雞傳染性法氏囊病毒接種雞胚成纖維細胞工藝優化

摘 要：雞傳染性法氏囊病是一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害幼齡雞。傳染性法氏囊病滅活疫苗通常采用強毒接種雞胚成纖維細胞（CEF）進行病毒的培養。本試驗采用細胞培養轉瓶培養CEF方法接種病毒對轉瓶內細胞接種密度、種毒接種量及收獲病毒時間進行了優化，篩選出傳染性法氏囊病毒培養的最佳工藝參數（轉瓶），為擴大生產穩定的雞傳染性法氏囊病滅活疫苗奠定了基礎。

關鍵詞：雞傳染性法氏囊病毒；雞胚成纖維細胞；工藝優化

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：B 文章編號：1673-1085（2024）07-0031-04

傳染性法氏囊病（IBD）是一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害幼齡雞。本病主要水平傳播，突然發生，傳播迅速。2周齡以內的幼雞感染后，能引起嚴重的免疫抑制，常誘發繼發感染。近年來流行的雞傳染性法氏囊病，超強病毒株致死率高達70%左右，給家禽養殖業帶來重大經濟損失[1]。

滅活疫苗具有良好的安全性，選擇當地流行毒株可以更好地預防本地流行的雞傳染性法氏囊病[2]。目前，制備雞傳染性法氏囊病滅活疫苗的毒株通常為弱毒株或強毒株，采用雞胚、CEF或傳代細胞系（DF?1等）進行病毒培養，收獲的病毒滅活后，與一定比例的佐劑混合制備成滅活疫苗[3-4]。實際生產中，細胞工藝需要使用大量的SPF雞胚，費用較高。為降低疫苗成本，現對傳染性法氏囊病毒（IBDV）生產工藝進行優化，以提高病毒含量。本試驗通過對接種細胞密度、接種劑量和病毒收獲時間進行了優化，篩選出制備IBDV的最佳生產工藝，不僅節約了生產成本，還提高了IBDV的病毒含量。

1 "材料與方法

1.1 "材料

M199、胰酶，購于Gibco公司；青鏈霉素，購于魯抗公司；新生牛血清，購于內蒙古奧普賽；一次性塑料細胞培養轉瓶，購自BIOFIL公司；SPF雞胚，購自勃林格；種毒IBDV-B株F5代，山東博瑞科生物技術有限公司分離鑒定。

1.2 "方法

1.2.1 "雞胚成纖維細胞（CEF）的制備[5] "選擇10～11日齡發育良好的SPF雞胚，蛋殼外表面碘伏噴灑消毒，然后75%酒精進行脫碘消毒，彎頭鑷子挑破氣室內膜，無菌取出雞胚，置于盛有PBS溶液的平皿中，仔細去除頭部和內臟，將胚體移入100 mL小燒杯中，加適量PBS，洗滌胚體2次，盡量去除血細胞，棄去上清液。大剪刀將胚體剪成米粒大小（約1～2 mm）的均勻組織塊， PBS溶液沖洗胚體2次后，將剪碎的組織塊轉移至250 mL三角瓶中，加入0.25%胰酶溶液（約10 mL/胚），置37 ℃水浴中消化30 min，每5 min搖一次。取出三角燒瓶，棄去上清胰酶溶液，直接加PBS溶液洗滌消化后的組織塊2次，每次洗滌后均棄去上清液，保留剪碎后的組織塊。三角燒瓶中加入適量細胞生長液終止消化，反復吹打數次， 12層紗布濾過；再用適量生長液重懸，反復吹打數次，紗布過濾，混勻細胞懸液，取細胞液200 L，細胞計數。按細胞計數結果，進行適當倍數的稀釋。

1.2.2 "最佳接種細胞密度的優化 "見表1將制備的原代雞胚成纖維細胞（CEF）分別按150萬、200萬、250萬/mL分別接種1 000 mL細胞轉瓶，每瓶接種150 mL細胞液，24 h后長成單層。病毒做1 000倍稀釋后，接種種毒IBDV-B株病毒液9 mL（接毒比例為細胞培養液的6%）。37 ℃，繼續培養72～96 h，每天觀察細胞病變，待細胞病變達80%以上時收獲病毒液。將收獲的病毒液-20 ℃保存，并反復凍融3次，離心取上清液，檢測TCID50。

1.2.3 "最佳種毒接種量的優化 "見表2制備的原代雞胚成纖維細胞（CEF）按照200萬/mL的接種密度分別接種3個轉瓶，每瓶接種150 mL細胞液，24 h后，長成單層。毒種做1 000稀釋后，分別接種IBDV-B株病毒液9 mL（6%）、12 mL（8%）和15 mL（10%）。37 ℃，繼續培養72～96 h，每天觀察細胞病變，待細胞病變達80%以上時收獲病毒液。-20 ℃反復凍融3次，離心取上清液，檢測TCID50。

1.2.4 "最佳收獲時間的優化 "見表3制備的原代雞胚成纖維細胞（CEF）按200萬/mL分別接種3個轉瓶，每瓶接種150 mL細胞液，24 h后，長成單層。接種IBDV-B株病毒液，1000倍稀釋后，接種比例8%，每瓶接種12 mL病毒液。37 ℃，繼續培養48h 、60 h和72 h，收獲病毒液。-20 ℃反復凍融3次，離心取上清液，檢測TCID50。

2 "結果

2.1 "雞胚成纖維細胞制備

共制備原代雞胚成纖維細胞（CEF）1 000 mL，細胞密度為1 000萬/mL。

2.2 "最佳接種細胞密度的優化

接種細胞密度分別為每毫升150萬、200萬、250萬，種毒IBDV-B株接種3個轉瓶，培養72 h，病變達80%以上收獲。3瓶病毒液無菌檢驗均符合標準，TCID50測定結果分別為105.78、106.5、106.17，結果見表4。

由表4可見，不是細胞密度越密越好，過高的細胞密度，除了需要接種更多的毒種之外，也可能會產生細胞高密度效應反而抑制病毒生長[6]，因此需要根據毒種的效價及收獲時間優化適宜的細胞接種密度。本次試驗結果表明，最佳接種細胞密度是200萬/mL。

2.3 "最佳種毒接種量的優化

制備雞胚成纖維細胞液450 mL，細胞接種密度為200萬/mL，150 mL/瓶，分裝3個轉瓶。種毒IBDV-B株接種3個轉瓶，接毒劑量分別為9、12 、15 mL，培養72 h，病變達80%以上收獲。3瓶病毒液無菌檢驗均符合標準，TCID50測定結果分別為106.32、106.63、106.17，結果見表5。

由表5可知，不同的種毒接種量對細胞病變的產生有直接影響[7]。當接毒量較小時，病毒達到繁殖高峰的時間延長，細胞整體狀態下降，反而不利于病毒增殖，很難出現高毒價。接毒量大了，細胞病變時間提前，病毒增殖快，細胞圓縮脫落，待收獲時，病毒死亡較多，所以毒價較低[8]。本次試驗結果表明，IBDV的最佳種毒接種量是將毒種1 000倍稀釋后，按培養液8%的劑量接種到雞胚成纖維細胞上。

2.4 "最佳收獲時間的優化

制備雞胚成纖維細胞液450 mL，細胞接種密度為200萬/mL，150 mL/瓶，分裝3個轉瓶。種毒IBDV-B株接種3個轉瓶，接毒劑量為12 mL，分別培養48 、72 h和96 h收獲。3瓶病毒液無菌檢驗均符合標準，TCID50測定結果分別為106.17、106.83、105.83，結果見表6。

由表6的試驗結果可見，種毒接種單層細胞48 h后產生明顯病變，細胞圓縮脫落；60 h時細胞達到80％以上病變，病毒效價最高；72 h時大量細胞從細胞瓶壁脫落，病毒感染后的細胞呈拉網狀，病毒效價下降迅速。上述試驗結果與張振華等[7]報道的一致。

3 "結論

雞傳染性法氏囊病毒（IBDV）可在雞胚成纖維細胞上傳代擴繁，本試驗從接種細胞密度、種毒接種量和收獲時間3個方面進行了工藝優化。試驗結果顯示，種毒IBDV-B株接種雞胚成纖維細胞，轉瓶培養的最佳生產工藝為接種細胞密度為200萬/mL、接種量為毒種1 000倍稀釋后培養液的8%、收獲時間為60 h、細胞病變80%以上，收獲的病毒液中病毒含量最高。

參考文獻：

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