假單胞菌與褐藻寡糖協同提高梨果實產量及品質

關鍵詞： 根際促生菌； 生物刺激素； 褐藻寡糖； 梨； 產量； 品質

隨著全球對可持續農業發展的關注不斷加強，減少化肥使用并提高作物對環境脅迫的適應能力成為當前研究的重點。在這一背景下，生物刺激素的開發和應用受到了廣泛關注。歐洲生物刺激劑工業委員會（EBIC） 將生物刺激素定義為：一種施用至種子、作物或根際后能夠刺激其自然生長過程，能增強作物養分吸收、肥料利用效率、對非生物脅迫的耐受性，進而提高品質和產量的物質，分為微生物型和非微生物型[1]。非微生物型生物刺激素主要包括腐植酸、氨基酸、幾丁質及其衍生物、海藻提取物、蛋白水解物等物質。5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）和γ-氨基丁酸（GABA） 作為非蛋白氨基酸，已被證實可顯著促進作物光合效率和生長性能，提高作物應對低溫、干旱、鹽堿等逆境的能力，提升產量和果實品質[2?6]。海藻提取物中富含的多糖（如海帶多糖、卡拉膠和海藻酸鹽） 及甾醇和含氮化合物（如甜菜堿和植物激素），均對促進作物生長發揮積極作用[7]。褐藻寡糖（AOS） 作為一種新型海藻提取物，其分子量低、黏性小和生物活性強，已證實在抵抗非生物脅迫和提高果實品質方面具有重要作用[8?9]并延長果實貨架期[10]。微生物型生物刺激素是指根際促生細菌、促生真菌等微生物。王中華等[11]研究發現，施用酸快生芽孢桿菌可以有效改善土壤養分，提高花生和玉米產量與品質。趙興麗等[12]研究表明，鉤狀木霉對辣椒具有促生作用，根際施用后顯著提高辣椒幼苗的根長及生物量。面對復雜的土壤環境和多種非生物脅迫時，實驗室條件下分離到的根際高效促生菌株在施入土壤后通常效果減弱或消失，如何增強功能菌的根際定殖是田間效果穩定性的關鍵，其中既可發揮對植物的促進作用又有利于功能菌生長的非微生物型生物刺激素越來越受到關注。Sani等[13]發現，海藻提取物和木霉的配合使用可顯著改善番茄生長和果實品質，施用復合生物刺激素效果更穩定。本研究以從梨樹根際分離獲得的土著促生菌株和促進梨苗生長的非微生物型生物刺激素為切入點，探究其復配對梨苗或梨果實產量和品質的影響，探討復合型生物刺激素有利于促生菌在根際定殖從而穩定發揮功能的可能機制，為減少化肥施用及微生物肥料研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

生物刺激素：褐藻寡糖（AOS）、5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）、γ-氨基丁酸（GABA），均為廣西漢和生物科技股份有限公司惠贈，其質量濃度分別為300、40、400 g/L。

根際促生菌：從梨樹根際分離、篩選的128 株具有產IAA 能力的土著細菌。

植物材料：杜梨（Pyrus betulifolia Bunge）、豐水梨（Pyrus pyrifolia Nakai. cv. Hosui）。

1.2 試驗方案

1.2.1 梨樹根際促生菌的篩選 1） 杜梨育苗 杜梨種子在去離子水中浸泡12 h 后，用75% 酒精浸泡1 min，無菌水沖洗3～5 次，2% （v/v） 次氯酸鈉溶液浸泡15 min，無菌水沖洗5 次。消毒好的杜梨種子均勻地平鋪在滅菌的紗布上催芽3～5 天，挑選萌發的種子點播于滅菌的穴盤基質中，至杜梨長出3 片真葉時移栽至滅菌基質中。

2） 梨樹根際促生菌的篩選與驗證 將128 株細菌在TSA 培養基上進行分離與純化。選取純化后的單菌落，將其轉接至T SB 液體培養基中，并在28℃、170 r/min 的條件下培養過夜以活化菌株。取10 μL 活化后的菌懸液分別點接到4 種不同的專用培養基（阿須貝固氮培養基、亞歷山鮑羅夫解鉀培養基、蒙金娜有機磷培養基以及PKO 無機磷培養基）上，每株菌設3 次重復。接種后的培養基在28℃ 條件下培養7 天。根據菌株在培養基中形成的透明圈直徑（D） 與菌落直徑（d） 的比值評估菌株的促生特性。存在透明圈（即D/d 比值大于零） 標識為“+”，表明菌株具備相應的能力；若無透明圈形成，則標記為“?”，表示菌株在該條件下不具備相應的能力，統計各菌株功能的數量。為進一步驗證篩選到的多功能細菌對梨苗的促生作用，進行滅菌基質盆栽接菌試驗。設置單細菌菌液接種處理，以不接種為空白對照（CK），每個處理12 次重復。梨苗移栽1 周后接種細菌懸液（終濃度為 107 CFU/g 基質），培養 30 天后收獲。

3） 菌株分子生物學 16S rDNA 鑒定及系統發育樹構建 純化篩選所得的梨樹根際促生菌，由生工生物工程（上海） 股份有限公司南京分公司進行PCR 擴增及測序。引物采用16S rDNA 擴增通用引物（27F：5'?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3'；1492R：5'?GGTTACCTTGTTACGACT T?3'）。根據 16SrDNA 基因序列的測序結果，在EzBiocloud 數據庫中進行比對分析，并利用MEGA 11 軟件采用鄰接法（neighbor-joining method） 構建系統發育樹。

1.2.2 不同種類及濃度的生物刺激素對梨苗生長的影響 生物刺激素稀釋液制備：分別取1 mL 褐藻寡糖、5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸溶液用無菌水分別稀釋1000 和2000 倍，分別簡寫為AO-1、AO-2、ALA-1、ALA-2、G-1 和G-2。梨苗培養同上，每個處理設12 次重復，生長30 天后收獲。

1.2.3 梨樹根際促生菌CD1 與褐藻寡糖單施或復配對梨苗生長的影響 以清水為對照（CK），設置單接種假單胞菌CD1、單施褐藻寡糖1：1000 稀釋液、假單胞菌CD1 與褐藻寡糖稀釋液復配4 個處理。每個處理設12 次重復，杜梨生長40 天后收獲。

1.2.4 梨樹根際促生菌CD1 與褐藻寡糖復配田間試驗

于2023 年，在江蘇省南京溧水白馬教學基地進行試驗。以4 年生“豐水”梨為試驗梨樹，以清水為對照（CK），設置單接假單胞菌CD1 菌液（終濃度為107 CFU/g 土）、單施褐藻寡糖1：1000 稀釋液、假單胞菌CD1 菌液與褐藻寡糖稀釋液復配灌根處理，分別于2023?04?14、2023?04?30、2023?05?19 在梨樹兩側采用穴施法倒入上述液體，每棵樹澆灌2 L。每個處理5 棵樹，單株為1 次重復，各處理其他田間管理條件一致。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 植物生長指標測定 分別使用卷尺和游標卡尺測定杜梨苗株高、莖粗。使用手持式SPAD 儀（KONICAMINOLTA SPAD-502Plus） 測定葉片SPAD 值。采用葉面積測定儀SYE-YM02 測定葉面積。將植株清洗干凈，地上、地下部分（根） 分開，蒸餾水沖洗表面，吸干表面水分。置于烘箱中105℃殺青30 min 后于75℃ 烘干至恒重，稱量地上部和根系干重。使用WinRHIZO 根系掃描儀分析根系形態。

1.3.2 果實品質指標測定 樣品采集：在果實成熟期8 月中旬，統計各處理下梨樹的果實數量并采集果實樣品。在每株樹冠外圍中部同等受光條件下隨機采收10 個果實用于各種指標測定。

果實品質測定：單果質量用稱重法、果實縱橫徑用游標卡尺測定；可溶性固形物含量用ATAGON-1 型折光儀測定；硬度用GY-1 型果實硬度計測定、可滴定酸含量采用滴定法[14]；果實可溶性糖含量用蒽酮比色法[15]；石細胞采用冷凍法[16]測定。

果實礦質養分含量的測定：果實中微量元素養分測定采用HNO3?HClO4 消煮法，大量元素養分采用H2SO4?H2O2 消煮，然后利用ICP-OES 儀測定分析[17]。養分積累量為養分含量與果實干重的乘積。

1.4 數據處理與分析

單株產量=平均單果重×平均果實數量；

果實含水率（%）=（果實鮮重?果實干重）/果實鮮重×100%；

果實干重（g）=果實鮮重?（果實鮮重×含水率）；

果實養分積累量=果實養分含量×果實干重。

使用Microsoft Excel 2019 進行數據整理與初步分析，統計分析采用SPSS 26.0 （IBMCorp， Armonk，USA） 和RStudio 4.2.3 軟件。使用GraphPad Prism 9軟件進行圖表繪制。利用Adobe Photoshop CS6 進行圖片處理。

2 結果與分析

2.1 梨樹根際促生菌的篩選與鑒定

2.1.1 多功能細菌篩選 如表1 所示，128 株梨樹根際初步分離到的土著菌株在固氮、解鉀、解有機磷和無機磷方面存在較大差異，其中獲得11 株多功能菌株，包括3 株具有4 種功能的菌株（GH1、EE9和GB8），7 株具有3 種功能的菌株有（CD1、GH4、GD4、QD11、QE1、NF7 和LH2），1 株具有2 種功能的菌株有（QE2）2.1.2 盆栽驗證 如表2 所示，所有接菌處理相對于對照組在莖粗、葉片SPAD 值、葉面積以及地上部和根系生物量等指標上均有不同程度的提升效果。其中，菌株CD1 在增加莖粗和葉片SPAD 值方面效果較好，與CK 相比，莖粗提高20%，SPAD 值顯著提高24.5%；菌株GB8 和CD1 使葉面積分別顯著提高51.8% 和50.6%；菌株CD1 使梨苗總生物量顯著增加60%。另外，菌株CD1 在梨苗根體積和根尖數上表現出顯著的提升效果，與CK 相比，兩指標分別提高了71.4% 和101.9%。上述結果表明，菌株CD1 在促進梨苗生長和根系發育方面效果最佳。

2.1.3 根際促生菌CD1 16S rDNA 基因同源性比較

根據 16S rDNA 的測序結果和 EzBiocloud 中已登錄的核苷酸序列進行同源性比較，發現菌株 CD1 與Pseudomonas wayambapalatensis RW3S1 （AM911665）同源性達到99.48%。系統發育樹表明，菌株CD1 與Pseudomonas wayambapalatensis RW3S1 （AM911665）位于同一分支，說明它們具有高度同源性，屬于假單胞菌屬（圖1）。

2.2 不同種類及濃度的生物刺激素對梨苗生長的影響

如圖2 所示，所有生物刺激素處理相比對照組對梨苗生長均有不同程度的促進效果，相較于5-ALA 和GABA，褐藻寡糖稀釋1000 倍（AO-1） 增加莖粗、葉面積和生物量的效果最為顯著，與CK 相比，莖粗、葉面積和生物量分別提高了2 2 . 9 %、49.4% 和38.3%。AO-1 處理也顯著促進了梨苗根系生長，與CK 處理相比，根系長度、根表面積和根體積分別顯著提高了109.1%、76.7% 和47.9%。

2.3 梨樹根際促生菌與褐藻寡糖對梨苗生長的影響

與CK 相比，單施AOS、單接CD1 以及AOS+CD1 均顯著促進了梨苗的生長和根系發生（圖3），其中AOS+CD1 復配處理效果最為顯著，相比CK，株高、莖粗、SPAD 和葉面積分別增加了114.3%、54.9%、30.1% 和107.9%，植株生物量（總干重） 顯著提高158.8%，根系長度和體積分別增加了33.7% 和65.5%；與單接CD1 和單施AOS 相比，梨苗生物量分別提高59.0% 和46.7%，根系長度分別增加23.2%和26.3% （表3）。

2.4 梨樹根際促生菌與褐藻寡糖對田間梨果實生長及品質的影響

2.4.1 對果實縱橫徑動態變化的影響 與CK 處理相比，單施AOS、單接CD1 以及AOS+CD1 均促進了不同生育期果實縱橫徑的增加（圖4），其中AOS+CD1 復配處理效果最好。相比CK，處理后43、58、73 和88 天，果實的縱徑分別增加了19.6%、19%、24.2% 和16.3%，果實橫徑分別增加了15.7%、14%、17.4% 和18.2%。

2.4.2 對單株產量和果實品質指標的影響 由圖5可知，與CK 相比，單施AOS、單接CD1 以及AOS+CD1 均可顯著增加梨單果重，增幅分別為31%、31.7%和45.5%，其中，AOS+CD1 處理對單果重提高幅度最大。所有處理均較大程度提高單株產量，其中單施AOS 和CD1 分別提高51.32% 和57.9%，而AOS+CD1 處理提升幅度達73.7%，比單接CD1 和單施AOS 處理分別提高10.0% 和14.8%。與CK 相比，單接CD1 以及AOS+CD1 均增加了果實的可溶性糖含量和糖酸比，其中AOS+CD1 復配處理效果最為顯著，相比CK，其可溶性糖含量和糖酸比分別增加了64.2% 和57.9%，果實可溶性糖含量比CD1 和AOS 處理分別提高29.0% 和61.8%。盡管單接CD1處理輕微降低了果實的可滴定酸含量（降低幅度為8.6%），但未達到顯著差異。單施AOS、單接CD1以及AOS+CD1 均顯著降低了石細胞含量，其中單接CD1 以及AOS+CD1 效果最為顯著，相比CK，分別降低了64.8% 和63.6%，相比AOS，復配處理下石細胞含量顯著降低43.1%，優于AOS 單獨應用的效果。

2.4.3 褐藻寡糖與假單胞菌對果實養分含量及積累量的影響 由圖6 可知，不同處理對“豐水”梨果實的養分含量和養分積累量均產生了顯著影響。與CK處理相比，AOS、CD1 以及AOS+CD1 復配處理在果實N、P、K、Ca、Mg、Cu、Zn 和B 元素含量上呈現不同程度的提升，其中，AOS+CD1 復配處理在提升N、P 和Ca 元素含量方面表現最為突出（圖6a）。圖6b 進一步證實了這些處理對果實養分積累量的積極影響，尤其在N、P、K、Ca、Mg 和Fe 等關鍵營養指標上，AOS+CD1 復配相較于單獨的AOS 和CD1 處理表現出更高的養分積累量。果實養分積累量由干重和養分含量共同決定，由表4 可知，復配處理下果實干重比CK 提高了52.8%，高于AOS 和CD1處理對干重的增加程度。同時，與CK 相比，復配處理使果實中大部分營養元素含量增加，而單施處理下養分含量均有不同程度降低，這表明復配處理不僅能使果實干重增加，也能同時增加果實養分含量。

3 討論

3.1 褐藻寡糖與梨樹根際促生菌具有協同作用

盡管生物刺激素的應用已在農業上取得較大進展，但在不同作物和環境條件下的最佳種類和用量仍是合理使用的關鍵。本研究探討了5-氨基乙酰丙酸、γ-氨基丁酸和褐藻寡糖對梨苗生長的促進作用，發現褐藻寡糖在1：1000 稀釋濃度下效果最佳，與馮敬濤等[18]的研究結果相一致。馮敬濤等[18]研究發現，水楊酸、脫落酸和海藻提取物處理均能緩解蘋果幼苗干旱脅迫，其中海藻提取物效果最佳，在中、重度干旱條件下顯著提高幼苗的光合速率和抗氧化能力。同樣，Rayorath 等[19]關于泡葉藻提取物對擬南芥根生長的研究也表明，生物刺激素發揮促生效應與其濃度高低有直接關系，通常情況下較低濃度有利于促進作物生長而高濃度可能抑制生長。

在土壤環境和多種非生物脅迫下，根際促生菌的效果往往不穩定，土著微生物的競爭和復雜的土壤環境條件使其難以形成占主導地位的種群并發揮有效的功能，如何增強細菌的根際定殖是田間效果穩定性的關鍵。有研究表明外源添加特定有機類物質能夠顯著促進功能菌在根際的生長和定殖，如添加樹皮藻酶解液（UPP） 可以促進細菌生物膜形成，增強菌株定殖能力[20]。卜寧等[21]研究發現，褐藻寡糖在0.625～1.25 g/L 濃度范圍對雙歧桿菌的體外生長有顯著的促進作用。本研究也發現，濃度在0.6～1.2 g/L褐藻寡糖對菌株CD1 生長表現出明顯的促進作用（數據未發表），表明在適宜濃度下CD1 可以利用褐藻寡糖作為碳源和氮源促進自身生長和代謝，有利于其在根際環境下定殖形成核心物種并發揮作用，增強其效果穩定性，暗示非微生物型生物刺激素在促進根際細菌生長定殖方面具有潛在重要作用，有待于開展進一步深入研究。

3.2 褐藻寡糖與根際促生菌的復配有利于產量和品質同步提升

大量關于根際促生菌（PGPR） 的研究表明，其對作物生長具有顯著促進作用，特別是產IAA、溶磷、解鉀、固氮的根際促生菌[22?24]。本研究中篩選的梨樹促生菌具有多種上述功能。盆栽試驗顯示，褐藻寡糖與促生菌CD1 的復配處理顯著促進梨苗生長，與王奎萍等[25]及Prittesh 等[26]關于解磷、固氮、產IAA 的促生菌活性與作物生長呈正相關性的研究結果一致。通常情況下，作物的產量和品質存在明顯的負相關關系。本研究中褐藻寡糖和根際促生菌CD1 的單獨或復配使用均能顯著提高梨樹果實的產量和品質，尤其是二者的復配不僅顯著促進果實的生長及單株產量，而且在提高可溶性糖含量、糖酸比以及降低石細胞含量方面表現突出，能夠協同提高產量和品質，這對實現高產優質的生產目標具有重要意義。本研究還發現，復配處理不僅能使果實干重增加，也能同時增加果實中大部分營養元素含量，表明有更多的光合產物和礦質元素運輸到果實，提高了植株對土壤中營養元素的吸收能力，養分利用效率得到提高。本研究中復配處理促生效果明顯的原因可能有如下幾個方面：1）功能菌CD1來自梨樹根際分離的土著菌株，從相似植物背景環境中分離出來的同源微生物具有宿主優勢效應，從而更易發揮促生作用；2）褐藻寡糖具有延緩植物衰老和調控生長素相關基因的表達，促進IAA 的合成和運輸，促進植物生長及增強根際微生物活性等功能[27]；3）褐藻寡糖促進了CD1 菌株在根際的存活或定殖，有利于CD1 功能發揮，具體促生機制有待進一步開展研究。

4 結論

本研究篩選到在梨苗或梨樹上具有顯著促生效果的假單胞菌（CD1） 和褐藻寡糖（AOS），CD1與A O S 復配可顯著促進植株生長和側根發生（ZL202311758216.X），應用于結果期梨樹上也可顯著促進梨果生長和提高產量，明顯改善果實品質，可以在生產中推廣應用。