miR-204和SIRT1在結直腸癌中的表達情況及臨床意義

[摘要]"目的"探討miR-204和沉默信息調節因子1（silence"information"regulator"1，SIRT1）在結直腸癌組織中的表達情況及其臨床價值。方法"收集2018年5月至2020年6月嘉興大學附屬醫院胃腸外科診治的60例結直腸癌患者的癌組織標本和癌旁組織標本為研究對象，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測miR-204及SIRT1的基因表達情況，Pearson分析比較miR-204與SIRT1基因的表達相關性。采用免疫組織化學SABC法檢測SIRT1蛋白表達，并比較不同SIRT1蛋白表達與臨床病理特征的關系。Kaplan-Meier法分析不同SIRT1蛋白表達的結直腸癌患者的生存差異。結果"癌組織中miR-204基因mRNA表達顯著低于癌旁組織（Plt;0.05），SIRT1基因mRNA表達顯著高于癌旁組織（Plt;0.05）。癌組織中SIRT1蛋白表達陽性率顯著高于癌旁組織（Plt;0.05）。Pearson相關分析顯示miR-204與SIRT1基因mRNA在癌旁組織和癌組織中的表達均呈負相關（r=–0.647、–0.737，Plt;0.05）。SIRT1蛋白的表達與結直腸癌的分化水平、浸潤層次、淋巴結轉移與否及TNM分期相關（Plt;0.05），與患者的年齡、性別、腫瘤大小及腫瘤部位無關（Pgt;0.05）。Kaplan-Meier分析顯示癌組織中SIRT1陽性表達患者的生存率顯著低于SIRT1陰性表達患者（χ2=5.001，P=0.025）。結論"結直腸癌組織中miR-204表達下調，SIRT1表達上調，二者可能通過相互影響共同促進結直腸癌的轉移、侵襲，并影響患者預后。

[關鍵詞]"結直腸癌；miR-204；沉默信息調節因子1；基因表達

[中圖分類號]"R735.3""""""[文獻標識碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.22.014

Expression"of"miR-204"and"SIRT1"in"colorectal"cancer"and"their"clinical"significance

HUANG"Liyong，"WU"Jiaming，"PENG"Yuping，"LI"Jin，"CHEN"Zhiheng

Department"of"Gastrointestinal"Surgery，"Affiliated"Hospital"of"Jiaxing"University，"Jiaxing"314000，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"expression"of"miR-204"and"silence"information"regulator"1"（SIRT1）"in"colorectal"cancer"and"their"clinical"value."Methods"Cancer"tissue"specimens"and"paracancer"tissue"specimens"of"60"patients"with"colorectal"cancer"treated"in"Department"of"Gastrointestinal"Surgery"of"Affiliated"Hospital"of"Jiaxing"University"from"May"2018"to"June"2020"were"collected"as"study"objects."Real"time"fluorogenic"quantitative"polymerase"chain"reaction"was"used"to"detect"the"gene"expression"of"miR-204"and"SIRT1，"and"the"correlation"between"miR-204"and"SIRT1"gene"expression"was"compared"by"Pearson"analysis."Immunohistochemical"SABC"method"was"used"to"detect"SIRT1"protein"expression，"and"relationship"between"different"SIRT1"protein"expression"and"clinicopathological"features"was"compared."Kaplan-Meier"method"was"used"to"analyze"the"survival"difference"of"colorectal"cancer"patients"with"different"SIRT1"protein"expression."Results"The"mRNA"expression"of"miR-204"gene"in"cancer"tissues"was"significantly"lower"than"that"in"paracancer"tissues"（Plt;0.05），"and"the"mRNA"expression"of"SIRT1"gene"was"significantly"higher"than"thatnbsp;in"paracancer"tissues"（Plt;0.05）."Pearson"correlation"analysis"showed"that"miR-204"was"negatively"correlated"with"SIRT1"mRNA"expression"in"both"paracancer"tissues"and"cancer"tissues"（r=–0.647，"–0.737，"Plt;0.05）."The"expression"of"SIRT1"protein"was"correlated"with"the"differentiation"level，"invasion"level，"lymph"node"metastasis"and"TNM"stage"of"colorectal"cancer"（Plt;0.05），"but"not"with"patient"age，"gender，"tumor"size"and"tumor"site"（Pgt;0.05）."Kaplan-Meier"analysis"showed"that"the"survival"rate"of"patients"with"positive"expression"of"SIRT1"in"cancer"tissues"was"significantly"lower"than"that"of"patients"with"negative"expression"of"SIRT1"（χ2=5.001，"P=0.025）."Conclusion"The"expression"of"miR-204"is"down-regulated"and"SIRT1"expression"is"up-regulated"in"colorectal"cancer"tissues，"which"may"jointly"promote"the"metastasis"and"invasion"of"colorectal"cancer"and"affect"the"prognosis"of"patients"through"mutual"influence.

[Key"words]"Colorectal"cancer;"miR-204;"Silence"information"regulator"1;"Gene"expression

中國的結直腸癌發病率居高不下，嚴重影響國人的生命健康。微RNA（microRNA，miRNA）是一種真核生物的內源性小分子單鏈非編碼RNA，可作為癌基因或抑癌基因參與惡性腫瘤的發生與演化[1]。miR-204基因是由約20個堿基合成的單鏈RNA，定位于染色體9q21，是一種重要的腫瘤調控基因，并在多種人類惡性腫瘤中異常表達，與腫瘤細胞的增殖、侵襲等多種生物學行為相關。沉默信息調節因子1（silence"information"regulator"1，SIRT1）是依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide"adenine"dinucleotide，NAD）的組蛋白去乙酰化酶，與腫瘤細胞的增殖、分化和遷移相關。目前miR-204和SIRT1在結直腸癌組織標本中的表達差異、兩者表達的相關性及對患者預后的影響尚未見明確報道。本研究擬通過對人結直腸癌新鮮冰凍組織中miR-204和SIRT1進行提取和檢測，并與入組患者的臨床資料及預后進行分析，探討兩者在結直腸癌診治中的應用價值。

1""資料與方法

1.1""資料收集

收集2018年5月至2020年6月嘉興大學附屬醫院胃腸外科診治的60例結直腸癌患者的癌組織標本和癌旁組織標本為研究對象。納入標準：①組織病理學符合《中國結直腸癌診療規范（2017年版）》[2]標準；②未行術前放化療及靶向治療；③患者或其授權人知情并同意本研究。排除標準：①合并其他惡性腫瘤者；②合并炎癥性腸病等自身免疫性腸道疾病者；③有嚴重臟器功能障礙及感染性疾病無法耐受手術者。本研究經嘉興大學附屬醫院醫學倫理委員會批準（倫理審批號：2024-LY-028）。

1.2""miR-204和SIRT1基因mRNA表達檢測

收集新鮮結直腸癌組織和癌旁組織標本（距腫瘤邊緣5cm）迅速置于凍存管中并投入液氮或–80℃冰箱中保存待測。提取總RNA純化并定量，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real"time"fluorogenic"quantitative"polymerase"chain"reaction，RT-PCR）檢測miR-204和SIRT1基因mRNA表達，檢測儀器為美國ABI公司7500型RT-PCR，引物序列見表1。反應體系共20μl（F-Primer"0.8μl；R-Primer"0.8μl；ROX"Reference"Dye"Ⅱ"0.4μl；SYBR"Premix"Ex"TaqⅡ"10μl；RNase-free"water"6μl；cDNA"2μl），反應條件設置：預變性95℃，2min；變性94℃，15s；退火55℃，15s；延伸72℃，30s。以U6作為內參，重復3個復孔，共38個循環。采用2-??Ct方法（Ct值為循環閾值）計算miR-204和SIRT1基因mRNA相對表達量。

1.3""免疫組織化學反應

結直腸癌組織和癌旁組織樣本經固定、脫水、石蠟包埋后進行連續切片，免疫組織化學法（SABC法）檢測SIRT1表達情況，PBS代替一抗作為陰性對照。SIRT1蛋白主要表達于細胞核，陽性呈棕黃色。在高倍鏡視野下隨機選取5個視野，按每張切片中陽性細胞的百分比和著色深淺計分行半定量分析（取兩項評分之和作為總積分）：0～3分為陰性（–），≥4分為陽性（+）。以上結果判斷均在雙盲法下進行。

1.4""臨床資料收集及隨訪

收集入選患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤大小和部位、組織學分級、癌浸潤層次、淋巴結轉移與否、TNM分期等。所有結直腸癌患者術后常規每3個月電話或門診隨訪1次，隨訪內容包括：患者后續診治情況、生存質量及復發死亡情況。隨訪時間截至2023年3月。

1.5""統計學方法

數據處理和分析采用SPSS"25.0軟件包。其中計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（）表示，比較采用Mann-Whitney"U檢驗；相關性采用Pearson相關性分析；預后分析采用Kaplan-Meier法。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2""結果

2.1""結直腸癌組織及癌旁組織中miR-204和SIRT1表達差異

RT-PCR結果顯示，癌組織中miR-204基因mRNA表達顯著低于癌旁組織（Plt;0.05），SIRT1基因mRNA表達顯著高于癌旁組織（Plt;0.05）。免疫組織化學結果顯示，癌組織中SIRT1蛋白表達陽性率顯著高于癌旁組織（Plt;0.05），見表2、圖1。

2.2""miR-204與SIRT1基因mRNA表達的相關性

miR-204與SIRT1基因mRNA在癌旁組織和癌組織中的表達均呈負相關（r=–0.647、–0.737，Plt;0.05），見圖2。

2.3""結直腸癌組織中SIRT1蛋白表達與臨床病理特征的關系

不同性別、年齡、腫瘤大小和腫瘤部位的結直

腸癌患者，其SIRT1蛋白表達無差異（Pgt;0.05）。對分期晚、淋巴結陽性、浸潤層次深及組織分化差的患者，其癌組織中SIRT1陽性表達比例較高（Plt;0.05），見表3。

2.4""結直腸癌組織SIRT1蛋白表達與患者生存情況的關系

隨訪13～56個月，中位隨訪時間32個月，癌組織中SIRT1陽性表達患者的生存率（22/39，56.4%）顯著低于SIRT1陰性表達患者（18/21，85.7%）（χ2=5.001，P=0.025），見圖3。

3""討論

結直腸癌的發生發展與基因突變密切相關，已有多種基因標志物廣泛用于腫瘤診斷、評估及預后判斷。研究發現miRNA可與其調控的下游靶基因的非翻譯區結合，形成RNA沉默誘導復合體促進靶基因的裂解或阻斷其蛋白翻譯等途徑影響靶基因的表達[3-4]。miR-204作為miRNA家族成員之一，已有研究指出其異常表達與食管癌、胃癌、肝細胞癌、肺癌及霍奇金淋巴瘤等多種惡性腫瘤的發生發展相關[5-11]。Shen等[6]研究指出，miR-204-5p在食管癌細胞中低表達，可通過酪氨酸3單加氧酶/色氨酸5單加氧酶激活蛋白ζ/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B途徑參與食管癌細胞的增殖、侵襲和轉移過程。在人胃癌細胞中miR-204也呈低表達，過表達miR-204可抑制胃癌細胞的增殖和侵襲從而起到抗腫瘤作用，同時低表達miR-204可激發胃癌細胞對5-氟尿嘧啶的化療療效[7-8]。本研究結果顯示，結直腸癌組織中miR-204亦為低表達，可能作為抑癌基因參與結直腸癌的發生發展。

SIRT1是依賴于NAD+的脫乙酰化酶，既往對其研究多集中在腦組織損傷、膿毒癥及炎癥性臟器損傷[12]。近年來，SIRT1在惡性腫瘤中的異常表達成為研究熱點。有學者發現SIRT1可在人體多個癌細胞株中異常表達，可通過調控上皮間質轉化（epithelial-"mesenchymal"transition，EMT）參與腫瘤細胞的增殖和侵襲[13-14]。Zhang等[15]指出SIRT1在胃癌組織中表達上調，在體外細胞實驗中發現SIRT1缺失可通過激活信號轉導及轉錄激活蛋白3/基質金屬蛋白酶13信號通路促進胃癌進展，提示SIRT1具有腫瘤抑制作用。而?zcan等[16]研究發現SIRT1在胃癌組織中高表達，其在隨訪結果中指出SIRT1基因上調與患者的不良預后相關。Han等[17]研究指出無腦轉移的非小細胞肺癌（non-small"cell"lung"cancer，NSCLC）中SIRT1的表達水平明顯低于合并腦轉移的NSCLC，推斷其可能作為腫瘤轉移的潛在標志物參與NSCLC的進展。以上研究對SIRT1參與癌癥的角色并未統一，SIRT1是癌基因還是抑癌基因尚存在爭議。本研究顯示結直腸癌組織中SIRT1蛋白及mRNA均高表達，同時SIRT1蛋白的表達情況與腫瘤分期、淋巴結是否陽性、浸潤深度及組織分化情況相關。此外，生存分析發現SIRT1高表達者預后更差，提示SIRT1可能作為致癌基因參與結直腸癌患者的腫瘤侵襲、轉移進程，并不利于患者預后。

通過檢索文獻及對SIRT1的上游miRcode基因預測發現，miR-204是調控SIRT1表達的重要基因[18]。Zhang等[19]通過螢光素酶報告指出在胃癌細胞中miR-204可通過下調SIRT1表達進而影響多種EMT相關分子的表達（如E鈣黏蛋白、N鈣黏蛋白等），從而抑制胃癌細胞的侵襲轉移，發揮其抗腫瘤效應。Shu等[20]發現miR-204可抑制靶基因SIRT1的表達促進P53乙酰化，從而增強多柔比星對前列腺癌的化療敏感度。本研究運用RT-PCR方法檢測新鮮冰凍癌組織及癌旁組織中miR-204及SIRT1的相對表達量，并進行Pearson相關性分析，結果提示兩者之間存在顯著的負相關，提示miR-204和SIRT1在結直腸癌中通過相互影響共同推動腫瘤的進展。研究表明miR-204和SIRT1的不同表達均可使其癌細胞對鉑類及氟尿嘧啶類化療藥物的敏感度出現差異[21-22]，而鉑類和氟尿嘧啶類藥物是結直腸癌內科化療的主要用藥，鑒于兩者之間存在負相關，推斷影響化療敏感度的因素主要與SIRT1相關，后期可在細胞學研究中通過調控miR-204影響SIRT1蛋白的表達水平，進一步觀察結直腸癌細胞對鉑類或氟尿嘧啶類藥物的敏感度差異，指導臨床患者的化療方案選擇。

綜上，miR-204可能作為抑癌基因參與結直腸癌的發生，通過對其下游靶基因SIRT1的調控影響腫瘤分化、侵襲和轉移，進而影響患者的預后。miR-204和SIRT1均有望成為預測結直腸癌術后鉑類及氟尿嘧啶類化療藥物敏感度的新靶點。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–02–26）

（修回日期：2024–06–26）