細胞核，Vimen-tin綠色熒光特異性表達于細胞骨架。超微結構是判斷SCs生物學特性的重要指標。本研究利用透射電子顯微鏡觀察第三代SCs超微結構，結果顯示SCs結構完整，內含豐富的細胞器，與Shi等觀察到的黑山羊SCs超微結構一致。以上結果表明，兩步酶法分離得到的細胞具有典型SCs的形態特征，可用于后續支持細胞體外培養研究。

綜上，兩步酶消化法（膠原酶Ⅳ+胰酶）可獲得數量多、活力好、純度高且形態特點典型的奶山羊SCs，為深入開展奶山羊雄性生殖機理研究提供良好的細胞學模型。