I亞群禽腺病毒現狀及其研究進展

摘 要：I亞群禽腺病毒近年來多地都有過相關報導，其傳播速度以及傳播范圍呈上升趨勢，給全球的養禽業造成了巨大損失。本文對禽腺病毒分類、檢測方法以及疫苗研究等進行綜述，旨在為該病的防控提供參考。

關鍵詞：I亞群禽腺病毒；流行病學；檢測方法；疫苗

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：A 文章編號：1673-1085（2024）07-0049-10

隨著現代專業化、集約化、規模化養禽業的不斷發展，我國已成為全球養禽大國，但禽病仍然是影響我國禽類成活率以及養殖經濟效益的重要因素之一，尤其是一些重大或烈性的傳染性疾病[1]。禽腺病毒（Fowl adenoviruses，FAdV）是養禽業中危害較大的一種病毒，通常會引起禽類發生包涵體肝炎（Inclusion Body Hepatitis，IBH）、心包積液綜合征（Hepatitises Hydropericardium Syndromw，HPS）以及肌胃糜爛（Gastric erosion，GE）等病變[2]，該病感染初期沒有明顯的臨床癥狀，感染2～3 d開始出現精神沉郁、食欲不振、羽毛雜亂、雙腳麻痹、排綠色糞便等癥狀。FAdV被認為是一種弱毒性的病毒，它需要與免疫抑制病毒共同感染才能導致疾病的發生[3]，使感染率更高、死亡率增加。該疾病分布廣泛，據流行病學調查表明，2013年之前我國FAdv為散在性分布，2013年之后感染病例不斷增加，2015-2016年包涵體肝炎和心包積液綜合征在全國范圍內傳播，其中蛋雞、種雞、麻雞、肉雞發病率較高[4]。2015-2022年禽腺病毒發病較為嚴重，其中山東、河北、江蘇、河南、黑龍江、云南等地均出現了病情。田甜等[5]人通過對不同省份疑似324份病例樣品進行PCR檢測，陽性檢測率為23.4%；Zhuang等[6]采集了多個省市1 920份拭子樣本，其中8.65%是來自明顯健康禽類的臨床樣本，PCR檢測結果呈陽性。禽腺病毒可以廣泛、快速的傳播，給養禽業造成了巨大的損失。本文對禽腺病毒分類、檢測方法以及疫苗研究等方面進行綜述，旨在為該病的防控提供參考。

1 "禽腺病毒概述

1.1 "禽腺病毒分類

該病毒因最開始是從腺體組織中分離，故稱為腺病毒；又根據其形態結構、免疫學特性和宿主范圍劃分為哺乳動物腺病毒屬、禽腺病毒屬[7]。禽腺病毒是一類常見的具有免疫抑制作用的病毒，可以通過種源垂直傳播。根據其抗原性的不同，分為3個亞群（I、II、III）。其中，I亞群禽腺病毒病是一種由I亞群禽腺病毒引起的病毒性疾病，I亞群禽腺病毒根據基因組序列又分為A、B、C、D、E 5個基因型，通過交叉中和試驗分析可將其分為12個血清型，其各血清型都可引起不同癥狀，如表1所示。

1.2 "形態結構

禽腺病毒（FAdV）屬于腺病毒屬，是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，基因組大小為43～45 kb，在負染色電子顯微鏡下為直徑70～90 nm的二十面體球形顆粒，核心外層的殼體由252個殼粒亞單位組成，其中240個非頂點（六鄰體Hexon）和12個頂點囊粒（五鄰體Penton），頂點殼粒帶有纖突[8-9]。Hexon、Penton和Fiber（纖突蛋白）是結構蛋白，同時還有一些非結構蛋白如33K、55K、100K、E1、E2、E3、E4等。

Hexon蛋白有P1和P2兩個功能區，同時還包含Loop1、Loop2、Loop3和Loop4四個環，Hexon在感染初期起重要作用，它具有可以中和抗體的抗原決定簇，與致病性有著密切的關系[10]。Penton和Fiber兩者密切相關，其五鄰體蛋白與細胞表面蛋白作用，使表面纖突增長，從而促進病毒侵入和內化宿主細胞。Penton具有中和活性的作用，通過組織病毒粒子從酸性核內質網進入細胞漿，該蛋白作為免疫原產生的抗體可以使病毒失活。纖突蛋白其N端與戊基非共價結合，I群禽腺病毒中FAdV-1、FAdV-4和FAdV-10都有纖突蛋白，分別為Fiber1和Fiber2，而其它血清型只有一種Fiber[11]。纖突蛋白決定病毒毒力，并且通過和細胞受體的相互作用在病毒與宿主細胞之間粘附起著重要作用[12]。

33K與衣殼的形成過程有關，是空殼病毒粒子的組成成分；55K在參與病毒組裝時基因組與殼粒間相互識別的過程中起重要作用；100K在宿主細胞病毒復制期間的蛋白運輸中發揮重要作用；E1可啟動早期基因，在對抗干擾素及腫瘤壞死細胞因子介導的細胞殺傷中起作用；E2調節并且參與病毒DNA復制。

1.3 "理化性質

禽腺病毒在環境中相當穩定，但容易被一般消毒劑滅活；凍結狀態下穩定，可在-20 ℃長期存活；耐酸，適宜pH5～6，所以在胃腸道內可保持其活性；對氯仿、乙醚等脂溶劑不敏感，而在丙酮中不穩定，0.1%甲醛就能使其失去活性[2]。

2 "禽腺病毒檢測方法

2.1 "病毒分離

2.1.1 "SPF雞胚分離法 "患病家禽的肝臟病毒載量最高，在無菌環境下采集患病家禽的肝臟，與滅菌生理鹽水以1：5的比例充分研磨成勻漿液，接種9～10日齡雞胚尿囊腔或卵黃囊內，接種后雞胚胚體出現發育遲緩、肝臟出血，并最終以胚胎死亡為結果。收集死胚，無菌收集尿囊液，過濾除菌后再盲傳3代。張騰[13]通過雞胚尿囊腔和絨毛尿囊膜兩種接種方式分離培養FAdV，以尿囊腔的接種方式獲得了FAdV，并傳至12代。王翰[14]通過雞胚卵黃囊的接種方式分離培養，最終獲得了FAdV，并傳至4代。

2.1.2 "細胞分離法 "使用LMH細胞傳代培養后，當LMH單層細胞生長到80%時，病毒懸液按照1：10的比例接種至LMH細胞并孵育，電鏡下可見感染病毒后的細胞出現CPE現象，脫落、感染的細胞內存在核內包涵體[15]：LMH細胞病變達到80%時，收獲細胞液，-80 ℃反復凍融3次，離心取上清液，將病毒懸液按照上述方法盲傳3代。魏鳳等[16]通過不同細胞培養FAdV，從而篩選出FAdV的適應性細胞，發現LMH細胞為最適宿主。趙蕾[17]等對FAdV-4 DC株在LMH細胞中的增殖條件進行了優化，為FAdV的細胞分離提供了參考。

2.2 "血清學診斷

血清學診斷是指基于抗原抗體的特異性反應來檢測抗原或抗體的方法。常用的檢測方法主要包括瓊脂擴散試驗、間接免疫熒光試驗、病毒中和試驗、酶聯免疫吸附試驗、膠體金檢測法等。各種血清學診斷方法的優缺點以及應用范圍見表2。

2.2.1 "瓊脂擴散試驗 "瓊脂凝膠免疫擴散試驗（Agar gel immunodiffusion test，AGIDT）是水溶性抗原和相應的抗體在富含電解質的半固體瓊脂凝膠內擴散，特異性結合反應生成沉淀線，通過肉眼觀察是否有一條白色的沉淀線來判斷試驗結果。智海東[19]等研制的禽腺病毒1型瓊脂擴散抗原，該抗原與其他禽類病原體的陽性血清不產生反應，但可以與禽腺病毒1型陽性血清反應；國紀壘[18]等使用禽腺病毒I亞群中12個血清型參考毒株的抗血清進行雙向瓊脂擴散試驗，對分離株的血清型進行鑒定。瓊脂擴散試驗檢測對象可以是抗原也可以是抗體，操作方便、成本低，常用于血清型的檢測，但是速度慢、敏感度較低。

2.2.2 "間接免疫熒光試驗 "間接免疫熒光試驗（Indirect Immunofluorescence assay，IFA）是將熒光染料與抗體相連，與樣品中相應的抗原結合形成熒光標記的抗原抗體復合物，可用熒光顯微鏡觀察進行定性和定位。國紀壘[20]成功制備出FAV-I不同血清型的兔抗I群FAdV-1 IgG，并建立了間接免疫熒光快速檢測FAdV-I的方法。羅乃杰等[21]制備了雞抗FADV-4陽性血清，通過間接免疫熒光檢測FAdv-4。IFA檢測時間長，操作繁瑣，不適合大批量檢測。

2.2.3 "病毒中和試驗 "中和試驗（Neutralization test，NT）是將病毒和待檢測的血清在合適的條件下進行孵育，然后將其接種于易感宿主或細胞上，通過中和作用檢測對機體或細胞的保護作用，常被應用于血清型診斷等方面。中和試驗有兩種方法，一種是固定病毒稀釋血清法，另一種是固定血清稀釋病毒法。Mu Y等[22]采用中和試驗檢測接種重組病毒FAdV4-RFP_F1前、接種21 d后的雞血清，結果顯示感染FAdV4-RFP_F1重組病毒21 d后的雞可以產生高水平的中和抗體，平均滴度約為7.4log2，而在對照組中無法檢測到中和抗體。Guo Y等[23]使用表達EGFP-fiber-2融合蛋白的重組病毒FA4-EGFP來開發檢測感染或接種后FAdV-4特異性中和抗體（NAbs）的滴度，它簡化了NAbs的檢測過程，可以快速檢測疫苗接種后的免疫狀態，并且可以節省資金。

2.2.4 "酶聯免疫吸附試驗 "酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一種在聚苯乙烯等固相載體上與可溶性抗原或抗體偶聯，與特殊標記物結合，實現對抗原或抗體的定性或者定量分析的檢測技術。常見ELISA檢測方法可分為間接ELISA、夾心ELISA和競爭ELISA；根據檢測目的分為檢測抗原的ELISA和檢測抗體的ELISA。ELISA相比間接免疫熒光試驗、中和試驗更敏感、更快速。目前已有針對純化的病毒粒子作為包被抗原來檢測抗體的研究，Qing Pan等[24]使用高純度和高濃度的FAdV-4病毒粒子，建立了可以檢測12種血清型的抗體的通用ELISA方法。也有研究構建重組蛋白作為抗原包被的，Xie S等[25]用FAdV-4的22K非結構蛋白的66～88aa區作為包被抗原，建立了能有效區別感染FAdV-4后的雞和接種疫苗的雞。

2.2.5 "膠體金檢測方法 "膠體金（Immune colloidal gold technique，GICT）是一種常用的標記技術，膠體金能夠利用抗原抗體特異性結合，使標記物在相應位置大量聚集，能夠通過肉眼進行觀察。該檢測方法具有操作簡便、時間短、效率高等優點，但靈敏度較差且無法進行定量。Xie等[26]采用兩種單克隆抗體對抗FAdV-4的Fiber2，開發了可以用于檢測FAdV-4的快速膠體金試紙條，其檢測限可低至0.1 μg/0.1 mL GST-Fiber-2蛋白和1×105TCID50/0.1 mL 的 FAdV-4；劉娜等[27]通過其制備的抗六鄰體蛋白1D3和3C2抗體作為檢測抗體和標記抗體，制備了檢測FAdV-4的膠體金免疫層析試紙，具備良好的穩定性、敏感性和特異性。

2.3 "分子生物學方法

目前主要通過聚合酶鏈反應、實時熒光定量PCR、環介導等溫擴增技術、核酸探針法等分子生物學檢測方法進行檢測禽腺病毒。它們的優缺點以及應用范圍，見表3。

2.3.1 "PCR技術 "聚合酶鏈式反應（Polymer Chain Reaction，PCR）是在體外進行已知基因擴增的一種方法。PCR主要包括三個基本的反應：變性、退火、延伸。肖躍強等[28]針對FAdV-1的保守區域基因進行分析，建立了FAdV-1通用PCR檢測方法，檢測限為2.8×10 2 拷貝/μL。PCR技術具有檢測快、靈敏度較高、準確等優點，但對檢測環境要求較高，并且敏感性有限。PCR可與其他方法結合建立檢測方法，以提高PCR檢測的靈敏度。王利麗等[29]針對FAdV-4的Penton基因序列，建立了檢測FAdV-4的納米PCR方法，FAdV-4 的最低檢測限為54.0 拷貝/μL，靈敏度比普通PCR高10倍。Hou L等[30]通過結合PCR和斑點雜交，建立了檢測FAdV的方法，有效提高了靈敏度，是常規PCR的100倍。

2.3.2 "實時熒光定量PCR "實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）是在PCR基礎上添加熒光標記的染料或探針，對PCR產物進行標記追蹤的檢測方法。qPCR相對于普通PCR更敏感、特異性更強。盧清俠等[31]通過對FAdV-4 Hexon 的基因序列進行分析，針對其保守區域設計引物，構建了SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法，最低檢測限為7.1×102拷貝/μL，與常規PCR相比，縮短了檢測時間，靈敏度提高。Pan Q[32]針對FAdV-4 Hexon L1區域建立探針實時熒光定量檢測方法，與常規PCR相比靈敏度更高[32]。RT-qPCR技術特異性強、準確性高，但成本高。

2.3.3 "環介導等溫核酸擴增技術 "環介導等溫核酸擴增技術（LOOP-mediated isothermal amplification，LAMP）是以待測樣品核酸為模板，針對目的基因的六個區域設計四條引物，利用Bst-DNA聚合酶在恒溫條件下即可進行擴增，可以通過肉眼觀察目的基因是否存在（焦磷酸鎂白色沉淀）或加入核酸染料觀察是否有綠色熒光。薛曉巖等[33]針對FAdV-4 Hexon基因高度保守的區域設計 LAMP 引物，并對反應體系和反應條件進行優化，建立了針對禽腺病毒4型環介導等溫核酸擴增的檢測方法，可以檢測DNA最低限為7.5×10-8 ng/μL，靈敏度較常規 PCR提高了100倍；Qing Fan等[34]根據ChPV NS、CIAL VP1和FAdV-4 Hexon基因的保守區域設計了三個引物組和復合探針，其復合探針用不同熒光基團進行標記，建立了基于多重熒光的環介導等溫擴增技術，與先前PCR檢測結果一致。LAMP具有操作簡便、耗時短、靈敏度高等優點，但其反應所需的引物復雜，而且容易產生氣溶膠污染，后續的基因測序難度也較大，還需進一步完善。

2.3.4 "核酸探針技術 "核酸探針技術是基于核苷酸堿基順序互補的原理，通過特異的基因探針（可以識別特異性堿基序列并且帶有標記的單鏈DNA或者RNA分子）與待測定的靶序列互補，從而實現對目標序列的定性或定量分析[35]。根據探針的不同，分為放射性探針和非放射性探針。核酸探針技術具有特異性強、靈敏度高、耗時短等優點，但具有存放時間短、穩定性小及放射性污染等缺點。侯力丹等[36]以12個血清型的I群FAdV參考毒株模板合成了12種Digoxigenin標記核酸探針，并進行了核酸斑點雜交檢測，發現其具備較高的靈敏度。

3 "禽腺病毒疫苗

禽腺病毒疫苗主要包括全病毒滅活疫苗、弱毒活疫苗、亞單位疫苗、基因疫苗等。I亞群禽腺病毒疫苗優缺點及其應用見表4。

3.1 "全病毒滅活疫苗

全病毒滅活疫苗是指將培養的病毒進行加熱或使用化學試劑（通常使用β-丙內酯或福爾馬林）使病毒失活制成的疫苗。疾病暴發后使用感染病毒的雞肝臟勻漿制作的滅活疫苗，能有效控制疫情的發展。有研究發現15～18日齡進行一次免疫接種或10日齡首次免疫，21日齡加強免疫，可以獲得很好的保護作用。Afzal M等[37]對10～12 日齡的雞群使用感染禽類的肝臟制成的疫苗單次免疫，結果表明接種疫苗雞群的死亡率比未接種的死亡率低，同樣疫情時接種疫苗的雞群比未接種的死亡率低；Chandra R等[38]通過給10～15日齡的禽類皮下注射感染禽類肝臟制備的疫苗（0.25 mL/羽）或滅活細胞培養的疫苗（10 3.5 LD 50 /羽），在疫情暴發時降低了死亡率[38]。

肝臟勻漿滅活疫苗雖然能夠防治病毒感染，但是使用肝臟勻漿容易混雜或引發細菌及其它污染，并且疫苗中抗原含量不一，其免疫效果不穩定。有研究表明，細胞培養系統和SPF雞具有嚴格的生物安全性和較高的衛生標準，是開發滅活疫苗的更好選擇。Pan Q等[39]用甲醛對新型基因型的毒株滅活處理，開發了一種新型基因型FAdV-4油乳劑滅活疫苗，免疫SPF雞可以產生高水平的抗體，為感染新基因型的FAdV-4提供了全面的保護。

3.2 "弱毒活疫苗

弱毒活疫苗是通過物理、化學或生物手段對病毒進行多次傳代，使其毒力減弱，但保留了較好的免疫原性和遺傳特性，可用于疫苗研制。與肝組織勻漿滅活苗相比，該疫苗具有較強的免疫保護作用，損傷更小，效果更好。MansoorM K等[40]開發了一種針對HPS的弱毒疫苗，用第16代HSV弱毒疫苗或商業化肝勻漿滅活疫苗免疫14日齡、無HSV（單純皰疹病毒）母源抗體的肉雞，免疫后24 d，弱毒疫苗組肉雞獲得了94.73%的保護，而肝臟勻漿滅活疫苗組肉雞獲得55%的保護，結果說明弱毒疫苗對雞群保護效果更好。Quan Xie等[41]針對重組病毒FA4-EGFP制備的弱毒活疫苗，對于FAdV-4致死攻擊提供了有效的保護，與滅活疫苗相比更早產生了高滴度的中和抗體[41]。雖然弱毒疫苗免疫效果良好，但是可能會面臨毒株毒力返強、強毒株重組的危險，并且在生產過程中，有些毒株毒力強，可能造成生物安全隱患。

3.3 "亞單位疫苗

滅活疫苗和弱毒疫苗盡管可以有效預防病毒的感染，但是存在病毒滅活不充分、毒株毒力返強、強毒株重組的危險等，基因工程亞單位疫苗的優勢在于它可以消除這些危險，無病毒核酸，無致病性且不需要滅活，安全性能更高。亞單位疫苗是從病毒、細菌中分離出的特定蛋白，采用化學分解或控制蛋白質水解的方式，從中篩選出具有一定免疫作用的片段，從而制成疫苗。Hexon、Penton和Fiber都是禽腺病毒的重要結構蛋白，Wang X等[42]選擇FAdV-4的衣殼蛋白Fiber 1、Fiber 2、五鄰體蛋白和六鄰體蛋白在大腸桿菌或桿狀病毒表達體系中進行表達，不同劑量接種，比較其免疫保護效果，結果發現Fiber 2免疫保護效果最佳，當疫苗劑量增加時保護作用增強。袁楓等[43]通過畢赤酵母表達FAdV-4 Fiber2蛋白制備的亞單位疫苗免疫21日齡SPF雞，發現對FAdV-4強毒株GD616產生100%的保護[43]。雖然亞單位疫苗能夠彌補滅活疫苗和弱毒疫苗的缺點，也能夠產生良好的免疫保護，但是蛋白表達和純化比較復雜，其抗原性受到所選的表達系統影響，在大規模生產時會受到限制。

3.4 "基因疫苗

基因疫苗也被稱為DNA疫苗，免疫應答是將一種外源性基因通過真核表達載體直接接種到動物體內，以激發機體的免疫反應，誘導特異性的體液免疫應答和細胞免疫應答。龐洪澤等[44]將FAdV-4的Hexon和Penton基因串聯，成功構建了原核表達質粒pET32a-HP，并制備成核酸疫苗，免疫7日齡和14日齡雛雞，發現其能夠誘導產生FAdV-4特異性抗體，抗體水平在免疫后28日齡最高，免疫劑量為100 μg較好。張曉歡等[45]將Fiber2與真核表達載體pcDNA3.1+進行連接，并且加入了雞細胞因子IL-2作為基因佐劑，成功構建了pcDNA3.1-Fiber2重組質粒、pcDNA3.2-IL2重組質粒和pcDNA3.1-Fiber2IL2融合重組質粒，對14日齡SPF雞進行免疫，結果表明均能誘導機體產生FAdV-4抗體，對機體產生保護，并且細胞因子IL-2能夠增強免疫效果。基因疫苗與傳統疫苗相比，具有無生產性感染風險、毒力不返強、生產成本低等優點。

3.5 "禽腺病毒卵黃抗體

卵黃抗體是禽類通過免疫適量特定抗原后產生的特異性抗體，具有敏感性好、特異性強、制備簡便和成本低等優點。卵黃抗體不僅可以用于治療，還可以用于預防。楊曉偉[46]制備的卵黃抗體，接種劑量0.3 mL/只，能對15日齡肉雞產生100%保護而不發??；按照0.8 mL/只和1 mL/只注射病雞，治愈率分別為86.7%和96.7%。魏若瑤等[47]使用禽腺病毒三價油乳劑滅活疫苗接種蛋雞，研制出一種防治FAdV-2、FAdV-4和FAdV-8b的卵黃抗體；杜東穎等[48]通過誘導FAdV-4的Fiber2蛋白的表達、純化后制備免疫原，免疫產蛋雞獲得卵黃抗體，將其接種SPF雞進行免疫效果評估，結果表明接種7 d后對感染4型禽腺病毒的雞群產生90%～100%的保護。

4 "展望

隨著I 亞群FAdV流行趨勢的逐漸擴大，它對禽類成活率以及養殖經濟效益產生很大的影響。FAdV血清型眾多且彼此之間交叉保護性弱，導致其廣泛傳播，未來在多血清型FAdV檢測技術、預防多種血清型高效價的FAdV滅活疫苗、基因工程疫苗以及卵黃抗體等相關有潛力的控制策略上需加大研發力度，為有效防控FAdV提供可靠的保障。

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Current Status and Research Progress of Fowl Adenovirus Group I

Xiao Yaqing1，2， Dong Wenwen2， Yuan Xiaoyuan2， Li Guiming2， Liu Mingchao1 " " ， Meng Kai2

（1.School of Agricultural University of Hebei animal medicine，Baoding "071000，China;

2.Poultry Institute;Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan "250100，China）

Abstract： In recent years， fowl adenovirus "group I "has been reported in many places， and its propagation speed and range are on the rise， causing huge losses to the global poultry industry. In this paper， the overview， detection methods and vaccine research of avian adenovirus were reviewed in order to provide reference for the poultry industry on the disease.

Keywords： Fowl Adenovirus Group I; Epidemiology; Detection method;Vaccine