豬病毒性腹瀉滅活疫苗保存期試驗(yàn)的研究

摘要：PEDV引起的產(chǎn)房仔豬腹瀉是目前危害養(yǎng)豬業(yè)的主要三大傳染病（ASF、PRRS、PED）之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫仍然是防控PEDV的主要手段。為保證豬病毒性腹瀉滅活疫苗在有效期內(nèi)使用是安全、高效、穩(wěn)定的，將制備的腹瀉苗置2～8 ℃保存，選擇保存0、3、6、10、13個(gè)月的疫苗進(jìn)行性狀及效力檢驗(yàn)。結(jié)果表明，保存13個(gè)月內(nèi)疫苗性狀穩(wěn)定，免疫PEDV雙陰性豬，血清PEDV ELISA 抗體和中和抗體效價(jià)均無(wú)明顯變化，且顯著高于競(jìng)品苗。實(shí)際應(yīng)用中，疫苗按規(guī)定條件儲(chǔ)存，在有效期內(nèi)使用是有效的。

關(guān)鍵詞：PEDV；滅活疫苗；保存期

2010年底以來(lái)，由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diahorrea virus，PEDV）GⅡ群毒株引起的新生仔豬“頑固性腹瀉”，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的三大傳染病（ASF、PRRS、PED）之一[1]。該病主要危害新生仔豬，臨床表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、脫水、消瘦、死亡，以7日齡內(nèi)仔豬發(fā)病最為嚴(yán)重，發(fā)病率與死亡率可高達(dá)100%[2]。生長(zhǎng)育肥豬感染后也有發(fā)病，死亡率低[3]，但可長(zhǎng)期排毒，是豬場(chǎng)發(fā)病的病毒來(lái)源之一。疫苗免疫仍然是防控PEDV的主要手段。本研究通過(guò)監(jiān)測(cè)腹瀉苗在2～8 ℃保存不同時(shí)間的質(zhì)量情況，為疫苗在有效期內(nèi)的有效使用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 疫苗

止瀉威0、止瀉威3、止瀉威6、止瀉威10、止瀉威13由廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司提供。

競(jìng)品1-6與競(jìng)品2-5是從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的同類產(chǎn)品，均在有效期內(nèi)，分別保存6個(gè)月、5個(gè)月。

1.2 細(xì)胞及主要試劑

Vero細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

3～5周齡PEDV抗原、抗體雙陰性斷奶仔豬（三元雜）。

2 方法

將腹瀉疫苗置2～8 ℃保存，選擇保存0、3、6、10、13個(gè)月的疫苗進(jìn)行性狀及效力檢驗(yàn)。

2.1 性狀檢驗(yàn)

肉眼觀察，疫苗應(yīng)未出現(xiàn)異常。

2.2 免疫效力檢驗(yàn)

選3～5周齡PEDV抗原、抗體雙陰性斷奶仔豬40頭，平均分8個(gè)組，5頭/組。每個(gè)保存時(shí)間段的疫苗頸部肌肉注射5頭，免疫劑量2 mL/頭。14 d后，所有豬以相同劑量及免疫方式進(jìn)行二免。所有豬每周分別采血，分離血清，測(cè)ELISA抗體效價(jià)和中和抗體效價(jià)。同時(shí)選擇兩個(gè)競(jìng)品苗作為對(duì)照。

1）試驗(yàn)分組及免疫方案見(jiàn)表1。

2）血清ELISA抗體檢測(cè)。采用奧睿特PEDV IgG抗體診斷試劑盒（購(gòu)自國(guó)研科技）檢測(cè)血清PEDV IgG抗體，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3）血清中和抗體檢測(cè)。測(cè)定PEDV病毒含量的具體操作步驟為：在EP管中用維持液將病毒液作10倍系列稀釋，從10-1至10-8，維持液為含5 ？滋g/mL胰酶的無(wú)血清DMEM；用維持液將96孔板中的vero細(xì)胞單層洗滌2次，取10-5至10-8稀釋度的病毒液接種到洗滌好的vero細(xì)胞孔中，每一稀釋度接種一列共8孔，每孔100 ？L；同時(shí)設(shè)8孔正常細(xì)胞對(duì)照，細(xì)胞對(duì)照孔的vero細(xì)胞單層同樣先用維持液洗滌2次，再在每孔中加入100 ？滋L維持液。將96孔板置37 ℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d，每天觀察并記錄細(xì)胞病變。按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

中和抗體檢測(cè)方法：在EP管中用DMEM將血清做連續(xù)2倍系列稀釋，從2-1至2-10；在EP管中加入500 μL不同稀釋度的血清，再加入500 μL 100 TCID50/0.1 mL的病毒液，混勻，37 ℃中和60 min；取長(zhǎng)滿單層vero細(xì)胞的96孔板，倒去上清液，用維持液洗板2次，維持液為含5 μg/mL胰酶的DMEM；每孔加入200 μL中和液，每個(gè)血清稀釋度接4個(gè)孔，37 ℃吸附60 min；倒去吸附液，用維持液洗板2次，加入維持液100 μL/孔。放置37 ℃培養(yǎng)5～7 d觀察細(xì)胞病變情況并記錄。同時(shí)設(shè)病毒對(duì)照和陰性血清對(duì)照。根據(jù)細(xì)胞病變程度，用Reed-Muench法計(jì)算50%血清中和終點(diǎn)。

3 結(jié)果

3.1 性狀檢驗(yàn)

將腹瀉滅活疫苗置2～8 ℃保存，保存0、3、6、10、13個(gè)月的疫苗未出現(xiàn)異常，性狀均符合要求。

3.2 免疫效力

1）血清ELISA抗體結(jié)果。將腹瀉疫苗置2～8℃保存，選擇保存0、3、6、10、13個(gè)月的疫苗進(jìn)行效力檢驗(yàn)。選用3～5周齡PEDV雙陰性斷奶豬，免疫劑量2 mL/頭，一免后14 d以相同劑量及免疫方式進(jìn)行二免。所有豬在一免后7 d、14 d、二免后7 d、14 d采血，用奧睿特PEDV IgG抗體診斷試劑盒檢測(cè)血清PEDV IgG抗體。結(jié)果表明，13個(gè)月內(nèi)不同保存時(shí)間段的腹瀉滅活苗的免疫血清的ELISA抗體未發(fā)生明顯變化，且顯著高于競(jìng)品苗。具體見(jiàn)圖1。

2）血清中和抗體結(jié)果。將腹瀉疫苗置2～8 ℃保存，選擇保存0、3、6、10、13個(gè)月的疫苗進(jìn)行效力檢驗(yàn)。選用3～5周齡PEDV雙陰性斷奶豬，免疫劑量2 mL/頭，一免后14 d以相同劑量及免疫方式進(jìn)行二免。所有豬在二免后14 d采血，用PEDV MJ株測(cè)中和抗體水平。結(jié)果顯示，2～8 ℃保存0、3、6、10、13個(gè)月的腹瀉滅活苗的免疫血清的中和抗體水平未發(fā)生明顯變化，且顯著高于競(jìng)品苗。具體見(jiàn)圖2。

4 討論

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diahorrea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒引起的一種感染豬以嘔吐、腹瀉、脫水、厭食和迅速消瘦為主要特征的高度接觸性腸道傳染病[4]。在自然條件下，PEDV通過(guò)口鼻途徑進(jìn)入豬體內(nèi)，各種年齡和品種的豬都有易感性，但對(duì)哺乳仔豬和育肥豬的危害更大，尤其對(duì)哺乳仔豬危害最為嚴(yán)重，發(fā)病率可達(dá)100%，病死率為30%～80%。PED呈世界范圍性流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)于PED的防控，疫苗免疫是比較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的手段。

本研究通過(guò)監(jiān)測(cè)腹瀉苗在2～8 ℃保存不同時(shí)間的質(zhì)量情況，為疫苗在有效期內(nèi)的有效使用提供數(shù)據(jù)支持。本研究將5批豬腹瀉滅活疫苗置2～8 ℃保存，選擇保存0、3、6、10、13個(gè)月的疫苗進(jìn)行性狀及效力檢驗(yàn)。結(jié)果表明，疫苗保存13個(gè)月時(shí)，性狀均符合要求；免疫斷奶仔豬后免疫效力無(wú)明顯變化。這些試驗(yàn)結(jié)果也間接驗(yàn)證了疫苗生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，疫苗按規(guī)定保存條件2～8 ℃儲(chǔ)存[5]，在有效期12個(gè)月內(nèi)使用無(wú)任何質(zhì)量問(wèn)題，可放心使用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 何玲，鐘采靈，王鳳國(guó)，等.豬病毒性腹瀉滅活疫苗對(duì)仔豬保護(hù)力研究[J].中國(guó)動(dòng)物保健，2023，25（12）：108-109.

[2] WANG D， FANG L， XIAO S. Porcine epidemic diarrhea in China[J]. Virus Res， 2016， 226：7-13.

[3] 應(yīng)碧云，朱利塞，向蕊，等.豬流行性腹瀉及其疫苗研究現(xiàn)狀[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2022，47（5）：35-39.

[4] 郭振剛，胡江鋒，王婷，等.豬流行性腹瀉病毒分離鑒定及其滅活疫苗的研制[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2021，42（2）：26-33.

[5] 王艷慧.淺析獸用疫苗的保管與使用[J].飼料博覽，2019（4）：78.

收稿日期：2024-02-05

作者簡(jiǎn)介：何玲（1983— ），女，碩士，主要從事動(dòng)物疫苗研發(fā)與推廣工作。

*通信作者